全 文 ：研究报告
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2010年第 11期
大肠杆菌甘露糖异构酶 (M I )基因克隆及功能研究
高小倩 张春晓 陈晓波 王丽丽 仪宏
(河北科技大学生物科学与工程学院,石家庄 050018 )
摘 要 : 甘露糖异构酶 ( EC 5. 3. 1. 7, M annose isom erase, 简称 M I)能够催化果糖和甘露糖之间的异构转化。甘露糖加氢
催化形成甘露醇, 因此甘露糖异构酶的研究为工业生产甘露糖和甘露醇提供了新的可能途径。本研究以 E scherichia coli
JM109基因组 DNA为模板, PCR扩增 m i基因。结果表明,所克隆的 m i基因与 E. coli str. K12 substr. MG1655的 M I基因序列
一致性为 999% ,氨基酸序列一致性为 99%。该基因能够在 E. coli BL21( DE3)中进行高效诱导表达, 诱导出 51 4 kD的特异
性融合蛋白。酶学研究表明, 该酶最适反应温度为 37 ,最适 pH为 75,甘露糖为最佳反应底物,反应平衡时果糖与甘露糖的
比值约为 27。
关键词: 甘露糖异构酶 克隆 原核表达 酶活
TheM annose Isomerase Gene Cloning and
Function Analysis inEscherichia coli
GaoX iaoqian Zhang Chunx iao Chen X iaobo W ang L ili Y iH ong
(D epartment of B ioscience and Bioengineering,H ebei University of Science and T echnology, Shijiazhuang 050018)
Abstrac:t M annose isome rase ( M I, EC 531 7) can cata lyze fructose to m annose which is va luab le in m ann itol industr ia l pro
duction. The m annose isom erase gene o fE. co li JM 109 was successfully am plified by PCR reaction and we re cloned in to vecto r pET30a
( + ). The results show ed tha t the cloned m i gene had 999% identity w ith the m i gene ofE. coli str. K12 substr. MG1655, and the a
m ino acids sequence identity w as 99% . The fused pro te in ( 51 4 kD ) screened by SDSPAGE ge l show ed that it w as overexpressed in
E. co li BL21 ( DE3) when induced by IPTG. TheM I has the h ighest activ ity at 37 , pH 7 5. The optim um substrate was m annose
compared w ith fructose. The ratio of Dfructose and Dm annosew as abou t 2 7 when the reaction reached to the ba lance.
Key words: M annose isom erase C lone Induced express ion Enzym e activ ity
收稿日期: 20100526
基金项目:国家科技支撑计划项目 ( 2007BA I26B01)
作者简介:高小倩,女,硕士研究生,研究方向:植物分子生物学; Em ai:l gaoxiaoq ian1228@ 163. com
通讯作者:仪宏,教授, Em ai:l yihong laosh@i 163. com
甘露糖异构酶 ( EC 5317, M annose isom er
ase, 简称 M I)能够催化果糖和甘露糖之间的转化。
将甘露糖进一步还原, 可以转化为可广泛应用于医
药、食品等领域的甘露醇。目前工业生产甘露醇主
要以催化还原的法为主,即先将葡萄糖异构为果糖,
果糖经化学催化还原生产甘露醇,由于构象所决定,
果糖还原的同时会得到几乎等量的副产品 山梨
醇,山梨醇是一种较廉价的工业产品,市场价格只有
甘露醇的约 1 /6。因此从经济角度来说, 如何减少
副产物是甘露醇工业生产上面临的一个难题。本研
究通过对甘露糖异构酶的研究,以期通过甘露糖异
构酶将果糖转化为甘露糖 [ 1] , 进而加氢催化成为甘
露醇,减少副产物产生, 为甘露醇的工业生产提供一
条新的途经。
该酶最早于 1956年发现于嗜糖假单胞菌
(P seudomonas saccharoph ila )
[ 2]中, 并相继在甘蔗赤
条病菌 (Xanthomonas rubrilineans ) [ 3]、放射形土壤杆
菌 ( Agrobacter aerogenes ) [ 4 ]、链霉菌 ( Strep tomyces
aeroco lonigenes)
[ 5]和耻垢分枝杆菌 (Mycobacterium
sm egma tis)
[ 6]等微生物中发现。 1990年, A llenza等
从洋葱假单胞菌 (P. cepacia )中部分纯化了甘露糖
异构酶并将该酶固定化用于甘露糖生产 [ 7] , 日本
生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2010年第 11期
H irose等 [ 1]在 A. rad iobacter M 1中纯化出耐热的甘
露糖异构酶,已通过壳聚糖或戊二醛血清蛋白交联
固定化 A. radiobacter M 1细胞, 实现实验室内连续
14 d 55 时以果糖为原料生产甘露糖, 转化率为
20% - 23%, 14 d之后产率下降了 11% - 13%。
1993年 Takasak i[ 8]从土壤中分离得到一种耐热酶
M I的假单胞菌,该酶的最适反应温度为大约 60 ,
最适 pH80 - 85。果糖水平在 5% - 40%之间递
增时, 有大约 25%的 D果糖被转化为 D甘露糖。
2008年, Itoh等 [ 9 ]将大肠杆菌 (E. coli )和沙门氏菌
(Salmonella en terica )的 Y ihS基因在大肠杆菌中进
行表达,并证明 Y ihS基因所编码的蛋白是不依赖
辅因子的醛糖 - 酮糖异构酶, 并对其晶体结构进
行了研究。目前国内还未见有关甘露糖异构酶的
报道。
1 材料与方法
11 材料
111 菌株、质粒和培养基 E. coli JM 109和 E.
coli BL21( DE3)为实验室保藏菌株, 质粒 pMD18- T
载体购自 TaK aRa公司, 质粒 pET30a( + )购自 In
vitrogen公司。
大肠杆菌用 LB培养基培养, 含有质粒的大肠
杆菌在加入相应抗生素的 LB培养基中培养。
12 试验方法
121 PCR克隆 m i基因 根据 GenBank CP000948.
1序列设计引物,由北京赛百盛公司合成。上游引物
M I1(含 BamH 酶切位点 ): 5TCA GCA TCC ATG
AGG ATA AAA GGA ATG3,下游引物 M I2(含 Xho
酶切位点 ) : 5GCC GCT CGA GTT ATT TCG CAT
TAA TAT CCA G3。E. coli JM 109基因组参照文献
[ 10]进行,以该菌基因组总 DNA为模板, PCR扩增
甘露糖异构酶基因。PCR循环参数为: 94 , 4 m in;
94 , 45 s; 55 , 45 s; 72 , 45 s。共进行 30个
循环。
122 m i原核表达载体构建 将 m i基因的 PCR
产物克隆至 pMD18T载体上, 构建克隆载体 Tm i。
分别用 BamH 和 Xho 双切 Tm i和 pET30 a
( + )质粒, 回收相应片段连接构建原核表达载体
pETm ,i连接产物转化入 E. coli BL21 ( DE3) , 在
含有 50 g /mL卡那霉素的 LB培养基上筛选。
123 M I融合蛋白的诱导表达 在含有 50 g /
mL卡那霉素的 LB培养基中 37 过夜培养 E. coli
BL21( DE3) (含 pETm i质粒 ) ,次日按 5%的比例转
接入不含抗生素的液体培养基中,培养至对数生长
期加入 IPTG至终浓度 1 0 mmo l /L, 诱导表达 4
h。分别在诱导表达 0、1、2、3和 4 h时取样, 以便进
行 SDSPAGE电泳分析。
124 甘露糖异构酶的活性检测 采用 B randfo rd
法进行蛋白质定量 [ 11] , 半胱氨酸 -咔唑法 [ 12]和葡
萄糖试剂盒法测定酶活。
酶活力单位 ( U )定义为每小时催化产生 1 mg
果糖所需的酶量。
为了确保试验结果的准确性,进行酶活检测时
所有试验均重复 3次以上,以平均值作为最终结果。
125 甘露糖异构酶酶学性质的研究
1251 甘露糖异构酶最适温度的测定 取适量
的甘露糖异构酶, 分别加入终浓度为 01 mo l/L的
果糖及 TrisHC l( pH75)缓冲液, 然后将反应混合
物置于 25 、30 、37 、42 、50 和 60 下反
应 1 h, 沸水浴终止反应, 葡萄糖试剂盒法检测活
性。以粗酶的比活对温度作图。
1252 最适 pH的测定 取适量甘露糖异构酶,
加入终浓度为 01 mol /L 的果糖, 再分别加入
pH 55、pH60、pH70、pH75和 pH80( 20 mmo l/L
Tr isHC l)缓冲液。置 37 恒温反应 1 h, 沸水浴终
止反应,葡萄糖试剂盒法检测活性。以粗酶的比活
对 pH作图。
1253 酶反应底物的测定 取适量甘露糖异构
酶, 分别以的甘露糖和果糖为底物,反应体系为 200
L, 37 下反应 1 h,沸水浴终止反应, 测定活性, 以
粗酶的比活对不同底物作图。
1254 催化效率的测定 取适量的甘露糖异构
酶, 分别以终浓度为 01mol /L和 10mo l/L的果糖
为底物, 37 恒温 24 h。分别在 05、1、2、4、6、8、
10、12和 24 h时取样, 沸水浴终止反应, 检测活性。
以甘露糖的浓度对反应时间作图。
2 结果与分析
21 M I基因 PCR克隆
PCR产物经 1% (W /V )琼脂糖凝胶上电泳后,
结果见图 1。PCR扩增产物约为 1 273 bp, 与 Gen
220
2010年第 11期 高小倩等 :大肠杆菌甘露糖异构酶 (M I)基因克隆及功能研究
Bank核酸序列比对, 结果表明, 该序列属 E. coli基
因组序列, 且与不同 E. coli菌株的一致性都大于
94% , 特别是与 E. coli str. K12 substr. MG1655
D甘露糖异构酶基因一致性为 99%, 说明扩增产物
是正确的。
图 1 甘露糖异构酶 (m i)基因 PCR扩增结果
22 M I基因诱导表达
M I融合蛋白经 SDSPAGE电泳后, 结果如图 2
所示。含表达载体的 pETm i大肠杆菌未经诱导时,
诱导蛋白量很低 (图 2,第 2泳道 ) ,而加入 1mmo l /L
的 IPTG诱导表达后, 出现了诱导表达的蛋白, 分子
量约 514 kD(图 2,第 3- 6泳道 ),而且随着诱导时
间的延长,诱导蛋白的表达量也在不断增加。而只
含有表达载体而不含有 M I基因的大肠杆菌, 在未
经 IPTG诱导和诱导表达 4 h后, 514 kD的融合 M I
蛋白都未出现 (图 2, 第 1, 7泳道 ), 但 IPTG诱导表
达 4 h后, 出现了一条小分子量的诱导蛋白 ( 81
kD) ,这是因为在 pET30a表达载体上, 在 T7启动
子之后,包含一段 222 bp的 DNA序列, 在 IPTG诱
导后, 会合成一条含有 74个氨基酸的小肽, 如图 2
第 7泳道所示。
23 M I的酶学性质
M I在 E. coli中诱导表达的目的是为了将来能
用于工业生产,因此, 对该诱导蛋白进行了基础酶学
分析, 如酶的最佳反应温度、最适底物、最适
pH值等。
231 温度对 M I活性的影响 对获得的粗酶液
进行了最适温度的测定,结果如图 3所示。本研究
M. Protein m arker; 1. E. col i BL21 (DE3) /pET30 a( + ) ;
2 - 6. E. coli BL21 (DE3) /pETm i经 10mm ol/L IPTG诱
导 0, 1, 2, 3, 4 h; 7. E. coli BL21 ( DE3 ) /pET30 a( + )经
10mmol /L IPTG诱导 4 h
图 2 M I在大肠杆菌诱导表达结果
中所获得的 M I的最适温度约为 37 。从图 3中可
以看出,从室温至 37 时酶活缓慢上升,由 848 U /
mg上升至 1052 U /mg, 但超过 37 ,酶活则开始下
降, 如在 42 时, 酶活为 37 的 916%, 而且, 随着
温度的上升, 酶活损失越严重, 在 60 时, M I活性
仅为 37 的 144%。该结果表明, M I的热稳定性
较低。
图 3 不同酶反应温度下的酶活
232 pH对 M I活性的影响 以终浓度为 01
mo l/L的甘露糖为底物,在该酶的最适温度 37 下进
行最适 pH的测定。结果如图 4所示,在 pH55- 70
范围内,酶活随 pH值的增加活性增高,在 pH70 -
75时酶活上升至最高点后开始下降, 在 pH75 -
80时酶活急剧下降, M I的最适 pH约为 75。
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生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2010年第 11期
图 4 M I的最适 pH
233 M I最适底物 甘露糖异构酶能够催化甘
露糖和果糖的相互转化, 但转化速率却不相同。通
过测定在 37 , pH 75条件下不同底物浓度的粗酶
液比活力,得知, 以甘露糖为底物的比活力是以果糖
为底物时的近 2倍 (图 5所示 ), 因此甘露糖为此酶
的最佳底物。
图 5 M I的最适底物
234 M I的催化效率的研究 研究发现, 在反应
酶量一定的条件下, 底物果糖的浓度为 01 mo l /L
( 18mg /mL)和 10 mol /L ( 180 mg /mL ), 达到平衡
的时间分别约为 2 h和 8 h,此时生成的甘露糖的浓
度分别为 0027 mo l/L ( 476mg /mL)和 027 mo l /L
( 4848 mg /mL)。发现得到的产物的量基本呈 10
倍的关系, 而到达平衡的时间仅为 4倍关系, 即底
物浓度越大反应速率越快。平衡时果糖与甘露糖
的比值约为 27, 即有近 27% 的果糖转化为
甘露糖 (图 6)。
图 6 不同底物水平下 M I的催化效率
3 结论
以 E. coli JM 109基因组总 DNA为模板克隆了
m i基因,其序列与 E. coli str. K12 substr. MG1655m i
基因序列相比有两个碱基的突变。通过对其酶活性
的研究表明,该酶最佳反应温度为 37 ,最佳 pH为
75, 对不同底物显示出不同的催化能力, 以甘露糖
为底物时甘露糖异构酶的活性最大, 以果糖为底物
时的酶活为其 30%, 与 Heyferguson等 [ 6 ]报道的一
致。达到平衡时果糖的转化率约为 27%,比 Takasa
k i等 [ 8]报道的 25%略高。
鉴于甘露糖异构酶对甘露糖和甘露醇工业生产
中的重要性,我们将进一步对 m i基因进行突变, 筛
选活性高、热稳性强的酶。
参 考 文 献
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