全 文 ：生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN·技术与方法· 2008年第4期
收稿日期:2008-03-04
基金项目:公益性行业(农业)科研专项经费项目(nyhyzx07-007),“十一五”国家科技支撑计划(2006BAD17B07:20006BAD07B02)
作者简介:王艺凯(1982-),男,汉,硕士,研究方向:酶与酶工程;E-mail:wangyikai_2001@163.com
通讯作者:李宝聚,E-mail:libj@mail.caas.net.cn
植物病害免疫学诊断技术是伴随着医学免疫
学及动物医学免疫学的不断发展而发展起来的,它
是以抗原与抗体的特异性反应为基础而发展起来
的一种技术,不仅迅速、可靠,而且应用方便。早在
1918年,该技术就已经应用于植物病原细菌的检
测,至今,已经发展成为一门成熟的技术。
目前免疫学技术己广泛应用到植物病毒的检
测中,在植物病原真菌的检测中还不普遍,但最近
10几年来免疫学技术在病原真菌的检测方面发展
极快,已经在疫霉属 Phytophthor、腐霉属 Pythium、
丝核菌属 Rhizoctonia、镰刀菌属 Fusarium等许多植
物病原真菌检测中应用。
免疫学检测方法根据反应中是否引入标记物
分为非标记免疫分析方法和标记免疫分析方法两
大类。
非标记免疫分析又称传统免疫分析,它是利用
抗原-抗体反应后理化性质的变化对抗原抗体进行
测定的方法。根据手段不同,又可分为凝集反应、沉
淀反应、补体结合反应、免疫电泳等[1]。
标记技术克服了非标记技术灵敏度不高,缺乏
可供测量的信号等缺点。利用放射性、荧光或酶等
物质标记抗原或抗体,再利用抗原抗体反应的特异
性,使得灵敏度大大提高,同时检测的方法和类型
也有了更多的变化,主要有荧光标记免疫分析、放
射性标记免疫分析、发光免疫分析、免疫酶分析、免
疫胶体金快速诊断技术[2]。
植物病害免疫学诊断技术
王艺凯 1,2 李宝聚 2 陈红漫 1 石延霞 2 阚国仕 1 刘洋 2
(1沈阳农业大学生物科学技术学院 辽宁省酶工程技术中心,沈阳 110161;2中国农业科学院蔬菜花卉研究所,北京 100081)
摘 要: 植物病害免疫学诊断技术将以抗原和抗体的特异性反应为基础的传统免疫学继承并发展,应用于植物病
害的诊断上。最近10几年,植物病害免疫学诊断技术已广泛应用到病原真菌的检测中。免疫学诊断方法分为非标记免疫
分析方法和标记免疫分析方法两大类。着重介绍了应用于植物病害免疫学诊断技术中的酶联免疫吸附测定、免疫胶体金
快速诊断技术。
关键词: 植物病害 免疫学诊断技术 非标记免疫分析 标记免疫分析
TheImmunologicDiagnosisTechnologyofPlantDiseases
WangYikai1,2 LiBaoju2 ChenHongman1 ShiYanxia2 KanGuoshi1 LiuYang2
(1BiologicalScienceandTechnologyColegeofShenyangAgriculturalUniversity,EnzymeEngineeringTechnologicalCenterof
Liaoning,Shenyang110161;2TheInstituteofVegetablesandFlowers,ChineseAcademyofAgriculturalSciences,Beijing100081)
Abstract: The immunologic diagnosistechnology ofplantdiseasesinheritance and developmenttraditional
immunologythebasisofwhichisspecificresponseofantigen-antibody,usedinthediagnosisofplantdiseases.Forover
pasttenyears,theimmunologicdiagnosistechnologyofplantdiseaseshasbeenwidelyappliedtothedetectionof
pathogenicfungi.Theimmunologicdiagnosistechnologyisdividedintoanalysisofnon-immunemarkersandanalysisof
non-immunemarkers.Thispaperintroduced theenzyme-linked immunosorbentasay,immunecoloidalgold rapid
diagnosistechnology,bothofwhichapplytoimmunologicdiagnosistechnologyofplantdiseases.
Keywords: Plantdiseases Imunologydiagnosistechnology Analysisofnon-immunemarkers Analysisofnon-
immunemarkers
生物技术通报Biotechnology Buletin 2008年第4期
以下主要就免疫酶分析中的酶联免疫吸附测
定(ELISA)和免疫胶体金快速诊断技术进行叙述。
1 酶联免疫吸附测定
酶联免疫吸附测定(Enzyme-linkedimmunosorbnent
assay,ELISA)是 20世纪 70年代在荧光抗体和组
织化学基础上发展起来的一种免疫酶技术。它以免
疫学反应为基础,将抗原、抗体的特异性反应与酶
对底物的高效催化作用相结合起来的一种敏感性
很高的试验技术。它不仅具有免疫荧光法和放射免
疫法的反应灵敏、特异性强的优点,而且克服了常
规血清学方法受病原菌浓度、粒体形态和抗血清用
量等限制的缺点,是目前免疫测定中最常用的技术
之一[3]。ELISA技术于70年代初由Engval和Perlmann
(1971)研究成功,首先用于检查人和动物的传染病
(Voleyet,1974),在植物病毒检测上的应用是
Voler(1976)、Clark和 Adams(1977)报道的。此后,
很快在病毒和其它病原物的检测中使用。目前,己
被广泛用于生物学、医学和农业等许多领域,可成
功的对病毒、真菌、细菌、线虫等抗原及抗体检测,
从而对病害作出诊断。
1.1 双抗体夹心法
双抗体夹心法是检测抗原最常用的方法。当抗
原没有很好纯化时,抗原中的其他非抗原大分子物
质也可能被包被于固相载体上,这些非抗原大分子
能干扰进一步的反应,因而特异性较差;而 DAS-
ELISA则不同,它以抗体作为包被物,抗原中的非
抗原大分子物质不能吸附在载体上,因而特异性较
好。
根据同样原理,将大分子抗原分别制备固相抗
原和酶标抗原结合物,即可用双抗原夹心法测定标
本中的抗体。
改良双抗体夹心法也是用于测定抗原的。这种
方法与双抗体夹心法不同之处是多加了一层抗体。
因此,放大的倍数更高,故比双抗体夹心法更加灵
敏。同时,避免标记特异性抗体,而另一优点是只要
标记一种抗体,即可达到多种应用[4~6]。
1.2 双位点一步法
在双抗体夹心法测定抗原时,如应用针对抗原
分子上两个不同抗原决定簇的单克隆抗体分别作
为固相抗体和酶标抗体,则在测定时可使标本的加
入和酶标抗体的加入两步并作一步。这种双位点一
步不但简化了操作,缩短了反应时间,如应用高亲
和力的单克隆抗体,测定的敏感性和特异性也显著
提高[5]。单克隆抗体的应用使测定抗原的 ELISA提
高到新水平。在一步法测定中,应注意钩状效应
(hookefect),类同于沉淀反应中抗原过剩的后带现
象[6,7]。当标本中待测抗原浓度相当高时,过量抗原
分别和固相抗体及酶标抗体结合,而不再形成夹心
复合物,所得结果将低于实际含量。钩状效应严重
时甚至可出现假阴性结果[8]。
1.3 竞争法
这种方法所测定的抗原只要有一个结合部位
即可,因此,对小分子抗原的测定常用此法[9]。该法
的优点是快,因为只有一个保温洗涤过程。但需用
较多量的酶标记抗原为其缺点。当抗原材料中的干
扰物质不易除去,或不易得到足够的纯化抗原时,
可用此法检测特异性抗体[10~12]。如抗原为高纯度的,
可直接包被固相。如抗原中会有干扰物质,直接包
被不易成功,可采用捕获包被法,即先包被与固相
抗原相应的抗体,然后加入抗原,形成固相抗原。洗
涤除去抗原中的杂质,然后再加标本和酶标抗体进
行竞争结合反应。
1.4 间接法
间接法是检测抗体最常用的方法。本法只要更
换不同的固相抗原,可以用一种酶标抗体检测各
种与抗原相应的抗体。但不如双抗体夹心法灵敏
性高[13,15]。间接法的优点是只要变换包被抗原就可
利用同一酶标抗体建立检测相应抗体的方法。间接
法成功的关键在于抗原的纯度。虽然有时用粗提抗
原包被也能取得实际有效的结果,但应尽可能予以
纯化,以提高试验的特异性。如抗原中含有无关蛋
白,会因竟争吸附而影响包被效果[14]。间接法中另
一种干扰因素为正常血清中所含的高浓度的非特
异性。血清中受检的特异性 IgG只占总 IgG中的一
小部分。IgG的吸附性很强[16,17],非特异 IgG可直接
吸附到固相载体上,有时也可吸附到包被抗原的表
面。因此,在间接法中,抗原包被后一般用无关蛋白
质 (例如牛血清蛋白)再包被一次,以封闭
(blocking)固相上的空余间隙。另外,在检测过程中
标本须先行稀释(1:40～1:200),以避免过高的阴性
76
2008年第4期
本底影响结果的判断。
1.5 斑点酶联免疫吸附技术(DOT-ELISA)
又称 NCM-ELISA,该方法是以硝酸纤维素膜
(NCM)为固相载体,通常采用间接 ELISA,此法与
常规 ELISA相比有很多优点:Lizarage等[1]研究发
现,NCM对蛋白质有较高的亲和力,提供蛋白较大
的结合表面,使检测的灵敏度提高,而且反应产生
鲜明的色斑,形成强烈的对比;Berger等[2]实验表明
NCM法测定所需的最低病毒量低于常规 ELISA的
1000倍。运用此技术,孟清等[3]、张国柱等[4]对马铃
薯脱毒苗进行了检测,结果表明这种技术比 DAS-
ELISA灵敏度高,而且经济简便,快速直观,对基层
单位特别有用。ELISA法检测病原菌特异性强,灵
敏度高,一次可检测大量样品[18,19]。但这种方法也
存在一些缺点,经常存在假阳性反应,而使检测灵
敏度降低。
2 免疫胶体金快速诊断技术
1971年,Faulk和 Taylor将兔抗沙门氏菌抗血
清与胶体金颗粒结合,用直接免疫细胞化学技术检
测表面抗原,标志着免疫胶体金标记技术正式诞
生。此后,胶体金作为一种新型免疫标记技术发展
很快。进入 20世纪 80年代后,免疫胶体金又与固
相膜结合发展了以膜为固相载体的免疫胶体金快
速诊断技术,由于其快速、便捷、特异敏感、不需要
特殊设备和试剂、结果判断直观等优点,已在生物
医学领域得到广泛应用,尤其是医学临床检验[20]。
而在植物保护研究上的应用起步较晚,最近 10几
年才有报道,作为检测试剂盒开发应用的更晚。免
疫胶体金快速诊断技术是当前最快速敏感的免疫检
测技术之一,具有巨大的发展潜力和应用前景[21]。
以膜为固相载体的免疫快速诊断技术是 20世
纪 90年代以来在酶联免疫吸附试验、乳胶凝集试
验、单克隆抗体技术、胶体金免疫技术和新材料技
术基础上完善起来的一项新型体外诊断技术。目前
常见的有 2种形式,一种是侧向横流形式,又称为
免疫层析试验(ICA);另一种是穿流形式,又称为
免疫渗滤试验(IFA),国内常简称滴金免疫渗滤试
验(DI-FA)[22,23]。
胶体金免疫渗滤分析(GIFA)原理与操作步骤
基本与 ELISA相同,胶体金免疫层析分析 GICA原
理与 GIFA相同,只是操作步骤有所不同。GICA与
GIFA不同之处在于后者只是单一的免疫层析条,
不要其它试剂,只需一步操作即可观察试验结果。
二者与 ELISA不同处是反应时间大大缩短,仅需要
数分钟就完成了 ELISA需数小时才能显示的结果。
因为在 GIFA和 GICA中,高浓度的抗体集中固定
在纤维素的微孔中,待测抗原在渗滤或层析时,流
经微孔与固定的高浓度抗体紧密接触,很快完成免
疫结合反应。这就是以膜为基础的胶体金快速免疫
结合分析中的免疫浓缩作用(immunoconcentraiton)。
在 ELISA中,待测抗原要在液相中经过扩散作用,
逐渐与吸附在固相表面的抗体结合。同时,标记抗
体也需要同样的扩散结合过程形成抗体-抗原-标
记抗体复合物,故需时间较长[24]。
3 展望
目前,免疫分析发展状况是多种方法并存,相
互竞争,相互补充。非放射免疫分析相对放射免疫
分析更具有综合优势和潜力,发展速度更快。不管
怎样,目前还没有一种免疫分析技术是完美无缺
的,各种技术还需要不断发展和完善,并且人们还
在不断研究,以开发出更新更理想的免疫分析技
术。
近些年来已有许多植物病原菌属的诊断试剂
盒出售,如疫霉属(Phytophoraspp)、腐霉属(Pythium
spp)、黑盘菌属(Scelertiniaspp)等[9]。这些试剂盒可
分为 2类:一类是供研究用的酶联免疫吸附测定
(Enzyme-linkedimmunosorbnentassay,ELISA)试剂
盒,它需要用分光光度计测定反应的结果;另一类
是现场用的一步法免疫胶体金快速诊断技术试剂
盒,这类试剂盒可在田间地头或检查现场直接应
用,无需借助分光光度计判定结果,一般凭肉眼就
可判定结果。
在进行病害诊断操作中,诊断者要根据标本情
况和实验条件,灵活选择其中一种或两种方法,进
行准确无误的诊断。诊断的准确性既依赖诊断方法
是否准确,以及设备条件和标本处理情况;又依赖
诊断者的经验、技能等。
参考 文献
1 ZuoP,YeBC.JournalofAgricultureandFoodChemistry,2006,54
(19):6978～6983.
(下转第93页)
王艺凯等:植物病害免疫学诊断技术 77
2008年第4期
(上接第77页)
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
2 AyazY,AyazND,ErolI.JournalofMuscleFoods,2006,17:214.
3 BeriniA,TepedinoV,BoromeoV,SecchiC.FoodChemistry,2006,
96:163～168.
4 MayerHK.InternationalDairyJournal,2005,15:595～604.
5 ParkDL,CoatesS,BrewerVA,GarberEA,AbouziedM,JohnsonK,
etal.JournalofAOACInternational,2005,88:156～160.
6 PomsRE,AgazziME,BauA,BroheeM,CapeletiC,NorgaardJV,
etal.FoodAdditives&Contaminants,2005,22:104～112.
7 HurleyIP,ColemanRC,IrelandHE,WiliamsJHH.InternationalDairy
Journal,2006,16:805～812.
8 KhanAA,KhanHM,DelinceH.FoodControl,2005,16:141～146.
9 KieningM,etal.JournalofAgriculturalandFoodChemistry,
2005,53:3321～3327.
10 KimSH,HuangTS,SeymourTA,WeiCI,KempfSC,BridgmanCR,
etal.JournalFoodProtection,2005,68:1860～1865.
11 LiuLH,ChenFC,DorseyJL,HsiehYHP.JournalofFoodScience,
2006,71:M1～M6.
12 VanER,BerghoferE,CiclitiraPJ,ChirdoF.JournalofCereal
Science,2006,43:331341.
13 VanHAJ,CapeletiC,BroheeM,Anklam E.JournalofAOAC
International,2006,89:462～468.
14 VonHC,BoixA,BaetenV,VancutsemJ,BerbenG.FoodAdditives
&Contaminants,2006,23:252～264.
15 BeierRC,CreemerLC,ZiprinRL,NisbetDJ.JournalofAgricultural
andFoodChemistry,2005,53:9679～9688.
16 HoclineL,BoyeJI.CriticalReviewsinFoodScienceandNutrition,
2005,47:127～143.
17 KimSH,HuangTS,SeymourTA,WeiCI,KempfSC,BridgmanCR,
etal.JournalFoodProtection,2005,68:1860～1865.
18 ReeceWH,etal.NatMed,2004,10:406～408.
19 MongkolsapayaJ,etal.NatMed,2004,9:921～924.
20 Sensors,ActuatorsB.Chemical,2007,127(2):335～340.
21 YooJungKim,YoungAhKim.YongTaeLeeandHye-SungLee
AnalyticaChimicaActa,2007,591(2):183～190.
22 TerukoYuhi,NaokiNagatani,TatsuroEndo,etal.Journalof
ImmunologicalMethods,2006,312:54～60.
23 SwinnenK,KrulA,VanGI,etal.ChromatogrBAnalytTechnol
BiomedLifeSci,2006,6(8):20.
24 YongJin,Jin-WookJang,etal.JournalofVeterinaryScience,
2006,7(2):111～117.
(盒)备案参考评判标准”的通知[Z].
17 石德时,周斌,潭雅丽,王桂枝.中国兽医学报,2002,22(1):
77~79.
18 叶雪珠,王小骊,赵燕申,等.食品科技,2003,(8):84~85.
19 沈美芳,赵文亚,等.南京师范大学学报,2003,3(2):1~4.
20 魏书林.鸡肌肉组织中氯霉素残留的酶联免疫吸附检测法研
究 [硕士学位论文].北京:中国农业大学,2004.
21 宋洁.氯霉素全抗原合成的研究及间接 ELISA检测方法的建
立 [硕士学位论文].保定:河北农业大学,2006.
22 沈建忠,钱传范,杨汉春,等.畜牧兽医学报,1999,30(2),
172~179.
23 沈建忠,钱传范,杨汉春,等.中国农业科学,1998,31(6):1~5.
韩庆功等:ELISA检测技术在畜产品抗生素类药物残留检测中的应用
抗鸡CD25单克隆抗体的制备与鉴定
浙江大学医学部附一医学院传染病研究所吴炜,浙江大学动物预防医学研究所 腾巧泱、吴佳俊、周继勇等5
位免疫学研究的科学人员,用纯化的鸡IL-2Ra(chCD25)重组蛋白免疫BALB/C小鼠,取其脾细胞与SP2/0骨髓细
胞免疫融合,对杂交瘤细胞及时筛选,阳性孔经3次有限稀释法克隆,成功获得1E1,1G1,4H5,5E1,6A1,6C2,6C9,
7株能移能稳定传代并分泌抗chCD25单克隆抗体的杂交瘤细胞。该7株单克隆抗体的腹水间接ELISA效价达
106以上,除了1E1为IgG2b外,抗体类型均为IgG1,轻链均为k。经westernblot和免疫细胞化学分析表明,7株单
克隆抗体皆与chCD25重组蛋白和真核表达蛋白EGFP-chCD25反应。抗chCD25单克隆抗体的获得为开展禽类
分子免疫学研究提供了一种新的工具和手段。此外,鸡CD25单克隆抗体皆能识别Vero细胞上表达的真核蛋白
chCD25,说明这一研究不仅对人类医学有开拓作用,同时对动物医学也有了很大的生产与推广价值。 秦春圃
·信息交流·
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
93