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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2010 年第 6 期
利用简并引物克隆天山雪莲 sikPIP
基因片段及 RNAi载体的构建
孙辉 祝建波
(石河子大学生命科学学院 农业生物技术重点实验室，石河子 832003)
摘 要: 利用 NCBI、Bloekmaker、CODEHOP、Primer Premier 5. 0 等数据库和生物软件设计简并引物并利用简并引物 RT-
PCR，首次从天山雪莲中克隆到 474 bp的 PIP基因 cDNA片段，命名为 sikPIP，其与 GenBank中非洲杂交菊 PIP基因氨基酸序
列的同源性高达 93. 0%。从上述序列中选取 200 bp 的序列，利用 2 对同尾酶将正义片段和反义片段插入到植物表达载体
CAM2300-35S-Ocs中，成功构建天山雪莲 RNAi载体 CAM2300-35S-Ocs-sikPIP。为接下来的遗传转化，进一步探明 sikPIP基因
在天山雪莲中的功能奠定了基础。
关键词: 天山雪莲 sikPIP 简并引物 RNAi
Cloning of sikPIP Gene cDNA Fragment of S. involucrata Kar. et Kir.
by Degenerate Primers and Construction of RNAi Vector
Sun Hui Zhu Jianbo
(Key Laboratory of Agriculture Biotechnology，College of Life Science Shihezi University，Shihezi 832003)
Abstract: By using some internet databases and biological softwares such as NCBI，Blockmaker，CodeHop and Primer Premier
5. 0 to design degenerate primers and degenerate primers RT-PCR，a 474 bp fragment of PIP gene cDNA was acquired from S. involucra-
ta Kar. et Kir. for the first time and was named sikPIP. It presented a high homology of 93. 0% with PIP gene amino acid sequence of
Gerbera hybrid cultivar registered in GenBank. A 200 bp sequence was selected from the sequence and inserted its sense fragment and
anti-sense fragment to plant expression vector CAM2300-35S-Ocs，using isocaudarner，to construct a RNAi plant expression vector
CAM2300-35S-Ocs-sikPIP. The experiment makes preparation for the genetic transforming and understanging the function of sikPIP in
S. involucrata Kar. et Kir. ulteriorly.
Key words: S. involucrata Kar. et Kir. sikPIP Degenerate primers RNAi
收稿日期:2010-03-10
基金项目:国家“863”计划项目(2007AA021401) ，国家转基因重大专项(2008 ZX005-004)
作者简介:孙辉，男，在读硕士研究生，研究方向:生物化学与分子生物学;E-mail:doudouleyuan@ yeah. net
通讯作者:祝建波，男，研究员，从事植物基因工程研究;E-mail:1xdcom@ yahoo. com. cn
天山雪莲(S. involucrata Kar. et Kir.) ，属菊科凤
毛菊属(Saussurea DC)又名新疆雪莲、雪莲花、雪荷
花等。在新疆天山，它主要生长于海拔 2 400 －
4 100 m的高山草甸、高山冰碛石和悬崖峭壁石缝
等处。那里气候多变，冷热无常，雨雪交替，最高月
平均温 3 － 5℃，最低月平均温 － 19℃ － － 21℃［1］。
天山雪莲经过长期的恶劣自然环境选择，形成了稳
定的特殊结构、功能和遗传基因，产生了适应极端环
境条件下的生理和生化机制，人们认为这种与环境
相适应的机制可能与一般的耐冷、抗寒应答性的适
应机制不同，主要表现在其低温条件下能够正常的
生长发育;其抗寒原因之一是水孔蛋白(AQP)选择
性地高效转运水分子的作用，在低温时期快速地将
细胞水分排出细胞至细胞间隙或通过调节气孔排出
植株体外，从而避免了冰晶对细胞膜造成伤害。
水孔蛋白(AQP)是近年来发现的质膜和液泡
膜上专一性、高效性水分跨膜运输通道。特别是其
具有的水分运输活性可受细胞生理活动调节的特
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2010 年第 6 期
点，对于人们重新认识水分跨膜转运具有重要的意
义。目前，已在拟南芥、烟草等多种植物中发现了
AQP。根据氨基酸序列的同源性，将植物水孔蛋白
分为 4 类:质膜内在蛋白(PIPs) ，液泡膜内在蛋白
(TIPs) ，根瘤菌共生膜上的内在蛋白 NOD26
(NLMs)和小分子碱性内在蛋白(SIPs)。Arcoa
等［2］研究表明植物寒胁迫之后根部水分传导率回
复的可能原因是 AQP量和活性的增强，避免或修复
了膜的损伤。Jang等［3］研究表明，拟南芥 PIP2;5 基
因的表达受寒胁迫的正调控，而绝大多数 PIP 基因
受寒胁迫的负调控。
RNA 干扰(RNA interference，RNAi)现象是
1998 年由 Fire等［4］首先发现的，它是由内源性或外
源性双链 RNA 引起的强烈、特异的基因沉默，长的
双链 RNA(dsRNA)在植物体内被切成小的双链
RNA后可以促使 mRNA 特异性降解，进而高效、特
异地抑制生物体内特定基因的表达［5］。在拟南芥
中一些参与生长发育和生理代谢的基因如 AGA-
MOUS、CLAV-ATA3、APETALA1、PERIANTHIA 和
FAD2 等成功地被 RNA 干扰技术进行了功能抑
制［6，7］，其他植物如烟草、水稻等都观察到了 dsRNA
降低目标基因 mRNA 水平的现象［8，9］。Shisong
等［10］利用 RNAi对 TIP1;1 表达程度不同的拟南芥
株系研究发现 TIP1;1 对代谢物在液泡中和液泡膜
间的运输具有重要作用且碳的代谢受到了干扰。但
是利用此技术在进行天山雪莲 PIP类水孔蛋白表达
及功能方面的研究尚未见报道。
利用遗传密码的简并性设计简并引物，是克隆
蛋白质家族 cDNA 的常规方法［11］。本研究采用
CODEHOP(consensus degenerate hybrid oligonucleoti-
de primers)［12，13］，在线软件程序化设计简并引物，同
源克隆天山雪莲 sikPIP 基因片段，并以此为基础成
功构建 RNAi载体。
1 材料与方法
1. 1 材料
1. 1. 1 主要软件 NCBI(http:/ /www. ncbi. nlm.
nih. gov /) ;Blockmaker (http:/ /blocks. fhcrcorg /
blocks /make-blocks. html ) ;CODEHOP (http:/ /
blocks. fhcrc. org /blo-cks /codehop. html) ;Primer
Premier 5. 0;DNAstar.
1. 1. 2 植物材料 生长 20 d 左右的天山雪莲组培
苗的幼嫩叶片。
1. 1. 3 菌株和质粒 大肠杆菌为本实验室保存的
菌株 DH5α，所用质粒 pGM-T vector 购于宝生物工
程(大连)有限公司。
1. 1. 4 酶和试剂 Taq 酶、反转录酶(M-MLV)、连
接酶、Oligo (dT)、普通琼脂糖凝胶 DNA 回收试剂
盒等都购于宝生物工程(大连)有限公司，总 RNA
提取试剂 Trizol 购于 Invitrogen 公司，引物合成、序
列测定由上海生工生物工程技术服务有限公司
完成。
1. 2 方法
1. 2. 1 简并引物的设计 在 NCBI网站上对 PIP基
因进行搜索，选取与天山雪莲近缘物种的 15 个 PIP
基因氨基酸序列;登录 Blockmaker，对上述氨基酸序
列进行 Block比对，发现有 6 块保守性较强的区域;
最后将比对结果提交到 CODEHOP 服务器进行运
算，检索出 PIP 基因条简并引物。检索主要参数设
定:Maxmium core degeneracy:64，Target clamp tem-
perature:60. 0℃，genetic code:standard，codon usage
table:Gerbera hybrid cultivar。密码子选用框的备选
项如没有目标物种，则选用与目标物种亲缘关系较
近的物种，如本试验引物设计选用与天山雪莲亲缘
关系相对较近的非洲杂交菊(Gerbera hybrid culti-
var)。依据简并引物简并度尽可能小、Tm值尽可能
高且相近、上下游引物之距离尽可能大等原则，最后
利用 Primer Premier 5. 0 进行引物分析选择一对引
物，命名为 sikPIP-1、sikPIP-2 (表 1)。
表 1 引物序列
引物编号 引物序列
退火
温度
(℃)
简
并
度
sikPIP-1 TCTCCGGTGGTCACATCAAYCCNGCNGT 68. 6 32
sikPIP-2 CGATAAATGGACCGACCCARWANAYCCA 64. 2 32
sikPIP-F1
5′-CTCGAGATGGAGGGTA-
AGGAAGAAG-3′Xho I
55. 7 /
sikPIP-F2
5′-AGATCTAACAAGAAAGT-
GGCTATGAA-3′Bgl II
52. 9 /
1. 2. 2 RNA的提取 取天山雪莲 20 d组培苗幼嫩
叶片，参照 Invitrogen公司 Trizol 试剂盒提取样品总
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2010 年第 6 期 孙辉等:利用简并引物克隆天山雪莲 sikPIP基因片段及 RNAi载体的构建
RNA法提取总 RNA。
1. 2. 3 简并引物扩增天山雪莲 sikPIP 基因 cDNA
片段 以 oligo (dT)为引物将 RNA 反转录成 cD-
NA，再以设计好的引物 sikPIP-F1、sikPIP-F2 进行
RT-PCR扩增。PCR 参数设置:94℃ 3 min;94℃ 30
s;58℃30 s;72℃45 s，(30 个循环) ;72℃7 min。将
PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳、回收、连接、转化大
肠杆菌、阳性克隆鉴定、送上海生工测序，并利用
DANstar等生物软件简要分析其编码蛋白质的结构
特点。
1. 2. 4 RNA 干扰载体 pCMA2300-35S-Ocs-sikPIP
的构建 本试验使用的中间载体 pUCCRNAi有 2 对
同尾酶，即 Xho I 与 Sal I，Bgl II 与 BamH I，所以我
们只需要设计一对带有 Xho I，Bgl II 酶切位点的引
物。选择所克隆的 sikPIP 基因 cDNA 片段第 20 －
220 个碱基之间的 200 bp设计 dsRNA。为了方便将
该片段以特定的方向连接到载体上，在引物 sikPIP-
F1 和 sikPIP-F2 前加上用来定向的同尾酶酶切位点
(表 1)。以连接有 sikPIP 基因片段的 pGM-T 载体
为模板 PCR，得到正向片段。PCR 参数设置为 94℃
3 min;94℃ 30 s;48℃ 30 s;72℃ 30 s(30 个循环) ;
72℃7 min。
PCR产物命名为正向片段 sikPIP-F，连入 pGM-T
vector，获得重组载体 pGM-T-F。用 Xho I，Bgl II 同
时酶切中间载体 pUCCRNAi 和重组载体 pGM-T-F，
回收 pGM-T-F 的酶切小片段，连入 pUCCRNAi 中，
构成中间载体 pUCCRNAi-F。再用 BamH I 和 Sal I
酶切中间载体 pUCCRNAi-F，回收 pUCCRNAi-F 酶
切片段，与前 pGM-T-F 的酶切小片段相连，构成中
间载体 pUCCRNAi-F-R。用 Pst I单切质粒中间载体
pUCCRNAi-F-R 与植物表达载体 pCMA2300-35S-
Ocs，回收 pUCCRNAi-F-R 酶切小片段连入 pC-
MA2300-35S-Ocs 中，构建成表达载体 pCMA2300-
35S-Ocs-RNAi(图 1)。
Xho I与 Sal I，Bgl II与 BamH I为同尾酶
图 1 pCMA2300-35S-Ocs-sikPIP载体构建
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生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2010 年第 6 期
2 结果与分析
2. 1 天山雪莲总 RNA的提取
采用 Trizol法提取的天山雪莲总 RNA(图 2) ，可
以看出 28S的亮度是 18S 的 2 倍左右，5S 亮度微弱，
样品未发生明显的降解，可用于下一步反应。
2. 2 sikPIP基因片段的克隆
根据设计的引物 PIP-1 和 PIP-2 从天山雪莲
cDNA第 1 链中扩增出一段长为 474 bp的中间片段
(图 3) ，编码 157 个氨基酸，具有 2 个 PIP蛋白保守
NPA(天冬氨酸-脯氨酸-丙氨酸)氨基酸组单元(图
4)。将测序结果翻译成氨基酸，DNAstar 比对分析
表明，该片段与非洲杂交菊的 PIP 基因的同源性最
高，为 93. 0%(图 5)。
图 2 天山雪莲总 RNA琼脂
糖凝胶电泳
M. marker;1. sikPIPcDNA片段 PCR扩增产物
图 3 sikPIP基因片段 PCR扩增
划线部分为简并引物区，NPA为保守氨基酸组单元
图 4 sikPIPcDNA 片段序列及推测氨基酸序列
图 5 sikPIP氨基酸序列同源性 DNAstar比对结果
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2010 年第 6 期 孙辉等:利用简并引物克隆天山雪莲 sikPIP基因片段及 RNAi载体的构建
2. 3 RNAi表达载体的构建
2. 3. 1 中间载体 pUCCRNAi-F-R 的构建 利用引
物 PIP-F1、PIP-F2 进行 PCR 扩增得到长为 200 bp
的片段(图 6) ，连接 pGM-T vector;利用同尾酶 Xho I
与 Sal I，Bgl II 与 BamH I，将正向片段 pGM-T-F 分
别以正向和反向连入载体 pUCCRNAi，构成中间载
体 pUCCRNAi-F-R。利用 sikPIP-F1 进行单引物
PCR和 Pst I单酶切验证干扰片段连入载体(图 7，
图 8)。PCR和酶切结果证明中间载体 pUCCRNAi-
F-R构建完成(干扰片段 599 bp，中间为 199 bp 的
内含子结构)。
2. 3. 2 RNAi 植物表达载体 pCMA2300-35S-Ocs-
sikPIP 的构建 用 Pst I 单切质粒 pUCCRNAi-F-R
与表达载体 pCMA2300-35S-Ocs，回收 pUCCRNAi-F-
R酶切小片段连入 pCMA2300-35S-Ocs 中，构建成
表达载体 pCMA2300-35S-Ocs-RNAi。利用 Pst I 单
酶切验证，能够切出构成发夹结构的干扰片段(图
9) ，证明 RNAi干扰载体构建成功。
M. marker Ⅲ;1. PCR 扩增产物
图 6 引物 PIP-F1 与 PIP-F2PCR扩增
M，marker Ⅲ;1. Pst I酶切产物
图 8 载体 pUCCRNAi-F-R酶切鉴定
M. marker Ⅲ;1. pUCCRNAi-F-R扩增产物
图 7 pUCCRNAi-F-R单引物 PCR扩增
M. marker Ⅲ;1. Pst I酶切产物
图 9 载体 pCMA2300-35S-Ocs-sikPIP酶切鉴定
3 讨论
通过采用 CODEHOP 等软件设计简并引物，从
天山雪莲 cDNA 克隆出 sikPIP 基因片段，证明用
CODEHOP软件设计简并引物是可靠实用的，并为
分离 sikPIP全基因提供了可能。同时该简并引物的
成功应用也初步证实了其同源克隆 PIP 基因的
能力。
本试验克隆到的 sikPIP 基因 cDNA 片段长 474
bp，编码 157 个氨基酸，具有 2 个 PIP蛋白保守 NPA
氨基酸组单元，与非洲杂交菊 PIP 基因氨基酸序列
的同源性高达 93. 0%。天山雪莲是一种极耐低温
的抗寒植物，常年生长于高海拔的雪线附近。在经
受严酷的低温、缺氧、高辐射等逆境条件下，雪莲如
何保证水分正常运输，是一个值得深入研究的科学
问题。sikPIP基因 cDNA片段的克隆证实了水孔蛋
白(AQP)作为一种家族基因在天山雪莲中的存在，
为人们对该基因在天山雪莲中的表达及功能研究，
其与环境相适应的机制研究，例如，与一般的耐冷、
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抗寒应答性的不同适应机制等，打下了基础。
本试验选取 200 bp序列构建的 RNAi植物表达
载体是一个由 CAMV35S 组成型强启动子诱导的
hpRNA型载体。常用的 RNAi技术按介导方法包括
正义 RNA介导的共抑制、反义 RNA 介导的基因抑
制、病毒介导的基因沉默(VIGS)和 hpRNA 介导的
基因沉默［14］。研究表明植物中 RNA干扰表达载体
的最佳结构为能转录生成含有功能性内含子的发夹
RNA(intron-containiny hairpin RNA，ihpRNA)的载
体［15］。Fire等［4］发现 dsRNA能够比反义 RNA (siR-
NA)或正义 RNA 更有效地关闭基因的表达。hpR-
NA载体导入植物体后，在转录过程中产生 mRNA
发卡结构，发卡茎部形成稳定的 dsRNA诱导同源的
内源基因沉默，从而用来分析和研究植物基因的功
能，并改造基因的遗传特性。欲沉默一个基因家族
中的多个基因，则应尽量选取同源性高的部分作为
目的片段，一般认为，用于 RNA 干扰的基因片段长
度在 200 － 1 000 bp之间都能发挥抑制作用，究竟多
长的片段能引发最佳的 RNA干扰效果尚无定论，但
片段过长被认为可能引起非特异性沉默［15］。目前
已将构建好的 RNAi表达载体利用农杆菌浸染转入
天山雪莲，将对抗性植株的生物学性状及相关生理
指标的变化做进一步的研究。
参 考 文 献
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