全 文 ：·技术与方法·
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2010 年第 6 期
猪流感的诊断技术研究进展
李国娟1，2 柳纪省1 李宝玉1 田永强2
(1中国农业科学院兰州兽医研究所 家畜疫病病原生物学国家重点实验室 农业部畜禽
病毒学重点开放实验室 农业部草食动物疫病重点开放实验室，兰州 730046;
2兰州交通大学化工学院，兰州 730070)
摘 要: 猪流感是由猪流感病毒引起的一种猪的急性、高度接触性呼吸道传染病，不仅给畜禽养殖造成重大经济损失，
而且还对人类健康造成威胁，因此快速、敏感、准确诊断猪流感，具有重要的经济价值和公共卫生意义。从传统的实验室诊断
技术和分子生物学诊断技术两方面综合阐述了猪流感的诊断研究进展。
关键词: 猪流感 诊断技术 研究进展
Current Progress on Diagnostic Technique of Swine Influenza
Li Guojuan1，2 Liu Jixing1 Li Baoyu1 Tian Yongqiang2
(1Key Laboratory of Animal Virology of Ministry of Agriculture，State Key Laboratory of Veterinary Etiological
Biology，Lanzhou Veterinary Research Institute，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Lanzhou 730046;
2College of Chemical and Biological Engineering，Lanzhou Jiaotong University，Lanzhou 730070)
Abstract: Swine flu is an acute respiratory infection，caused by influenza，not only causes great economic losses，but also to hu-
man health threats，is important to find fast，sensitive and accurate diagnosis of swine flu. This paper reviewed the traditional laboratory
diagnosis technology and molecular diagnosis technology.
Key words: Swine influenza Diagnostic techniques Research progress
收稿日期:2010-02-02
基金项目:重大基础研究“973”前期研究专项(2004CCA00500) ，国家“863”项目(2006AA10A204)
作者简介:李国娟，女，在读硕士，研究方向:微生物学;E-mail:guojuan1023@ 163. com
通讯作者:柳纪省，E-mail:liujixing@ hotmail. com
猪流感(swine influenza，SI)是由正粘病毒科 A
型猪流感病毒(swine influenza virus，SIV)属引起的
一种猪的急性、高度接触性呼吸道传染病，以突发、
咳嗽、呼吸困难、衰竭、迅速康复或死亡为特征;各种
年龄、性别和品种猪均能感染，发病率高，恢复缓慢，
阻碍增重，降低料肉比，直接影响猪群健康状态和质
量，是规模化养猪场普遍存在且难以根除的猪群发
性疾病之一，对养猪业危害极大。自 1918 年首次报
道猪流感以来，迄今为止，欧、美、非、亚、澳等世界各
大洲均有猪流感的发生和流行。迄今已发现的 A
型 SIV 有 H1N1，H1N2，H1N7，H2N3，H3N1，H3N2，
H3N3，H3N6，H4N6，H5N1 和 H9N2 等 11 种不同亚
型。我国流行的猪流感亚型主要有类人型 H3N2，
古典猪 H1N1 和类禽型 H1N1 三种。H1N1 病毒是
1930 年在美国首次分离出来的，2009 年 3 月在墨西
哥、美国等地暴发的甲型 H1N1 流感病毒，是一种新
型的变异病毒株，这种新型流感病毒具有病毒杂交
特性，它包含人流感病毒、禽流感病毒和猪流感病毒
的基因片段，同时拥有亚洲猪流感和非洲猪流感病
毒特征。猪流感不仅给畜禽养殖造成重大经济损
失，而且还对人类健康造成威胁，因此快速、敏感、准
确诊断猪流感，具有重要的经济价值和公共卫生
意义。
1 传统的诊断技术
1 1 电镜技术
通过电镜技术，观察 SIV 的病毒粒子，呈椭圆
形，棒状和圆形，直径约为 80 － 120 nm。虽然电镜
技术直接、客观，但是对病毒滴度不仅要求高，设备
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2010 年第 6 期
昂贵，而且需要熟练的技术操作人员，故临床检测价
值较低。
1 2 病毒分离和鉴定
从待检病料样品中分离和培养 SIV在检测宿主
范围和致病机理的研究及疫苗生产等方面都很重
要。猪流感病毒可在鸡胚和培养细胞中增殖，由于
鸡胚中增殖敏感性高，通常被称为 SI 诊断的“金标
准”［1］。王连想等［2］在 2003 年报道分离了猪流感
病毒广东株并鉴定其为 H1N1 亚型毒株;许传田
等［3］在 2004 年报道从山东各地疑似流感发病猪分
离并鉴定到 A型流感病毒 H9N2 亚型;李海燕等［4］
报道通过病毒分离和鉴定首次发现我国猪群已出现
H5N1 亚型流感病毒。
1 3 血清学诊断
常规亚型鉴定最实用的确诊方法是血清学诊断
技术，即红细胞凝集(hemagglutination，HA)试验，血
凝抑制(hemagglutination inhibition，HI)试验，神经氨
酸酶抑制(neuraminidase inhibition，NI)试验，中和试
验(serum neutralizationtest，SN) ，琼脂凝胶扩散试验
(ag argel immunodiffusion，AGID) ，免疫荧光法(im-
munofluores-cence assay，IFA) ，酶联免疫吸附试验
(enzymelinked immunosorbent assay，ELISA) ，免疫过
氧化酶单层细胞试验(immunoperoxidase monolayer
assay，IPMA) ，免疫组织化学(immunohistochemistry，
IHC)试验。
1 3 1 红细胞凝集(HA)试验 SI颗粒表面的 HA
蛋白具有识别并吸附红细胞表面受体的结构，同时，
HA蛋白的抗体与该蛋白受体的特异性结合能够干
扰 HA蛋白与红细胞受体的结合，基于这一原理，
DucaM等［5］在 1942 年建立了血凝试验(HA)和血
凝抑制试验(HI)。由于血凝试验方便、快捷、易于
操作，常用于检测培养物中的流感病毒。
1 3 2 血凝抑制(HI)试验 血凝抑制试验敏感、
特异，常用于甲型流感病毒亚型的鉴定和抗原变异
的分析，值得注意的是，许多动物血清中有非特异性
血凝因子，可能会有假阳性的出现，故通常用受体破
坏酶(receptor destroying enzyme，RDE)或高碘酸钠
法去除非特异性抑制因子。
1 3 3 神经氨酸酶抑制(NI)试验 NI 主要用于
流感病毒的表面抗原 NA 的亚型鉴定。1983 年，
Van Deuson等对常量 NI试验方法进行了改造，建立
了微量 NI试验方法，既降低了抗原用量，又可对多
种分离物同时进行抗原分类，为此，一直被世界卫生
组织推荐用于 NA亚型的分类。美国国立兽医实验
所已将微量 NI试验方法列为流感病毒分离物定型
及筛选畜禽血清亚型 NA抗体的常规方法［6］。
1 3 4 中和试验(SN) 用 SN 来鉴定或滴定 SIV
时，一般常选用对病毒敏感的组织培养细胞或鸡胚。
SN是较敏感、特异的血清学方法，但只有抗体与病
毒上的表面抗原相对应，特别是与吸附到宿主细胞
上的病毒表面抗原相对应时才能取得确切的试验结
果［7］。SN在研究应用中较广泛，但其操作繁琐、时
间长(一周左右) ，故很少用于临床进行疾病诊断。
但其作为经典方法在病毒分离鉴定中起重要的作
用，许多新的检测方法都要以其为标准方法进行比
较研究。
1 3 5 琼脂凝胶扩散(AGID)试验 AGID 是在琼
脂凝胶中进行的抗原抗体免疫沉淀反应，该技术简
便、快捷，而且比较保守，基本不发生变异。由于
SIV的不同亚型都具有型特异性抗原(NP蛋白) ，所
以可以用一种流感抗原或抗体对其所有抗体或抗原
进行检测。用标准抗原监测抗体时，标准抗原可以
是全病毒，也可以是基因产物。AGID 所用的抗原
和抗体的一种必须纯化，否则，易出现假阳性结果。
此外，AGID的敏感性较差，经改进的 AGID 免疫双
扩散试验，不仅提高了敏感性，而且快速省时［8］。
SIV的检测手段中，AGID 操作比较简单，结果容易
判定，但其敏感性和 HI试验一样偏低。国内已建立
了 AGP诊断技术及其诊断试剂盒。
1 3 6 免疫荧光法(IFA) IFA 的最大优点是稳
定、敏感性和特异性高，值得推广应用。早在 1961
年 IFA就开始用于人类流感的快速诊断，此后又有
很多学者用该方法检测流感病毒。用于猪流感诊断
的方法，有直接荧光抗体法和间接荧光抗体法，但多
用间接荧光抗体法。Onno 等［9］用基于 NP 单克隆
抗体的间接免疫荧光技术对试验感染猪鼻上皮细胞
中的抗原进行检测，特异性荧光出现在感染细胞的
细胞浆和细胞核内，结果表明该法与鸡胚分离病毒
一样敏感，并且能在数小时内快速得到诊断结果。
1 3 7 酶联免疫吸附试验(ELISA) ELISA 是目
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2010 年第 6 期 李国娟等:猪流感的诊断技术研究进展
前应用最广泛的病毒抗原及抗体的检测技术，已建
立了多种方法，如间接法、双抗体夹心法、捕获法和
生物素 －亲和素法等。早在 1974 年就用于流感病
毒的检测［10］，因其敏感性高，特异性强，操作简便，
肉眼可观察，便于大规模检测，适合于现场和基层使
用，被认为是近代血清学上革命性的新成果。
近年来，在传统 ELISA 方法的基础上，研究者
们对其做了进一步改进。Swenson等［11］应用膜酶免
疫试验和微孔膜免疫试验对流感病毒进行了检测;
Voeten等［12］应用重组流感病毒核蛋白作为抗原包
被 ELISA板，对流感患者进行特异性 IgA 及 IgG 抗
体检测，在感染后第 6 天，便可检测出特异性的
IgA，故其可以作为流感早期的血清学诊断方法之
一。亢文华等［13］建立了 PCR-ELISA 方法快速检测
高致病性禽流感病毒。
1 3 8 免疫过氧化酶单层细胞试验(IPMA) 该
技术用于检测猪血清中的 SIV抗体。其特点特异性
强，可检测出感染后 3 d的抗体效价。
1 3 9 免疫组织化学(IHC)试验 免疫荧光技术
和免疫组织化学试验的敏感性相近，但免疫组织化
学试验能用于尸检时固定良好，并且送检过程中没
丧失组织完整性的病料。SIV感染后 3 d，肺部细胞
感染的数量达到高峰，到第 5 天时许多病毒都已经
排出。Kwonil等(2005)也应用免疫组织化学试验
对 H1N2 亚型猪流感进行了确诊，证实韩国 2005 年
首次报道发生的 H1N2 亚型猪流感。
2 分子生物学诊断技术
由于以上传统的诊断方法操作繁琐，诊断时间
长，结果重复性不好，限制了传统方法在实际中的应
用，但是传统方法在病毒的初次分离和亚型鉴定中
还起着重要的作用。随着分子生物学的发展，应用
分子生物学诊断技术进行猪流感快速诊断和鉴定已
成为国内外研究猪流感的有效手段之一。分子诊断
技术具有特异性好、灵敏度高、针对性强、诊断快速
等优点。
2 1 聚合酶链式反应(PCR)
在许多实验室里已广泛应用 PCR 方法来检测
流感病毒，且检测的敏感度达到了 pg水平。PCR可
用来鉴定分离的病毒，也可直接用于临床病料的检
测，因此 PCR能对疾病作出早期诊断。因其技术具
有简便、快速、灵敏、特异性强等特点，故是生物学最
有价值的研究手段之一。针对 A 型流感病毒的诊
断，Atlnar(1996)建立了 RT-PCR方法。针对流感病
毒具有多种型和亚型的情况，Wright(1995)建立了
区分型和亚型的 PCR法。
近年来，一些基于不同靶基因的 RT-PCR 检测
方法在国外相继建立。Ellis 等［14］建立了检测和鉴
别不同物种 A型流感病毒的 RT-PCR异源双链核酸
分子迁移试验(RT-PCR heteroduplex mobility assay，
RT-PCR HMA) ，可早期识别动物流感和人流感的种
间传播。祈贤等［15］针对 SIV保守基因 NP建立了套
式 RT-PCR，用于猪流感的检测。Young等(2002)建
立了多重 RT-PCR 来检测和鉴别 H1 型和 H3 型猪
流感病毒，并且与血凝试验结果相符合，结果表明所
建立的多重 RT-PCR可用于检测临床样品中不同亚
型的猪流感。Jurgen 等(2004)建立了针对 A 型猪
流感病毒 Vl基因的实时 RT-PCR，用来检测和区别
H1 和 H3 亚型猪流感。与病毒分离相比，实时 RT-
PCR的敏感性为 94%，特异性为 85%，H1，H3，N1
和 N2 特异性引物和探针检测的敏感性低于 M基因
的检测。
2 2 实时荧光定量 PCR
实时荧光定量 PCR 技术，是一种核酸定量技
术，它是一种在 PCR 反应体系中加入荧光基团，利
用荧光信号积累实时监测整个 PCR进程，最后通过
标准曲线对未知模板进行定量分析的方法;该技术
不仅实现了对 DNA模板的绝对定量，而且能实现多
重反应，自动化程度高、无污染性等特点。该技术可
以通过不同的解链温度来区分出 H1N1 亚型流感病
毒和其他 H1 亚型的流感病毒。相比普通的 RT-
PCR，其更灵敏、快速(约 50 min)、安全和特异性高，
可以实现对病原体的核酸的定量，但不可否认的是
荧光 PCR仪比普通的 PCR 仪要贵几倍甚至是几十
倍，目前还不能广泛应用于生产实践。
近几年国外相继有报道该法用于 SI 的诊断。
2009 年 5 月，美国食品药品监督管理局(FDA)和美
国疾病预防控制中心(CDC)推荐使用 Applied Bio-
systems 7500 Fast Dx实时定量 PCR 仪或 7500 实时
定量 PCR仪进行甲型 H1N1 流感病毒的检测，但该
方法需要配置专门的荧光 PCR检测仪，检测试剂也
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生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2010 年第 6 期
较贵。
2 3 依赖核酸序列的扩增法
依赖核酸序列的扩增技术也就是 NASBA 技
术，是一种扩增 RNA 的新技术，反应在 42℃进行，
拥有比 PCR更高的扩增效率(可以在 2 h 左右将模
板 RNA扩增约 109倍) ，不需特殊的仪器，即使在有
DNA污染或存在的情况下，同样不受影响。该技术
特别适用少量 RNA 分子的检测，错配率低，特异性
强，操作简便、灵敏度和准确率高，不受抗体的影响，
适用检测标本范围广泛，时间短(6 h)。目前，国内
还没有关于该方法应用于 SIV 检测的报道，由于
SIV和 AIV同属 A型流感病毒，NASBA技术在流感
病毒检测上应用前景广阔。
2 4 核酸探针技术
核酸探针技术原理是碱基配对，互补的 2 条核
酸单链通过退火形成双链，这一过程称为核酸杂交。
核酸探针是指带有标记物的已知序列的核酸片段，
它能和与其互补的核酸序列杂交，形成双链，所以可
用于待测核酸样品中特定基因序列的检测。每一种
病原都具有独特的核酸片段，通过分离和标记这些
片段就可制备出探针，用于疾病的诊断等研究。
Junk等(2002)用非放射性地高辛标记的 582 个碱
基 cDNA探针来检测 A型 H1N1 猪流感病毒编码核
蛋白的 RNA，阳性细胞呈明显的暗黑色，证明该探
针有较好的特异性和敏感性。
2 5 基因芯片技术
基因芯片是生物芯片(包括基因芯片、蛋白芯
片和芯片实验室)中发展最为成熟的一项技术，它
是将大量已知 DNA 序列的探针通过一定方式固定
于某种固相载体表面，形成致密、有序的 DNA 分子
点阵;该技术以高通量、微量化、污染少、可多基因多
标本平行检测等特点被广泛应用于病原分型和疾病
诊断等。杨林等［15］利用该技术已成功检测 H1N1 /
H3N2 /H5N1 型 SIV，证明该方法敏感性高、特异性
好。2009 年 5 月，中国军事医学科学院军事兽医研
究所研制出一种新型基因芯片，借助这种芯片能在
5 h内获得检测结果。这种基因芯片能够用来检测
1-16 亚型的甲型流感病毒，并且可以对当前流行的
甲型 H1N1 流感病毒进行特异性检测，还可以对 H
1，H 3，H 5，H 7，H 9 亚型流感病毒进行分型检测。
2 6 蛋白质芯片
蛋白质芯片是继基因芯片后发展起来的生物检
测技术，其基本原理是将大量蛋白质有规则地固定
在介质载体上，利用蛋白质、酶与底物、蛋白质与其
他小分子之间的相互作用检测蛋白质的一项技术。
利用该技术可同时对多种蛋白质(如流感病毒基因
组 8 个基因片段共编码的 10 种蛋白:血凝素(HA)、
神经氨酸酶(NA)和离子通道 M2、聚合酶蛋白 PB1，
PB2、PA，PB1-F2 和核蛋白(NP)、基质蛋白(M1)和
非结构蛋白 2(NS2)、非结构蛋白 1(NS1)进行检
测，使用常规方法需要上千次才能完成的任务在蛋
白质芯片上仅需 1 次即可完成，目前检测到的平衡
数据误差更小、更准确。
2 7 M检测法
此法为近期美国食品药物管理局认证的内源性
病毒编码酶检测法。A型和 B型流感病毒的包膜表
面存在 M，可将含 α-酮糖 N-乙酰神经氨酸(N-acetv-
lneuraminic acid，Neu5Ac)的底物水解。将新合成的
Neu5Ac标记上色素原，形成 M底物，当存在 A型和
B型流感病毒时，含有色素原的底物被病毒的 M 分
解，释放出色素原，可通过光测定装置进行检测。由
于 M检测法所采用的底物只能被 A 型和 B 型流感
病毒 M分解，所以 M 检测法只能用于 A 型和 B 型
流感病毒的检测，而不能用于 C 型流感病毒的检
测。Novola等［16］应用标准板 M 试剂盒对 196 份临
床标本进行检测，并与病毒分离进行比较，结果其敏
感性高达 96%，特异性为 77%，阳性符合率 59%，
阴性符合率为 98%。该方法简便、快速及敏感性极
高，适用于各个基层及病毒实验室进行临床诊断。
3 结语
传统的诊断方法中有些操作繁琐、费时，结果重
复性不好，特别是流感病毒的血清型多，变异株也不
断出现，所有这些限制了传统方法在实际中的应用，
但传统的诊断方法在猪流感病毒的初次分离和亚型
鉴定中起着重要的作用。随着分子生物学的发展，
基于分子生物学建立的方法，如聚合酶链式反应、实
时荧光定量 PCR，NASTB法、核酸探针技术、内源性
病毒编码酶检测法、基因芯片技术、蛋白质芯片等，
为快速准确的诊断和检测猪流感提供了有效的方
法。随着科学技术的发展，应把传统的猪流感诊断
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2010 年第 6 期 李国娟等:猪流感的诊断技术研究进展
方法和现代的分子生物学诊断新技术有效地结合起
来，不断改进诊断方法和技术，SI 的诊断方法必将
进入一个新的阶段，将为控制和消除 SI 提供必要的
技术保障。
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