全 文 ：研究报告
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2010年第 3期
拟南芥 FT基因原核表达载体的构建、表达和蛋白纯化
任霞1, 2 吴忠义2 黄丛林 2 张秀海2
( 1首都师范大学生命科学学院,北京 100048; 2北京市农林科学院北京农业生物技术研究中心,北京 100097)
摘 要: FT基因是植物成花素,在植物的开花调控中起着重要作用。构建了用于原核表达的 FTeGFP表达载体,并在大
肠杆菌 BL21中进行重组蛋白的诱导表达。从 IPTG诱导浓度、诱导时间和诱导温度等方面进行了细致的分析, 最终建立了 FT
eGFP融合蛋白诱导表达的优化体系:当菌液 OD600 = 06- 1 0时, 采用 IPTG 1 0 mo l/L, 在 28 诱导表达 6 h。摸索和建立了利
用 H is T rap K it标签,经过镍柱纯化, 纯化目的蛋白的技术体系,为进一步研究 FT基因在植物开花调控中的应用奠定了基础。
关键词: FTeGFP融合蛋白 原核表达 蛋白纯化
Expression and Purification ofArabidopsis FT Gene in Prokaryotic Cells
Ren X ia
1, 2 Wu Zhongyi2 Huang Conglin2 ZhangX iuhai2
(
1
College of Life Science, CapitalN ormal University, B eijing 100048;
2
Beijing Research C enter of AgroBiotechnology, Beijing A cademy of Agriculture and Forestry Sciences, Beijing 100097)
Abstrac:t FT is a key gene in regu la ting the flower ing tim e o fA rabidop sis. In th is research, express ion vec to r of FTeGFP in pro
karyotic cells was constructed and the fused prote in expression w as induced in E. coliBL21. IPTG concentration, induction tim e and induc
tion tem perature w ere de term ined to set up optima l condition for fused prote in expression purification. W hen OD600 ofE. coli liqulid culture
w as 06- 10, fina l concentration o f 10 mo l/L IPTG w as applied into the culture to induce fused pro tein followed by incubation at 28
for 6 hours. FTeGFP fuse prote in was then pur ified w ith H is T rap K it. This research m akes it possible to investigate the function of FT
prote in in promo ting p lant flow ering.
Key words: FTeGFP fusion prote in P rokaryotic expression P ro tein pur ification
收稿日期: 20091124
基金项目:国家 ! 863∀项目 ( 2008AA10Z1562) ,北京市园林绿化局菊花育种创新平台 (Y Hl H2008002 )
作者简介:任霞,女,在读硕士,主要从事菊花生物技术育种研究; Em ai:l renxia305@ 126. com
通讯作者:张秀海,男,副研究员,主要从事农业生物技术育种研究; Em ai:l zhangx iuh a@i yahoo. com. cn
目前,关于拟南芥开花时间的主要调控途径已经
研究的比较清楚,主要受 4种遗传途径的调控,光周
期途径、春化途径、自主途径和赤霉素途径。各种途
径之间通过 CO( CONSTANS)、FLC( FLOWER ING LO
CUS C )、FT ( FLOWERING LOCUS T )、SOC1 ( SUP
PRESSOR OF OVEREXPRESSION OF CONSTANS1 )
等主效基因的相互作用,最终调节花特异性基因 AP
ETALA( AP1)和 LFY的表达,从而调控拟南芥的开花
时间 [ 1]。
植物 FT基因家族在进化上是一类高度保守的基
因家族,其中的 FT基因编码一个分子量小于 20 kD
的蛋白质,这种蛋白质的结构与广泛存在于哺乳动
物、酵母和细菌中的磷脂酰乙醇胺结合蛋白 ( phos
phat idy lethano lam ine binding prote in, PEBP)相似,均具
有保守的磷脂酰乙醇胺结合域 [ 2]。拟南芥 FT和
SOC1基因是 CO的直接靶基因。FT基因作用于各种
调控途径的下游,编码一种分子量较小、可移动的蛋
白,在子叶和叶脉中表达。 FT基因编码的蛋白产物
是可以长距离转运的成花激素,可从叶片运输到芽顶
端。优先在芽顶端表达的 FD ( FLOWERING LOCUS
D) ,对 FT促进开花是必需的, FD和 FT通过蛋白互
作,激活花分生组织特异性基因 AP1, 从而促进开
花 [ 3- 5]。FT的同源家族 PtFT1、C iFT、Hd3a和 SFT基
因,都已经分别从杨树、柑橘、水稻、和番茄中克隆出
来,并且分别使其过量表达,在转基因植株中诱导植
物提前开花 [ 6- 9]。Takash i等 [ 10]首次将 FT基因转入
生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2010年第 3期
观赏性花卉龙胆草中, 4个月后在试管中就可以
开花。
绿色荧光蛋白 ( green fluorescent pro tein, GFP)作
为一种报告蛋白在检测目的基因的表达、研究细胞内
物质代谢及追踪细胞系的分化等方面有着极其广泛
的应用 [ 11]。GFP的突变体 eGFP发出的荧光比 GFP
亮 35倍,在自然光下即可以看到绿色,是一种应用更
为广泛的标记蛋白质 [ 12]。
本研究将得到的已经克隆到 pCR21上的 FT
eGFP基因,连接到原核表达载体 pET30a( + )上, 在
大肠杆菌 BL21中, IPTG诱导该融合蛋白的高效表
达,经过镍柱纯化目的蛋白,获得了高质量的 FTeG
FP融合蛋白,为进一步研究 FT蛋白在植物体内的活
动机理奠定了基础。
1 材料与方法
11 供试材料
连有 FTeGFP的质粒载体 pCR21由美国加州
大学生物学院植物生物学系的W illiam J. Lucas实验
室惠赠。Ex Taq酶、限制性内切酶均购自 TaK aRa公
司。T4连接酶、Teasy载体试剂盒购自 Promega公司。
质粒小量制备试剂盒、回收试剂盒、引物合成和序列
测序都是由上海生工生物工程技术有限公司提供的。
DH5感受态细胞由实验室依据 #分子克隆 ∃自行制
备。 pET30a( + )质粒载体为本实验室所保存。化学
药品均为分析纯。
12 引物设计
根据序列,用 Prmi e50软件设计合成了一对寡核
苷酸引物。上游引物: 5%CACCATGGCTATGCGGGC
CTCTATAAAT3%(划线部分为N co I酶切位点 ) ;下游引
物: 5%CACTCGAGGGTACCGGATCCCTTGT3%(划线部
分为 Xho I酶切位点 )。
13 基因 FTeGFP的 PCR扩增
PCR总体积 25 L, 含模板 DNA 1 L( 50 ng)、
25 L 10 & buffer、上下游引物 ( 10 M )各 1 L、
20 L 25 mmo l /L dNTP、02 L Ex Taq聚合酶、
173 L ddH2O。PCR扩增的反应条件: 94 预变
性 4 m in,然后 94 45 s, 602 1m in, 72 1 m in,
共 20个循环, 72 7 m in, 18 终止。PCR产物经
10%琼脂糖电泳回收。回收片段与 Teasy载体
4 连接过夜,将连接产物转化大肠杆菌 DH5感受
态细胞,并进行测序确认。
14 原核表达载体的构建与鉴定
小量提取连有目的基因的载体质粒, 进行 Xho
I、N co I双酶切, 回收 13 kb的目的 DNA片段。
pET30a( + )载体质粒同样用上面两种酶双酶切,
回收 53 kb的质粒 DNA片段。目的片段与双酶切
后的 pET30a( + )连接, 16 连接过夜。将重组质
粒经热击转化到大肠杆菌 BL21感受态细胞中, 最
终获得携带有目的基因的原核表达载体。
15 目的基因的诱导表达条件的优化
挑取重组菌单菌落, 接种至含有 50 mg /L卡那
霉素的 LB培养基中, 37 培养过夜。将培养物按
1∋100接种至 20 mL含有 50 mg /L卡那霉素的 LB
培养基中, 37 220 r /m in,培养至 OD600为 06- 10
时,取 1mL作为阴性对照,向剩余培养液加入 IPTG
(终浓度为 10mo l /L ) , 28 180 r/m in, 6 h后, 取
菌液 1 mL用于显微镜观察。
在目的蛋白诱导表达过程中, 设置不同的 IPTG
浓度 ( 0、01、05、10、15、20mol /L) ,不同的诱导时
间 ( 0、2、4、6、8、10、12 h) , 不同的诱导温度 ( 37 、
28 、25 )诱导表达 6 h后,各取菌液 400 L, 10 000
r/m in,离心 30 s, 收集菌液沉淀,用 200 L ddH2O重
悬菌体, 取 16 L重悬液、4 L 5 & Loading Buffer,
10% SDSPAGE电泳鉴定。
16 目的蛋白的纯化
将所收集的菌体重悬于 5 mL细菌裂解缓冲液
(含 50 mM N aH2 PO4 2H 2O, 03 M N aC ,l 005%
Tween20, pH80) ,加入 50 L 100 mg /mL溶菌酶,
冰上放置 30 m in, 超声波破碎 5 m in后, 依次加入
05 L 5 U /mL DNaseI, 5 L 10 g /mL RN aseA,
125 L 1mo l/L M gC l2, 250 L 20% T rionX100, 4
放置 30m in, 14 000 & g离心 10 m in,分别取部分上
清、沉淀以备后续试验。将剩余上清, 过 N iNTA
H is B ind层析柱, 5 mL 洗涤缓冲液 (含 50 mM
NaH2 PO4 2H 2O, 03M N aC ,l 005% Tween20, 10
mM咪唑, pH80)洗 H is层析柱后, 加 5 mL洗脱缓
冲液 (含 50 mM N aH 2 PO4 2H2 O, 03 M N aC ,l
005% Tween20, 250 mM咪唑, pH70) , 收集目的
蛋白。将收集的上清、沉淀、纯化后蛋白, 10% SDS
PAGE电泳鉴定。
100
2010年第 3期 任霞等:拟南芥 FT基因原核表达载体的构建、表达和蛋白纯化
2 结果
21 FTeGFP的 PCR扩增及目的基因原核表达载
体的构建
经 PCR扩增后,扩增产物由 10%琼脂糖凝胶
电泳检测,结果如图 1所示。由图 1可知,扩增片段
特异性强,无杂带,大小约在 13 kb处,与已知序列
大小相符, 可初步确定这些扩增片段为目的片段。
回收这些片段,并将其连接到 Teasy载体上,测序。
经比对,序列 100%正确。重组体 pET30aFT质粒
经 Xho I和N co I双酶切,酶切结果如图 2,切出两条
大小分别为 53 kb和 13 kb的片段,与目的片段和
载体片段大小相符。
M. Marker; 1, 2. FTeGFP的 PCR扩增产物
图 1 FTeGFP基因 PCR片段
M. M ark er; 1, 2. X ho I和N co I双酶切重组质粒 pET30 aFT载体
图 2 pET30aFT原核表达载体的鉴定
22 FTeGFP融合蛋白在显微镜下的观察结果
将 pET30a空载体和 pET30aFT重组质粒载
体分别转化到大肠杆菌 BL21菌株中, 在荧光显微
镜下可以看到,重组质粒载体转化后的大肠杆菌发
出绿色的荧光 (图 3B ); 而空载体转化后的大肠杆
菌则没有这种现象。分别收集 100 mL空载体和重
组体诱导相同时间菌液的菌体,在自然光下,可以看
到重组体的菌体跟空载体的菌体沉淀不同, 空载体
菌体呈淡黄色, 而重组体呈淡绿色 (图 3A )。将分
别收集的 100mL空载体和重组体均诱导 6 h菌液
的菌体,用不加尿素变性处理的方法,经镍柱纯化后
收集到的蛋白,在显微镜下观察, 可以看到纯化后的
重组蛋白呈絮状,且发出绿色的荧光 (图 3D);而阴
性对照则没有这种现象 (图 3C )。
A.在自然光下,空载体 (左 )和重组质粒 (右 )转化后, IPTG诱
导 6 h后收集的菌体; B.在荧光下, pET30aFT重组质粒载体
转化后, IPTG诱导 6 h后; C.在荧光下, pET30a空载体经镍柱
纯化后,收集蛋白; D.在荧光下, pET30aFT重组体经镍柱纯
化后,收集蛋白
图 3 FTeGFP重组体及蛋白在显微镜下的观察
2. 3 融合蛋白诱导表达条件优化体系的建立
231 重组蛋白 IPTG诱导浓度的确定 将重组体
pET30aFT设置不同的 IPTG浓度, 分别为 0、01、
05、10、15、20 mol /L,诱导表达 6 h后, 10% SDS
PAGE电泳鉴定。可以看到重组体经 IPTG诱导后
有特异性的蛋白条带出现如图 4,大小为 53 kD。从
图 5可以看出, IPTG浓度达到 10mo l/L时,蛋白表
达明显增强,继续提高 IPTG浓度至 15、20 mo l/L
时, 融合蛋白表达量无明显变化, 因此在后续试验中
确定 IPTG使用终浓度为 10mo l/L。
232 重组蛋白诱导表达时间的确定 将重组体
pET30aFT设置不同的诱导时间,分别为 0、2、4、6、
8、10、12 h, 提取蛋白进行 10% SDSPAGE电泳分
析, 可以看到重组体经诱导后有特异性的蛋白条带
出现如图 5, 大小为 53 kD。从图 5可以看出, IPTG
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生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2010年第 3期
诱导 6 h,蛋白表达明显增强,而后随着时间的延长,
融合蛋白表达量无明显变化,因此在后续试验中确
定 IPTG诱导时间为 6 h。
M. M arker; 16. IPTG浓度分别为 0、01、05、10、15、20 m ol /L
图 4 重组体不同 IPTG浓度诱导后
蛋白的 SD SPAGE电泳
M. Marker; 1.诱导前; 27.诱导 2、4、6、8、10、12 h
图 5 重组蛋白经不同诱导时间的 SDSPAGE电泳
233 重组蛋白诱导表达温度的确定 将重组体
pET30aFT设置不同的诱导温度, 分别为 37 、
28 、25 ,诱导表达 6 h后, 10% SDSPAGE电泳鉴
定,结果如图 6所示,可以看到重组体经诱导后有特
异性的蛋白条带出现,大小为 53 kD。在 37 、28
培养温度下,重组蛋白的产率较高, 考虑到 28 培
养有助于减少重组蛋白包涵体的形成, 故在后续试
验中确定 28 为诱导重组蛋白表达的细菌培养
温度。
234 重组蛋白的纯化及鉴定 目的载体转化大
肠杆菌 BL21感受态细胞, 诱导表达后,经超声波破
碎 5 m in,分别取上清、沉淀、纯化后产物, 进行凝胶
蛋白电泳分析, 结果见图 7。将 pET30aFT分别转
化到大肠杆菌 BL21感受态细胞中, 诱导时间分别
为 0、2、4、6、8、10 h,分别收集 100mL菌液。经镍柱
纯化后,将得到的蛋白做 SDSPAGE凝胶蛋白电泳
分析。结果如图 5,可以看到重组体经 IPTG诱导后
有特异性的蛋白条带出现,大小为 53 kD。
M. M ark er; 137 诱导前; 237 诱导 6 h; 328 诱导 6
h; 425 诱导 6 h。
图 6 重组体不同诱导温度后蛋白的 SD SPAGE
M. M arker; 1.超声波破碎后取上清; 2.超声波破碎后取沉淀;
3.经镍柱纯化后收集的第一管蛋白; 4. 经镍柱纯化后收集的
第二管蛋白
图 7 重组体经超声波破碎后蛋白的 SDSPAGE电泳
M. M arker; 1. pET30aFT未诱导; 2. pET30aFT诱导 2 h;
3. pET30aFT诱导 4 h; 4. pET30 aFT诱导 6 h; 5. pET30aFT
诱导 8 h; 6 pET30aFT诱导 10 h
图 8 重组体诱导前后蛋白的 SDSPAGE电泳
3 讨论
本研究中选择的标记蛋白 ( ( ( 增强型绿色荧光
蛋白 eGFP, 是 GFP的突变体。 eGFP和 GFP一样由
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238个氨基酸组成, 所不同的是它发生了双氨基酸
取代, 第 64位的苯丙氨酸被亮氨酸取代, 第 65位的
丝氨酸被苏氨酸取代, max偏移至 490 nm 附近。
红偏移突变系的最大激发峰都落在常用滤色片的波
长范围内, 所以获得的荧光信号要比 GFP明亮得
多,使得对其观察和检测更为方便、灵敏 [ 13 ]。
关于拟南芥 FT基因及其同源基因在原核细胞
的表达国内外无研究报道。本研究选用 pET30a
( + )作为表达载体, eGFP作为标记基因, 进行诱导
表达, 利用 H is Trap K it标签,用镍柱进行纯化,成功
表达了带有 H is标签的 FTeGFP融合蛋白。影响目
的基因在原核中表达的因素比较多, 本研究对影响
重组蛋白产率的 IPTG的浓度、诱导时间和诱导温
度 3个因素进行了细致的研究。在试验的 5个
IPTG浓度下,表达量略有差异,但是也不是很显著,
选用了表达量相对较好的浓度 10 mo l/L。Y e
等 [ 14]在原核表达几丁质酶时, 发现 IPTG终浓度为
08mo l/L时表达量最高, 而随着 IPTG浓度的加
大,表达量也在降低, 这可能与不同的表达菌株和表
达载体有关。在诱导时间方面, 诱导 0- 8 h的 FT
eGFP蛋白的产率差异较为显著,随着诱导时间的延
长,蛋白的表达量也随之增加; 但是 8 h后的诱导时
间内, 蛋白的表达量差异不大, 基本稳定。试验还发
现在 28 的培养条件下, 有利于减少包涵体的形
成,蛋白的表达量最好。
本研究成功构建了拟南芥 FT基因原核表达载
体 pET30aFT, 并在大肠杆菌中进行表达, 并对其
表达条件优化, 经纯化后得到了大量融合蛋白。纯
化产物 SDSPAGE电泳结果显示, 纯化产物浓度较
高,且条带单一清晰,这为今后进一步研究 FT在植
物开花调控中的应用提供了技术支持。
参 考 文 献
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