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生物技术通报
B IO TECHNOLOGY　BULL ETIN 2009年第 12期
有机复合物 H对纤维素酶促反应动力学特性的影响
李鸿玉 厉重先
(北京联合大学师范学院 ,北京 100011)
　　摘 　要 : 　采用 3, 52二硝基水杨酸 (DNS)为显色剂 ,滤纸和 CMC为底物 ,测定纤维素酶的酶活。考察了在不同温度、pH
值、反应时间、底物浓度等反应条件下 ,有机复合物 H对纤维素酶滤纸酶活 ( FPA)和 CMC酶活 (CMCA)的影响。结果表明 ,有
机复合物 H对纤维素酶的 FPA活性和 CMCA活性均有一定的促进作用 ,且在不同条件下的促进效果有较大差异。
关键词 : 　纤维素酶 有机复合物 H 滤纸 CMC
Effect of Composite Organ ic Compounds H on Dynam ics
Character istic of the Cellulase Cata lyze
L i Hongyu L i Chongxian
( Teacher ’s College of B eijing Union University, B eijing 100011)
　　Abs trac t: 　The test of the activity of cellulase was measured with 3, 52dinitrosalicylic acid (DNS) as reagent, filter paper and
CMC as the substrate1 The effect of composite organic compounds H to FPA and CMC cellulose activity was investigated in different
temperature, pH, reaction time and the concentration of the substrate material1 The results indicated that composite organic compounds
H can distinctly p romote the activity of CMC and FPA, and the difference varied according to the conditions1
Key wo rds: 　Cellulase Composite　O rganic Compounds H　Filter paper　CMC
收稿日期 : 2009209209
作者简介 :李鸿玉 (19562) ,女 ,北京人 ,副教授 ,研究方向 :化学 ,应用酶学 ; E2mail: sfthongyu@ buu1edu1cn
　　纤维素是自然界中最丰富、廉价的可再生性碳
源物质。通过纤维素酶的水解催化作用将纤维素转
化为葡萄糖是纤维素利用的有效途径之一。纤维素
酶的催化作用是由内切β21, 4葡聚糖酶 (C1酶 )、外
切β21, 4葡聚糖水解酶 (Cx酶 )和β2葡萄糖苷酶协
同作用完成 [ 1 ]。滤纸是聚合度和结晶度都居“中
等 ”的纤维性材料 ,以其为底物经纤维素酶水解后
生成的还原糖的量表征纤维素酶系总的糖化能力 ,
它反映了 3类酶组分的协同作用 ,统称滤纸酶活
( FPA )。而以羧甲基纤维素钠为底物来测量酶活 ,主
要体现的是 Cx酶的活力 ,称为 CMC酶活 (CMCA) [2 ]。
本研究分别以滤纸和 CMC (羧甲基纤维素钠 )
为底物 ,通过对酶活力的测定考察有机复合物 H
(以下称促进剂 )对纤维素酶促反应的影响。分别
考察温度、pH值、底物浓度、反应时间等因素与酶活
的关系 ,并在此基础上测定加入促进剂后各反应体
系的纤维素酶活 ,由此考查促进剂对不同温度、pH
值、底物浓度、反应时间等反应条件下的纤维素酶解
反应速度产生的影响。
1　材料与方法
1. 1　材料与试剂
纤维素酶 (诺维信公司提供 ) ;无水葡萄糖、醋
酸、醋酸钠、3, 52二硝基水杨酸 (DNS)、苯酚、氢氧化
钠、无水亚硫酸钠、酒石酸钾钠均为分析纯级 ;有机物
复合物 H;北京新华 1号滤纸。
1. 2　主要仪器
离心机 ( LX3264201 型 ) ; 恒温水浴振荡器
( SHY22A型 ) ;分光光度计 ( 721型 ) ; 烘箱 (DS2206
电热鼓风干烘箱 ) ; pH计 ( PHS225型 ) 。
1. 3　主要试剂的配制
1. 3. 1 醋酸 2醋酸钠缓冲液 012 mol/L醋酸溶液 　
取冰醋酸 12 m l,定容至 1 000 m l。012 mol/L醋酸
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钠溶液 :称取醋酸钠 2712 g,溶解定容至 1 000 m l。
取一定量上述两种溶液混合后用 pH计测定其 pH
值 ,得所需 pH值缓冲溶液。
1. 3. 2 3, 52二硝基水杨酸 (DNS)显色剂 　精称
61300 0 g DNS溶于 210 mol/L的 NaOH溶液 262 m l
中 ,加入酒石酸钾钠热溶液 (18210 g酒石酸钾钠定
容到 500 m l水中 )。再加入 510 g苯酚和 510 g无
水亚硫酸钠 ,搅拌溶解 ,冷却后 ,定容至 1 000 m l,处
于棕色瓶 ,置冰箱中备用 (72 h后即可使用 ) [ 3 ]。
1. 4 葡萄糖标准曲线的绘制
分别取浓度为 11000 0 g/L葡萄糖标准溶液 0、
012 ‰ 014 ‰ 016 ‰ 018 ‰ 110 m l,加 3 m l DNS,煮
沸 5 m in,冷却后 ,用蒸馏水定容至 2510 m l,以空白
为参比调零 ,用分光光度计在 530 nm 波长下测吸
光度。
1. 5 酶活测定方法
1. 5. 1　基本原理 底物经纤维素酶作用后 ,生成
还原糖 ,可与 3, 52二硝基水杨酸生成红色络合物 ,
用比色法测定还原糖的量 ,即可确定纤维素酶的
活力。
1. 5. 2 测定方法 CMC酶活 : 015 m l适当稀释的
酶液及 210 m l以醋酸 2醋酸钠缓冲溶液配制的 1%
浓度的 CMC,一定温度下恒温水浴振荡 30 m in,加
入 3 m l DNS,煮沸 5 m in,冷却后 ,定容至 2510 m l,
530 nm处测吸光度。空白试验是将上述方法中的
酶液改在加显色剂之后加入 ,其他操作同上。
滤纸酶活 : 012 m l适当稀释的酶液及 118 m l醋
酸 2醋酸钠缓冲溶液 ,投入一张 1 cm ×3 cm滤纸 ,一
定温度下恒温水浴振荡 1 h,加入 3 m l DNS,煮沸 5
m in,冷却 ,定容至 2510 m l,静置 15 m in, 530 nm处
测吸光度。空白同上。
加促进剂的酶活测定方法是将上述方法中
CMC溶液改为 1111%浓度 118 m l,或缓冲溶液体积
由 118 m l减为 116 m l,并加入 012 m l促进剂溶液。
以 012 m l蒸馏水代替促进剂溶液为空白。
1. 5. 3　酶活计算 以每毫升酶液 1 m in产生 1 mg
葡萄糖为 1个酶活力单位计算相对酶活 :
相对酶活 (mg/ (m in ×m l) ) = B ×A / ( t ×W )
　　式中 A为由标准曲线查出的还原糖量 (mg) ; B
为酶的稀释倍数 ; t为酶解时间 (m in) ; W 为反应体
系中稀释酶液的体积 (m l)。
2 结果与分析
2. 1 葡萄糖标准曲线的绘制
　　按 114方法 ,由测得数据 (表 1)作葡萄糖标准
曲线或将吸光度值与葡萄糖含量做线性回归。回
归方程为 y = 018025x - 010843;回归系数 R2 =
01999 3。
表 1 葡萄糖标准曲线数据表
组别 1 2 3 4 5
含糖量 (mg) 012 014 016 018 110
吸光度 01070 01245 01401 01550 01720
2. 2 酶最适稀释倍数的确定
将纤维素酶液按以一定稀释倍数分别稀释 ,
在 pH510,温度为 50℃条件下 ,测定吸光度 ,随着
酶液稀释倍数的增大 ,反应液吸光度数值减小 ,即
酶促反应产生的还原糖的量逐渐减少。在吸光度
数值的最佳观察范围 ( 011～014 )内 ,确定以滤纸
为底物时酶液的最适稀释倍数为 200、以 CMC为
底物时酶液的最适稀释倍数为 2 000。
2. 3 促进剂浓度对酶活的影响
在温度为 50℃, pH510的条件下 ,分别考察终
浓度为 1 ×10 - 4、1 ×10 - 5、1 ×10 - 6、1 ×10 - 7、1 ×
10 - 8 (单位 : g /L )的促进剂对纤维素滤纸酶活和
CMC酶活的影响。测定酶活并计算酶活提高百分
率。结果见表 2,图 1、图 2。结果表明 ,促进剂在 1
×10 - 4到 1 ×10 - 8浓度范围内对纤维素滤纸酶活
和 CMC酶活均有不同程度的促进作用 ;对于滤纸
和 CMC两种底物 ,促进剂表现出最大促进效果的
浓度均为 1 ×10 - 6 ,酶活提高率分别为 2610%
和 2218%。
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表 2 促进剂对纤维素酶活力的影响
编号 1 2 3 4 5 6
促进剂浓度 ( g /L) 0 1 ×10 - 4 1 ×10 - 5 1 ×10 - 6 1 ×10 - 7 1 ×10 - 8
滤纸酶活 (mg/ (m in ×m l) ) 7134 8154 8163 9125 8125 8123
滤纸酶活提高率 ( % ) 1613 1716 2610 1214 1211
CMC酶活 (mg/ (m in ×m l) ) 5019 5111 5610 6215 5915 5519
CMC酶活提高率 ( % ) 01393 1010 2218 1619 9182
2. 4 不同 pH值反应条件下促进剂对酶活的影响
采用不同 pH的缓冲溶液 ,水浴 50℃,按 11512
法分别测定各不同 pH条件下的纤维素滤纸酶活和
CMC酶活。同时考察各 pH条件下 ,促进剂浓度为
1 ×10 - 6时反应体系的酶活。结果见图 3、图 4。
结果表明 ,在弱酸性条件下 ,纤维素酶有较强
的活性。在醋酸 —醋酸钠缓冲体系中 ,纤维素酶
在 pH为 510左右 , FPA活性达到最大值 ,在 pH值
为 512左右有较高的 CMCA活性。 在所考察的 pH范围内 ,促进剂对于纤维素滤纸活性、CMCA活性均有不同程度促进作用 ,无论滤纸还是 CMC底物 ,促进剂对酶的影响情况基本相同 ,且在酶的最适 pH附近 ,酶活增长值最大 , pH为415处滤纸酶活提高率达 2219% ; pH 值为 512时CMC酶活提高率达 2112%。促进剂没有改变酶的最适 pH,但在加入促进剂后 ,对于滤纸底物 ,酶促反应的 pH在 417～513范围内可达到未加促进剂时反应最适 pH为 5时所达到的还原糖量 ;对于 CMC底物 ,酶促反应的 pH值在 510～515范围内可达到
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未加促进剂时反应最适 pH值为 512时所达到的还
原糖量。
pH对酶促反应的影响十分复杂 ,主要影响酶分
子活性中心上有关基团的解离、底物的解离 ,以至影
响酶与底物的结合。另外 , pH值过高过低均可引起
酶蛋白变性失活。结果显示 ,促进剂对酶的影响与
pH值有关。其作用机理有待进一步研究。
2. 5 不同反应温度下促进剂 H对酶活的影响
对于滤纸和 CMC底物 ,在酶的最适 pH下 ,以
11512法 ,分别测定 40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、
65℃温度条件的酶活。同时测定在上述各温度条件
下 ,促进剂浓度为 1 ×10 - 6时体系的酶活 ,考察促进
剂在不同温度条件下对酶活的影响。结果见图 5,
图 6。结果显示 ,温度对酶活有很大影响。该纤维
素酶在 45～55℃之间表现出较高的 FPA活性 ,最适
温度为 50℃;在 50～60℃之间表现出较高的 CMC
酶活 ,最适温度为 55℃。
促进剂对所考察的各温度下的 FPA活性、CMC
活性均有不同程度的促进作用 ,在 55℃附近酶活提
高率最大 , FPA 活性提高 2915% , CMC 活性提高
2112%。在以滤纸为底物时 ,促进剂使酶的最适温
度由原来的 50℃提高至 55℃。
随温度升高 ,一方面 ,酶促反应速度加大 ,另一
方面 ,酶蛋白逐渐变性 ,导致酶活降低。所以 ,温度
对酶促反应的影响是两方面共同作用的结果。可以
认为 ,促进剂不仅可以加大反应速度 ,提高酶活 ;对
酶的热稳定性也有一定提高 ,即增加了酶的耐热性。
2. 6 不同反应时间下促进剂 H对酶活的影响
对于滤纸和 CMC两种底物 ,分别在其最适 pH、
最适温度条件下 ,按 11512法进行不同反应时间下
的酶活测定 ,同时测定各反应时间下 ,含有促进剂浓
度为 1 ×10 - 6 g/L时体系的酶活 ,考察不同反应时间
下促进剂对酶活的影响 ,见图 7、图 8。
结果显示 ,在所考察的反应时间内 ,该反应体系
的酶活 ,即平均 1 m l酶液 1 m in生成的还原糖量随
反应时间的延长而增大 ,基本呈线性增长关系。
对于两种底物 ,促进剂对所考察的各反应时间
内的酶促反应均有促进作用 ,反应时间越长 ,促进效
果越明显 ,即酶活提高越大。加入促进剂后 , CMC
酶活和滤纸酶活的反应时间 —酶活直线的斜率均有
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所增大 ,其增大幅度 ,前者略大于后者。
2. 7 不同底物浓度下促进剂 H对酶活的影响
在酶的最适温度、最适 pH条件下 ,以 11512方
法 ,分别测定不同底物浓度下的滤纸酶活和 CMC酶
活。 CMC 底物浓度设为 012%、015%、017%、
110%、112% ;滤纸底物分别设为 1 cm ×1 cm、1 cm
×115 cm、1 cm ×2 cm、1 cm ×215 cm、1 cm ×3 cm。
同时在上述各底物浓度条件下 ,测定促进剂浓度为
1 ×10 - 6时体系的酶活。观察促进剂对酶促反应的
影响随底物浓度的变化 ,结果见图 9、图 10。
试验结果显示 ,随着体系底物浓度的增加 ,单位
时间所产生的还原糖量增大。CMC浓度在 012% ～
017%、滤纸在 1 cm ×1 cm～1 cm ×210 cm范围内 ,
反应速度随底物量的增加而很快地增加 ,接近成正
比 ,符合一级反应 ;当底物 CMC浓度达到 110%、滤
纸浓度大于 1 cm ×215 cm时 ,反应速率与底物浓度
几乎无关 ,酶活变化趋于平缓 ,达到最大反应速度 ,
酶解反应符合零级反应。
在所考察范围内 ,促进剂对滤纸和 CMC各不同
底物浓度的酶促反应均有促进作用。在底物浓度增
大到足以使酶充分作用 ,即在接近零级反应时 ,促进
剂的促进作用也达到最大效果。即促进剂使得酶促
反应的最大速度有了明显提高。
3 结论与讨论
对于滤纸和 CMC两种底物 ,纤维素酶的最适
pH和最适温度略有不同 ,以滤纸为底物时最适 pH
为 510,最适温度为 50℃;作用于 CMC底物时的最
适 pH约为 512,最适温度为 55℃。
在酶的最适反应条件下 ,浓度为 1 ×10 - 6 g/L
的促进剂 ,对滤纸酶活和 CMC酶活均有较大幅度的
促进作用 ,滤纸酶活提高率为 2610% ; CMC酶活提
高率为 2218%。
促进剂对酶活的影响与反应体系的 pH值、温
度均有关系 ,在所考察的 pH值、温度范围内 ,促进
剂使得酶活均有不同程度提高 ,但在酶的最适 pH
值、最适温度附近 ,酶活提高幅度更大。促进剂没有
改变酶的最适 pH,以滤纸为底物时 ,促进剂使酶的
最适温度由原来的 50℃提高至 55℃,提高了酶的耐
热性。
在所考察的反应时间范围内 ,促进剂使得滤纸
酶活和 CMC酶活均有不同程度提高 ,且随着反应时
间的延长 ,酶活提高值越大。促进剂对不同底物浓
度的酶促反应均有促进作用 ,随着底物浓度的增大 ,
作用越显著 ,在接近零级反应时 ,促进剂的促进作用
也达到最大效果。
参 考 文 献
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