全 文 ：·综述与专论·
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2011 年第 8 期
纤维素酶基因工程研究进展
李旺 张光勤
(河南科技大学，洛阳 471003)
摘 要: 纤维素酶(cellulase)是能够分解纤维素产生葡萄糖的一类酶。由于天然纤维素酶不能满足目前的需求，因此
纤维素酶的基因工程发展迅速。综述纤维素酶基因的克隆与表达，纤维素酶基因的克隆方法，包括构建文库、PCR扩增、人工
合成和宏基因组扩增。同时，综述纤维素酶基因的转化系统，并指出构建基因工程菌、酵母表达系统和真核表达系统是纤维
素酶基因工程发展趋势。
关键词: 纤维素酶 基因工程 进展
The Research Progress of Cellulase Gene Engineering
Li Wang Zhang Guangqin
(Henan University of Science and Technology，Luoyang 471003)
Abstract: Cellulase is an enzyme system which can decompose cellulose． The cellulase gene engineering develops quickly，be-
cause the natural cellulase can not satisfy the current requirement． This article has summarized cloning and expression of cellulase
genes，and the methods of cellulase gene cloning，such as constructing library，amplifying by PCR，artificial synthesis and macro ge-
nome amplifying． Also，the transform systems of cellulase gene are summarized and point out that the main trend of cellulase gene engi-
neering is constructing gene engineering bacteria，yeast expression system and eukaryotic expression．
Key words: Cellulase Gene engineering Progress
收稿日期:2011-03-28
基金项目:学校博士科研启动经费
作者简介:李旺，男，博士，讲师，研究方向:动物分子营养;E-mail:liwang@ mail． haust． edu． cn
纤维素是植物细胞壁的主要成分，主要来源于
植物(极少部分来源于微生物、藻类和背囊类昆
虫) ，由植物通过光合作用的方式将太阳能转化为
生物能并储存在植物体内，是地球上含量最高，最丰
富的可再生资源［1］，全球每年纤维素的生成量高达
2 000 亿 t［2］。纤维素在一定条件下可以被水解成
单糖，单糖可再通过不同途径生产各种产品，如饲
料、燃料、化工原料、食品及药品等［3］。
1 纤维素酶简介
纤维素酶(cellulase)是能够分解纤维素，最终
产生葡萄糖的一类酶。由于纤维素酶水解纤维素的
方法安全、环保、节能，故被广泛应用。事实上从纤
维素酶的研究应用至今，人们发现往往由 3 种纤维
素酶的作用才可将纤维素彻底分解为葡萄糖［4］。
故从狭义角度分，纤维素酶包括: (1)内切葡萄糖苷
酶(endo-1，4-β-D-glucanase，EG) ，这类酶作用于纤
维素分子内部的非结晶区，随机水解 β-1，4-糖苷键;
(2)外切葡萄糖苷酶(exo-1，4-β-D-glucanase，EC
3. 2. 1. 91) ，又称纤维二糖水解酶(cellobiohydrolase，
简称 CBH) ，这类酶作用于纤维素线状分子末端，水
解 β-1，4 糖苷键; (3)β-葡萄糖苷酶(β-glucosidase，
EC 3. 2. 1. 21，简称 BG) ，这类酶将纤维二糖水解成
葡萄糖分子［5，6］。
天然纤维素酶由于产量低，酶活性不高，或者纤
维素酶缺乏应用上的一些特性等原因，因此，随着分
子生物学和基因工程技术的发展，对纤维素酶分子
层面的研究也随之展开，并且在近年取得了丰硕的
研究成果［7］。
2 纤维素酶基因的克隆与表达
纤维素酶基因的克隆始于 20 世纪 70 年代，到目
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2011 年第 8 期
前为止人们已经从近百个物种中克隆到纤维素酶基
因，其中主要来自细菌和真菌。比如，从早期的芽孢
杆菌属(Bacillus sp． strain N-4)和木霉属(Trichoder-
ma longibrachiatum)扩增的纤维素酶基因［8，9］，到目前
从山茶内生孢子(Corbicula japonica)和青霉菌(Peni-
cillium)内扩增到的纤维素酶基因［10，11］。这些纤维素
酶基因有的被直接进行表达，有的进行了初步的改
造。早期的纤维素酶基因序列一直未被揭示，随着自
动测序仪和网络数据平台的出现和建立，使得这些纤
维素酶基因的序列被破解和共享。
到目前为止，已经有 7 000 多个纤维素酶基因
序列和相应的氨基酸序列被报道和公布，约有 500
多个纤维素酶的 3D 结构被预测，这些数据均公布
在 GenBank、EMBL 和 DDBJ 等共享数据库中。同
时，几乎所有克隆到的纤维素酶基因都实现了大肠
杆菌或者其他宿主的表达。如:来源于枯草芽孢杆
菌(Bacillus subtilis)的纤维素酶基因在毕赤酵母
(Pichia pastoris)中实现了表达［12］;来源于放线菌
(Thermobifida fusca)的纤维素酶基因 Cel6A 和
Cel6B在烟草(Tobacco)中进行了表达［13］;从白蚁
(Coptotermes formosanus)中克隆的纤维素酶基因在
大肠杆菌(Escherichia coli)中进行了表达等［14］。通
过大肠杆菌异源表达，证明了纤维素酶基因结构的
完整性，为将来在适宜的宿主中进行表达或者序列
测定以及基因改造等分子操作做好了准备。如将结
构功能完整的纤维素酶基因克隆到高效表达载体上
再进行异源表达，可以使纤维素酶的产量提高
数倍［14］。
3 纤维素酶基因克隆策略
纤维素酶早期的克隆方法多数是通过构建文库
来实现，如构建 DNA 文库和 cDNA 文库［15］。DNA
文库的建立是以出发物种的基因组为研究对象，通
过限制性内切酶的随机消化，将基因组随机消化为
大小不等的片段，通过回收一定大小的片段，将这些
片段随机插入到克隆载体上，经过一定的方法筛选
阳性克隆，并从中获得纤维素酶基因［9］。cDNA 文
库筛选则是采用差异杂交法或者异源杂交法利用相
关的基因片段制作 cDNA 探针，然后从 cDNA 文库
中筛选到纤维素酶基因［16］。这两种方法相对来说，
工作量大，但能够获得物种及其基因组较全面的
信息。
随着网络共享技术和基因合成技术的成熟，目
前的纤维素酶基因克隆方法更简单和直接。常用的
基因克隆方法有以下几种:人工合成法，即根据已报
道纤维素酶基因的核苷酸序列，人工合成目的基因
的核苷酸序列;特异性引物扩增法，即根据报道的纤
维素酶基因序列设计特异性引物在相同或相近的物
种上扩增目的基因的方法［17，18］。同时，随着宏基因
组概念的提出，许多目的基因可以通过特异性引物
从某一区域的宏基因组中克隆获得［19］。例如，在从
反刍动物瘤胃微生物种克隆纤维素酶时，便可设计
特异性引物从瘤胃微生物宏基因组中扩增纤维素酶
基因。
4 纤维素酶基因的转化系统
纤维素酶基因载体的选择根据目的基因的来
源、类型不同而不同。从载体类型来看，纤维素酶基
因的克隆选择一般的细菌质粒构建的载体即可满足
要求。质粒载体需要有一个稳定、便于检测的遗传
标记，目前常用的克隆载体均带有抗生素抗性基因
作为筛选标记，可以方便快捷地筛选到含有目标基
因的阳性克隆［20］。其他的标记如营养缺陷型标记、
细菌素标记等也在基因克隆过程中采用。在宿主选
择上作为克隆载体宿主时，由于大肠杆菌作为受体
菌有其公认的优点，因此，纤维素酶基因克隆载体宿
主菌主要是大肠杆菌(E． coli)。
纤维素酶基因的表达载体大部分也可以选择质
粒载体，质粒型表达载体成熟的宿主依然是大肠杆
菌，然而在用作表达宿主时，由于大肠杆菌很少分泌
蛋白质。因此现在许多学者把受体菌的研究工作转
移到了枯草芽孢杆菌(B． subtilis)、乳酸菌(Lactoba-
cillus)和酿酒酵母(S． cerevisiae)等［21 － 23］上。同时，
在进行纤维素酶基因表达的过程中，为了避免选择
性标记的存在，或者为了适应自然环境下无选择压
力的高效表达，整合型表达载体也越来越多的应用
在了纤维素酶基因的转化系统中。
5 纤维素酶基因工程
作为具有广阔应用前景的纤维素酶，要想实现
大规模生产和应用，就需要有相应的生产方法。基
因工程的发展为纤维素酶的生产提供了技术保证。
目前，纤维素酶基因工程主要有以下 3 个途径。
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2011 年第 8 期 李旺等:纤维素酶基因工程研究进展
5. 1 构建纤维素酶基因工程菌
具有分解纤维素能力的真菌大多数能够合成大
量的纤维素酶，但是真菌培养困难，发酵时间长，难
于大规模生产;细菌产纤维素酶水平低，但是培养简
单，生长速度快，发酵周期短。因此，理想的途径是
将真菌的纤维素酶基因克隆到细菌宿主中构建纤维
素酶细菌工程菌［24］。Rhee等［20］通过构建的质粒载
体，成功将外源基因通过电转化的方式转化到乳酸
菌(lactic acid bacterium)和凝结芽孢杆菌(Bacillus
coagulans)中，构建了重组细菌工程菌，并初步表达
了外源纤维素酶。
5. 2 构建纤维素酶的酵母表达系统
酵母表达系统具有将纤维素的最终分解产
物———葡萄糖转化为酒精的能力［25］，如果能将纤维
素酶系的基因克隆到酵母表达系统中，可以实现从
纤维素到葡萄糖再到酒精的完整发酵过程，成为纤
维素酶基因工程发展的一个重要方向［26］。Zhuge
等［12］成功将来源于细菌的纤维素酶基因转化到毕
赤酵母(Pichia pastoris)中，实现了原核细菌基因在
酵母中的表达。
5. 3 构建纤维素酶基因真核转化和表达系统
真核表达系统是近年用于表达外源基因新兴的
表达体系。由于其可以克服在原核表达系统中无法
进行特定翻译后修饰的缺陷，因此，成为生产具有生
物活性的真核生物蛋白的重要途径。例如，木霉
(Trichoderma reesei)不但其自身是纤维素酶合成的
重要物种，同时还是优良的外源基因表达系统，具有
成熟的批量发酵技术和较强的蛋白质胞外分泌能
力［27］。除此之外，Takashima 等［28］分别从腐质霉
(Humicola grisea)和木霉(Trichoderma reesei)中克隆
了纤维素酶基因，并分别将这些纤维素酶基因转化
到米曲霉(Aspergillus oryzae)中，实现这两个基因在
真核宿主中的高效表达，获得了异源纤维素酶，并对
纤维素酶进行了简单应用和酶学性质分析。
总之，随着生物技术的发展，纤维素酶基因
工程的发展也日新月异。为了更好地利用自然
界中丰富的纤维素资源，人们对纤维素酶的基因
工程研究还在持续。相信在不远的将来，会有大
量的纤维素酶基因被克隆，更先进的基因操作技
术被发明。
参 考 文 献
［1］Desvaux M． The cellulosome of Clostridium cellulolyticum． Enzyme
and Microbial Technology，2005，37(4) :373-385．
［2］Lynd LR，Weimer PJ，van Zyl WH，et al． Microbial cellulose utili-
zation:fundamentals and biotechnology． Microbiol Mol Biol Rev，
2002，66(3) :506-577．
［3］Sukumaran RK，Singhania RR，Mathew GM，et al． Cellulase pro-
duction using biomass feed stock and its application in lignocellulose
saccharification for bio-ethanol production． Renewable Energy，
2009，34(2) :421-424．
［4］Bhat MK． Cellulases and related enzymes in biotechnology． Biotech-
nology Advances，2000，18(5) :355-383．
［5］Bfuin P，Aubert JP． The biological degradation of cellulose． FEMS
Microbiology Reviews，1994，13(1) :25-58．
［6］Eveleigh DE，Mandels M，Andreotti R，et al． Measurement of sac-
charifying cellulase． Biotechnology for Biofuels，2009，2(21) :1-8．
［7］Sakamoto K，Toyohara H． Molecular cloning of glycoside hydrolase
family 45 cellulase genes from brackish water clam Corbicula japoni-
ca． Comparative Biochemistry and Physiology Part B:Biochemistry
and Molecular Biology，2009，152(4) :390-396．
［8］Gusakov AV，Sinitsyn AP，Gerasimas VB，et al． A product inhibi-
tion study of cellulases from Trichoderma longibrachiatum using dyed
cellulose． Journal of Biotechnology，1985，3(3) :167-174．
［9］Sashihara N，Kudo T，Horikoshi K． Molecular cloning and expres-
sion of cellulase genes of alkalophilic Bacillus sp． strain N-4 in
Escherichia coli． J Bacteriol，1984，158(2) :503-506．
［10］ Siddhanta AK，Prasad K，Meena R，et al． Profiling of cellulose
content in Indian seaweed species． Bioresource Technology，2009，
100(24) :6669-6673．
［11］Singh R，Varma AJ，Seeta Laxman R，et al． Hydrolysis of cellu-
lose derived from steam exploded bagasse by Penicillium cellulases:
Comparison with commercial cellulase． Bioresource Technology，
2009，100(24) :6679-6681．
［12］Zhuge B，Du GC，Shen W，et al． Expression of a Bacillus subtilis
pectate lyase gene in Pichia pastoris． Biochemical Engineering
Journal，2008，40(1) :92-98．
［13］Yu LX，Gray BN，Rutzke CJ，et al． Expression of thermostable
microbial cellulases in the chloroplasts of nicotine-free tobacco．
Journal of Biotechnology，2007，131(3) :362-369．
［14］ Inoue T，Moriya S，Ohkuma M，et al． Molecular cloning and char-
acterization of a cellulase gene from a symbiotic protist of the lower
termite，Coptotermes formosanus． Gene，2005，349:67-75．
［15］Yang CY，Ho YC，Pang JC，et al． Cloning and expression of an an-
tifungal chitinase gene of a novel Bacillus subtilis isolate from Taiwan
potato field． Bioresource Technology，2009，100(3) :1454-1458．
［16］Murray PG，Collins CM，Grassick A，et al． Molecular cloning，
transcriptional，and expression analysis of the first cellulase gene
35
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2011 年第 8 期
(cbh2) ，encoding cellobiohydrolase II，from the moderately ther-
mophilic fungus Talaromyces emersonii and structure prediction of
the gene product． Biochemical and Biophysical Research Commu-
nications，2003，301(2) :280-286．
［17］Schein M． Enzymatic properties of cellulases from Humicola inso-
lens． Journal of Biotechnology，1997，57(1-3) :71-81．
［18］Li W，Zhang WW，Yang MM，et al． Cloning of the thermostable
cellulase gene from newly isolated Bacillus subtilis and its expres-
sion in Escherichia coli． Molecular Biotechnology，2008，40(2) :
195-201．
［19］Rees HC，Grant S，Jones B，et al． Detecting cellulase and esterase
enzyme activities encoded by novel genes present in environmental
DNA libraries． Extremophiles，2003，7(5) :415-421．
［20］Rhee MS，Kim JW，Qian Y，et al． Development of plasmid vector
and electroporation condition for gene transfer in sporogenic lactic
acid bacterium， Bacillus coagulans． Plasmid，2007，58 (1) :
13-22．
［21］Hong J，Wang Y，Kumagai H，et al． Construction of thermotoler-
ant yeast expressing thermostable cellulase genes． Journal of Bio-
technology，2007，130(2) :114-123．
［22］Fu LL，Xu ZR，Li WF，et al． Protein secretion pathways in Bacil-
lus subtilis:Implication for optimization of heterologous protein se-
cretion． Biotechnology Advances，2007，25(1) :1-12．
［23］ Phan TTP，Nguyen HD，Schumann W． Novel plasmid-based ex-
pression vectors for intra- and extracellular production of recombi-
nant proteins in Bacillus subtilis． Protein Expression and Purifica-
tion，2006，46(2) :189-195．
［24］ Ohmiya K，Sakka K，Kimura T，et al． Application of microbial
genes to recalcitrant biomass utilization and environmental conser-
vation． Journal of Bioscience and Bioengineering，2003，95(6) :
549-561．
［25］Chen H，Jin S． Effect of ethanol and yeast on cellulase activity and
hydrolysis of crystalline cellulose． Enzyme and Microbial Technolo-
gy，2006，39(7) :1430-1432．
［26］Bansal P，Hall M，Realff MJ，et al． Modeling cellulase kinetics on
lignocellulosic substrates． Biotechnology Advances，2009，27(6) :
833-848．
［27］Mulakala C，Reilly PJ． Hypocrea jecorina (Trichoderma reesei)
Cel7A as a molecular machine:A docking study． Proteins，2005，
60(4) :598-605．
［28］Takashima S，Nakamura A，Hidaka M，et al． Molecular cloning and
expression of the novel fungal β-glucosidase genes from Humicola
grisea and Trichoderma reesei． J Biochem，1999，125(4) :728-736．
(责任编辑 马鑫
櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧
)
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［23］Sibbald MJ，Ziebandt AK，Engelmann S，et al． Mapping the path-
ways to staphylococcal pathogenesis by comparative secretomics．
Microbiol Mol Biol Rev，2006，70(3) :755-788．
［24］ Digiuseppe Champion PA，Cox JS． Protein secretion systems in
Mycobacteria． Cell Microbiol，2007，9(6) :1376-1384．
［25］Champion PA，Stanley SA，Champion MM，et al． C-terminal sig-
nal sequence promotes virulence factor secretion in Mycobacterium
tuberculosis． Science，2006，313(5793) :1632-1636．
［26］Wilhelm S，Kolmar H，Rosenau F． Bacterial secretion systems for use
in biotechnology:autotransporter-based ultra-high throughput cell-sur-
face display and screening of large protein libraries． Handbook of Hy-
drocarbon and Lipid Microbiology，2010，Part36:4587-4600．
(责任编辑 狄艳红)
45