全 文 ：技术与方法
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2010年第 5期
口蹄疫诊断技术的研究进展
刘明 徐娜 李志勇 柳纪省
(中国农业科学院兰州兽医研究所传染病室 家畜疫病病原生物学国家重点实验室
农业部兽医公共卫生重点开放实验室,兰州 730046)
摘 要: 口蹄疫是偶蹄动物的一种急性, 热性,高度接触性传染病, 可使世界范围内的畜牧业遭受严重的经济损失。本
文综述了目前口蹄疫诊断技术的研究进展,其中包括了病毒分离技术等传统的诊断方法, 以及血清学诊断方法, 还介绍了环
介导等温扩增技术等几种新的诊断技术。
关键词: 口蹄疫 诊断技术 研究进展
Research Progress of D iagnosis Technology on
Footandmouth D isease
L iu M ing Xu Na L i Zhiyong L iu J ix ing
(A nimal InfectiousD iseasesResearch Laboratory, Lanzhou Veterinary Research Institute, Chinese A cademy of A gricultural Sciences,
StateK ey Laboratory of Veter inary etio log ical Biology, K ey Laboratory of Veterinary PublicH ealth of
M inistry of Agriculture, Lanzhou, 730046)
Abstrac:t FoodandM outh disease ( FMD) is a kind o f h ighly fata l and contag ious d isease o f c lovenhoo fed an ima ls, wh ich can
m ake serious econom ic losses o f An im al husbandry in thew or ld. The article described current d iagno stic techn iques o f foo t and mouth
d isease inc lud ing traditional diagnosticm ethods like v irus iso lation, sero log ica l test and som e new diagnostic techn iques like Loopm ed i
a ted isotherm al amp lifica tion( LAM P) .
Key words: FMD D iagno sis technology Research prog ress
收稿日期: 20100111
作者简介:刘明,男,在读硕士研究生,研究方向:分子病毒学; Em ai:l breezem ai@l 126. com
徐娜,女,山东淄博人,在读硕士研究生,研究方向:分子病毒学
通讯作者:柳纪省, Em ai:l liu jixing@ hotm ai.l com
口蹄疫 ( footandmou th disease, FMD)是由口蹄
疫病毒 ( footandmouth disease v irus, FMDV )感染引
起的偶蹄动物共患的一种急性、热性、高度接触性传
染病。由于其发病率极高, 严重影响畜牧业生产和
国际贸易,因而受到各国的高度重视 [ 1]。口蹄疫病
毒有 7个血清型,分别为 A、O、C、SAT I、SAT 、SAT
!及 Asia∀型。每个型又可分为若干个亚型。型及
亚型之间几乎无交叉免疫反应,所以给口蹄疫的防
治工作带来了很大难度。因此,准确而快速的诊断
技术是预防和治疗该病的必要措施。
1 传统的诊断方法
11 临床诊断
动物感染口蹄疫病毒后临床症状主要表现为持
续高热、厌食、精神不振,且在舌面、齿龈、唇内侧、颊
部黏膜、趾间皮肤、蹄叉、蹄冠以及乳头和乳房常出
现水疱,继而破裂。临床诊断即通过比对病畜与口
蹄疫典型症状间的相似程度做出的初步诊断。由于
口蹄疫在临床症状上与水疱性口炎 ( vesicu lar stoma
titis, VS)、猪水疱病 ( sw ine vesicu lar d isease, SVD )、猪
水疱疹 ( SVE )等非常相似, 往往不易直接从临床症
状确诊。因此,任何可疑病料都必须经过实验室检
测才能进行确诊。
12 病毒分离
病毒分离是指从病畜病料中分离病毒并进行鉴
定而作出诊断。该方法是检测口蹄疫最可靠的方
法, 被称为是黄金标准, 其主要应用细胞培养和动物
2010年第 5期 刘明等:口蹄疫诊断技术的研究进展
接种来分离病毒 [ 2]。
121 细胞培养 检测口蹄疫最初采用单层初代
猪肾细胞,后来随着细胞培养系统的不断增多以及
细胞培养技术的提高,就有许多细胞可以用于 FM
DV的分离。其中初代小牛甲状腺 ( CYT )细胞分离
FMDV最为敏感, 其次小牛肾细胞、乳仓鼠肾细胞
BHK21等也可分离 FMDV。目前大多数实验室都
将 CYT细胞和 IBRS2培养细胞 (猪肾细胞系 )作
为分离 FMDV的常规细胞。这两种细胞系可将 FM
DV和 SVDV (猪水泡病病毒 )区分开,因为 FMDV可
在这两种细胞上生长, 且有相似的细胞病变, 而
SVDV只能在 IBRS2细胞上生长。细胞培养分离
FMDV确实可靠, 但培养程序较繁杂, 而且耗时
耗力。
122 动物接种 动物接种常用乳鼠来进行。用
原始病料对 2- 7日龄未断奶小鼠进行腹腔接种 [ 3 ]。
一般需要接种 8- 10只以便于观察接种鼠的死亡情
况和获得足够多的抗原, 并在进行补体结合试验
( CFT)时获得明显的阳性结果。该方法分离 FMDV
确实可靠,但需要在生物安全三级实验室进行试验,
对环境要求比较严格。
13 补体结合试验
补体结合试验 ( complement f iraton tes,t CFT)是
检测口蹄疫最早的标准化方法。自 1943年成功地
用于 FMDV分型鉴定以来, 被世界咨询实验室
(WRL)和各 FMD研究或定型中心应用至今。该方
法可鉴定抗原,抗体, 并可进行定量测定。一般用常
量补体结合试验为待检的血清定型, 微量补体结合
试验用于亚型和毒株抗原性分析。该法操作简便,
节省试剂,但敏感性不高, 且易受样品中的亲补体性
和抗补体物质的干扰。
14 病毒中和试验
病毒中和试验 ( v irus neutralization tes,t VNT)是
20世纪 70年代由 Rweyem amu等建立的一种比较
经典的血清学检测方法。它是基于血清中和抗体与
病毒特异性中和作用, 使病毒对易感动物和敏感细
胞失去感染能力的原理而建立起来的。该方法是世
界动物卫生组织 ( O IE)推荐的检测 FMDV抗体的标
准方法,而且国际检疫条款也规定用此法判定进出
境动物是否感染或携带 FMDV。但该方法必须使用
活病毒,非普通实验室所能操作, 而且中和试验全然
不能区分免疫抗体和感染抗体 [ 4]。
2 酶联免疫吸附 ( ELISA )诊断方法研究
进展
1979年 Abu等首次报道了用 ELISA试验检测
口蹄疫抗原, 后来直到 1987年 Roeder等 [ 5]在前人
工作的基础上才建立了较完备的 EL ISA检测法。
该法利用酶对底物的催化反应特性, 将酶与抗体偶
联并使之参与到抗原抗体反应中, 依据底物所发生
的变色反应程度, 来指示和量化抗原抗体的反应水
平。该法具有灵敏度高、特异性强、重复性好, 不许
动用活毒等优点。
21液相阻断 EL ISA
液相阻断 ELISA ( liqu id phase b lock ing ELISA )
是用 FMDV灭活的 140S制备抗血清或作抗原来检
测 FMDV的血清样品 [ 6 ]。2005年,马军武等 [ 7]在国
内首次建立了 A sia∀液相阻断 ELISA的方法, 主要
用于检测免疫动物血清中抗体的分泌水平, 以了解
动物的免疫状态和抗病能力, 具有快速、灵敏、准确
等优点。并且克服了血清中和试验无法推广的缺
点, 适合于大批样品的血清学调查,是国际认可的一
种标准化诊断技术。但该法检测结果总有一定的假
阳性出现,因此对待检的可疑阴性样品还需进一步
用 VNT确诊 [ 8]。
22 间接 ELISA
间接 ELISA ( IndirectELISA )是以口蹄疫病毒的
蛋白为抗原来测定动物血清样品, 主要用于鉴别感
染动物和注苗动物。它与其它 ELISA的区别在于
直接将病毒抗原包被于板上,简单易操作,并且克服
了 V IA琼脂扩试验敏感性低的缺点。 2005年,刘在
新等 [ 9]在国内首次建立了测定 3ABC抗体的方法,
后来,大量试验证明 FMDV 3ABC聚蛋白是鉴别感
染动物和注苗动物的最好抗原 [ 10]。目前许多实验
室都己建立了测定该蛋白抗体的方法,该法具有特
异性强、准确性高等优点,但操作过程较繁琐。
23 固相竞争 ELISA
由于液相阻断 EL ISA对口蹄疫临床样品的检
测总有一定的假阳性率, 因此, 2003年 Chanard
等 [ 11]发展了固相竞争 ELISA ( so lid phase compet ition
ELISA )。该方法只需浓缩的、半纯化的灭活全病毒
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生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2010年第 5期
146S做抗原就能检测 FMDV的抗体, 并且其特异性
超过 995%, 敏感性可达 100%。正是由于其优越
的性能,被广泛地应用于许多实验室。但固相竞争
ELISA由于需要大量的洗涤过程, 减缓了样品的检
测速度,所以在疾病暴发期间不能对大量的样品进
行快速的检侧。
24 夹心 ELISA
1987年, Roeder等 [ 12]在前人工作的基础上建
立了间接夹心 ELISA ( sandw ich ELISA ), 主要用于
FMD病原和血清样品的检测和诊断。它克服了补
体结合试验样品定型率低的缺点, 而且还能反映出
疫苗与流行毒株间的抗原相关程度。 2007年, 吴国
华等 [ 13]进一步发展了夹心 ELISA, 建立了可以给
FMD定型的夹心 EL ISA方法, 使得该方法具有快
速、敏感、准确等优点, 而且在检测田间样品时敏感
性高于补体结合试验。
3 现代分子生物学诊断方法
31 聚合酶链式反应 ( PCR)
PCR技术应用于口蹄疫的检测最早报道于
1991年, M eyer等根据编码的 FMDV RNA多聚酶基
因序列设计合成了一对引物和探针, 经 PCR扩增获
得了 454 bp的扩增产物, 并用寡核苷酸探针杂交,
结果显示强阳性, 接着用 N co I酶切证实了预计的
限制性位点。之后许多国家和地区报道了 PCR在
口蹄疫诊断中的研究及应用,吴时友等也在 1999年
报道了用 PCR检测口蹄疫的研究。该法最大的优
点在于待测样品可以是水泡液,也可以是扁桃体、淋
巴结、肌肉、皮肤等组织,这是其它方法所不具有的。
1996年,朱彩珠等用反转录聚合酶链式反应 ( RT
PCR )技术检测出了牛食道 - 咽部分泌物中的 FM
DV, 简化了利用 PCR技术检测 FMDV 的步骤。
2005年,包慧芳等 [ 14]建立了荧光实时定量 RTPCR
检测 FMDV的方法, 进一步完善和推动了 PCR技术
在 FMDV检测中的应用。该方法主要利用 TaqM an
技术, 为 3D基因区设计一组特异的引物和探针进
行荧光实时定量 RTPCR, 可以快速检测 O型、A
型、C型及 Asia∀型 FMDV,且可对病毒进行定量检
测,具有高度的特异性和实时性 [ 15]。另外, 将 RT
PCR与核酸序列测定相结合形成的核酸序列分析
方法在口蹄疫的检测中也得到了广泛的应用, 主要
用于疫源追踪、毒型鉴定和毒株遗传学系统树分析
等。 PCR检测法具有快速, 敏感性高, 特异性强等
优点,但需要提取 FMDV的 RNA, 具有一定的安全
隐患,因此要在特定的实验室进行检测。
32 核酸杂交技术
核酸杂交 ( nucle ic ac id hybridizat ion )技术检测
口蹄疫的原理是运用 P32等同位素标记 FMDV基因
组的 cDNA克隆片段作为探针与待检测口蹄疫基因
组 RNA特定区域进行反应而建立的检测方法。
1998年, Rossi等用 P32标记了 FMDV基因组聚合酶
序列作为探针,检测了试验感染口蹄疫病毒牛的食
道 -咽部刮取物并取得了成功, 该法为进出口动物
FMD检疫提供了快速、准确的检测方法 [ 16] , 但本方
法需要用活毒进行检测,对实验室要求较高。
33 寡核苷酸指纹图谱法
寡核苷酸指纹图谱分析法 ( o ligonucleo tide fin
ger printing)是将同位素标记在病毒核酸上。然后
用专切 3#端 G碱基的核酸 T1酶消化, 通过电泳后
放射自显影即可得到该病毒特有的带型,称之为指
纹图。该法重复性好, 能测定毒株间的相关性。但
由于印出来的 ∃图谱 %只是病毒 RNA分析序列中极
其有限的部分,因此,该法已被后来的核酸序列分析
法所取代。
34 基因芯片技术
基因芯片 ( DNA ch ips)技术的原理是将大量的
寡核苷酸或 cDNA以列阵的形式有序的固化于芯片
(硅片、玻璃、尼龙膜 )表面, 然后与已标记的待测样
品中的靶分子杂交。其结果用同位素法、化学荧光
法、化学发光法或酶标法显示,并通过激光共聚焦扫
描仪或电荷偶联摄像仪 ( CCD )等仪器对杂交信号
的强度进行检测分析,从而判定样品中是否含有靶
分子及数量。该法用于检测口蹄疫一般是将具有代
表性 FMDV毒株的血清型或基因型的 VP1、3A基因
片段点阵排列于芯片上, 与荧光分子标记的流行毒
株的 cDNA或 RNA杂交, 再用芯片扫描仪和相关软
件进行荧光信号读取和数据转化分析,即可很快查
明该样品与芯片中哪个毒株关系密切,从而明确该
样品毒株的血清型和基因型。而且该法还能判定病
毒株所属的基因亚型, 宿主嗜性及流行潜力等。这
种方法的优点是不仅能用于免疫动物抗体水平的检
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测,也可用于鉴别免疫动物和自然感染动物 [ 17 ] ,缺
点是对仪器设备要求较高。
35 电泳技术
由于不同的 FMD病毒株其结构蛋白的氨基酸
组成有区别,特别是 FMDV的结构蛋白 VP1、VP2和
VP3。因此, 可以通过聚丙烯酰胺凝胶电泳 ( PAGE )
或电泳图谱将这种区别显示出来, 达到检测口蹄疫
的目的。最早应用该法的是 H arris[ 18]于 1994年用
PAGE对口蹄疫病毒南非 I型强毒株和弱毒株进行
了生物化学分析。该法敏感性好、特异性高,但对操
作人员的技术水平要求较高,且检测所需时间较长。
另外, 利用特殊的电泳缓冲液 (两性电解质 )在聚丙
烯酰胺凝胶中制造一个 pH 梯度, 电泳时每种蛋白
质迁移到它的等电点 ( pI)同样可以达到分离不同
口蹄疫病毒蛋白的目的。
36 环介导等温扩增技术
环介导等温扩增 ( loopmed iated iso therm al am
plification, RTLAMP)技术是日本学者 N otom i等于
2000年开发的一种新颖的恒温核酸扩增方法。该
法的特点是针对靶基因的 6个区域设计 4- 6种特
异引物,利用一种链置换 DNA聚合酶 ( B stDNApo ly
merase)在等温条件 ( 65& 左右 )保温几十分钟, 即可
完成核酸扩增反应 [ 19]。 2007年, 孙晓智 [ 20 ]针对亚
洲 ∀型口蹄疫病毒 3D区的基因序列, 根据 LAMP
引物设计原则,在这些序列的保守区域设计了内、外
和环三对引物, 建立了快速检测口蹄疫病毒的
LAMP方法。 2008年, 秦智锋等 [ 21] 将反转录与
LAMP结合起来建立了口蹄疫病毒 RTLAMP的检
测方法,作者针对 FMDV 3D基因的 8个位点设计了
6条特异性引物, 从 RNA的提取到检测仅需要 75
m in。该法具有简便,快速, 灵敏度高,特异性强等优
点,缺点是需要提取 RNA, 因此存在一定的安全性
问题, 而且需要在特定的实验室进行。
参 考 文 献
[ 1] 张海峰,富相奎.口蹄疫的流行与防治. 黑龙江农业科学, 2006,
( 1) : 5960.
[ 2] 王莉娟,徐天刚,赵云玲,等.口蹄疫诊断技术研究进展.中国畜
牧兽医, 2005, 32( 3) : 4144.
[ 3] Ferris NP, et a.l The w orld referen ce laboratory for foot and m ou th
disease. a review of th irty three years of activity( 1958- 1991) . Rev
S ciTech Of f In t Ep iz, 1992, 11( 3) : 657684.
[ 4] 黄银君,等.口蹄疫检测技术研究进展. 中国进出境动植物检,
1995( 4) : 3436.
[ 5] Roed er PC, Le B lance, Sm ith PM, et a.l Detect ion and typ ing of foot
and m outh d isease virus by enzym e linked immunosorb ent assay.
ResVet S c,i 1987, 43: 225232.
[ 6] 董志强,张志, 等. 口蹄疫检测技术研究进展. 中国动物检疫,
2007, 24( 3 ): 4850.
[ 7] 马军武,周广青,靳野,等.应用液相阻断 EL ISA检测口蹄疫 A sia
∀型病毒抗体.中国兽医科技, 2005, 35(增 ) : 375377.
[ 8] 董志强,张志, 等. 口蹄疫检测技术研究进展. 中国动物检疫,
2007, 24( 3 ): 4850.
[ 9] 刘在新,曹轶梅,卢曾军,等.口蹄疫病毒非结构蛋白 3ABC抗体
ELISA检测试剂盒的研究. 中国兽医科技, 2005, 35 (增 ) :
352374.
[ 10] 周碧君,李谦,汪德生.口蹄疫检测能力比对试验的结果分析.
山地农业生物学报, 2006, 25 ( 2) : 111114.
[ 11 ] Chan ard C, M iedem a K, M oonen P, et a.l A solidphaseb loking
ELISA for detect iom of type foot and m ou th d isease virus su itab le
for m ass serology. JV irolM ethod s, 2003, 107 ( 1) : 8998.
[ 12] Roeder P C, Le B lance, Sm ith PM, et a.l Detection and typing of
footandm ou th d isease virus by enzym e l ink ed immunosorben t as
say. R es Vet Sc,i 1987, 43: 225232.
[ 13] 吴国华,张强,颜新敏,等.口蹄疫定型 ELISA诊断方法的建立.
中国兽医科学, 2007, 37 (增 ) : 603604.
[ 14] 包慧芳,郭建宏,卢曾军, 等. 应用荧光实时定量 RTPCR方法
检测口蹄疫病毒.中国兽医科技, 2005, 35(增 ) : 388389.
[ 15] 花群义,金宁一,周晓黎, 等.应用实时荧光定量 TaqM an RT
PCR检测口蹄疫病毒的研究, 中国兽医学报, 2005, 25 ( 2 ):
116118.
[ 16] 雷连成,陈伟,韩文瑜,等.家畜口蹄疫研究进展.中国预防兽医
学报, 2001, 23 ( 4) : 316319.
[ 17] 王建东,郭建宏,杨春生,等.基因芯片技术及口蹄疫病毒基因
芯片研究进展.动物医学进展, 2007, 28( 8) : 3740.
[ 18] H arris KS, X iangW, A lexanderL, et a.l In teraction of the po liov iral
Polypept ide 3CD pro w ith the 5#and 3#term in al of the pol iov iru s ge
nom e: id ent ification of viral and cel lu lar cofactors necessary for ef
ficien t b ind ing . J B iol Chem, 1994, 269( 43) : 2700427014.
[ 19] 常小印,刘洵,程印天,等.环介导等温基因扩增技术及其应用
研究进展.畜牧兽医科技信息, 2006, 12: 1012.
[ 20] 孙晓智.口蹄疫病毒环介导等温扩增检测方法的建立与评价
[D ] .内蒙古:内蒙古农业大学, 2007.
[ 21] 秦智锋,毕英佐,曾少灵,等.口蹄疫病毒 RTLAM P检测方法的
建立.中国预防兽医学报, 2008, 30( 5) : 375378.
73