全 文 ：生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN·研究报告· 2008年第1期
收稿日期:2007-11-06
基金项目:国家自然科学基金项目资助(编号:30370032,30770069)和教育部高等学校博士学科点专项科研基金项目
(编号:20060028001)资助
作者简介:邱服斌(1968-),男,博士,研究方向:植物微生物学;刘琳(1983-),女,硕士研究生,研究方向:植物-微生物相互作用;两作者对本文
有同等贡献
通讯作者:宋未,研究员,研究方向:植物-微生物相互作用,E-mail:songwei@mail.cnu.edu.cn
高等植物细胞共有 3个基因组,即核基因组、叶绿体基因组和线粒体基因组,后两组称为核外基因。植
物线粒体 DNA(mitochondriaDNA,mtDNA)分子大小从 100kb到 2.5Mb不等,可以编码 5SrRNA、18SrRNA、
26SrRNA的基因;叶绿体 DNA(chloroplastDNA,cpDNA)可以自身编码其全部的 RNA(23S、16S、5S)。编码
线粒体18SrRNA和叶绿体16SrRNA的基因相对于整个植物基因组来说是高度保守的[1]。1905年,Constantin
Mereschkowsky最先提出叶绿体是由原先的内共生体形成的这一观点[2],随后 20世纪 20年代 IvanWalin提
出了对线粒体的相同观点[3]。1970年美国生物学家 L.马古利斯(LynnMargulis)利用许多古微生物学、地质
有机化学和生物化学的资料,分析了原核生物与真核生物之间的不连续性,在此基础上重新提出了单细胞
真核生物的内共生学说(Endosymbiotictheory),并于 1981年正式出版《细胞进化的共生现象》(Symbiosisin
CelEvolution)[4]。根据这个学说,叶绿体和线粒体起源于内共生于真核生物细胞中的原核生物。这种理论
人参细胞器核糖体小亚单位DNA的PCR扩增与序列测定
邱服斌 1,2 刘琳 1 宋未 1
(1首都师范大学生命科学学院,北京 100037;2山西医科大学公共卫生学院,太原 030001)
摘 要: 采用 CTAB法提取了人参(Panaxginseng)根基因组 DNA,根据植物叶绿体 16SrDNA和线粒体18S
rDNA与细菌16SrDNA序列具有高度同源性,用扩增细菌 16SrDNA的一对通用引物(8f,1492r)扩增了人参细胞器核
糖体小亚单位DNA。对扩增产物进行了克隆与测序,经多序列比对,扩增片段分别与已知植物叶绿体16SrDNA和线粒
体18SrDNA具高度同源性,表明该对引物可以用来扩增绝大多数植物细胞器核糖体小亚单位DNA,可以作为鉴定植物
叶绿体16SrDNA和线粒体18SrDNA的一种基本实验技术。
关键词: 人参 叶绿体16SrDNA 线粒体18SrDNA PCR
AmplifyingandSequencingofSSUDNAinPanax
ginsengOrganeles
QiuFubin1,2 LiuLin1 SongWei1
(1ColegeofLifeSciences,CapitalNormalUniversity,Beijing100037;2SchoolofPublicHealthofShanxiMedical
University,Taiyuan030001)
Abstract: ThetotalDNA wasextractedfrom rootsofPanaxginseng.Accordingtothesequencehomology
betweenbacterial16SrDNAandsmalsub-unitribosomeDNA(SSU rDNA)inplantorganeles,apairofbacterial16S
rDNAprimers(8f,1492r)wasselectedtoamplify16SrDNAinplastidand18SrDNAinmitochondriaofPanaxginseng
directly.ThePCR productsabout1.5kband1.9kbwerepurifiedandclonedtoT-easyvectorseparately,andthe
segmentsweresequenced.Theresultsshowedthat1.5kbsequencehadsignificanthomologywithchloroplast16SrDNA
and1.9kbwithmitochondria18SrDNAinplantorganeles.Itcouldbeconcludedthatthepairofprimersandmethod
couldbeusedtoamplifySSUrDNAinorganelesofplants.
Keywords: Panaxginseng Chloroplast16SrDNA Mitochondria18SrDNA PCR
2008年第1期
认为线粒体起源于好氧性细菌(很可能是接近于立克次体的变形菌门细菌),而叶绿体源于内共生的光合
自养原核生物蓝藻,目前已经被广泛接受。近年来发现用 PCR扩增细菌 16SrDNA的方法研究植物内生细
菌,常常受到植物细胞器 DNA的严重干扰,推测是由于植物细胞器核糖体 DNA与细菌核糖体 DNA的高
度同源性所致。本研究探索了采用扩增细菌 16SrDNA的一对通用引物扩增人参线粒体 18SrDNA和叶绿
体 16SrDNA,通过与已知植物细胞器核糖体小亚单位 DNA的多序列比对,进一步证实扩增的 DNA为目的
DNA片段。
1 材料和方法
1.1 材料
健康人参(Panaxginseng)样品于 2006年 6月采自中国医学科学院药用植物研究所药材试验地。样品
经自来水冲洗,凉干后称重,-70℃冷冻保藏;LongTaqDNA聚合酶及感受态细胞 TOP10均购自天根公司
(Tiangen);引物 8f、1492r、SP6、T7由上海生工生物工程技术服务有限公司合成;凝胶纯化回收试剂盒(Wizard
SVGelandPCRClean-upSystem,Promega)及 pGEM-TEasy载体均购自 Promega公司。
1.2 人参根基因组 DNA的提取
参照 Dolye等[5]、Makoto等[6]和谢中稳等[7]方法进行。取 1g表面灭菌的人参根置无菌研钵中,加入适量
液氮将其研磨成粉末;加入 9mlCTAB抽提缓冲液 (2%CTAB;100mMTris-HClpH8.0;1.4MNaCl;20mM
EDTA;1.5%polyvinyl-pyrolidone,PVP;0.5%2-mercaptoethanol)充分混匀,60℃水浴 45min,加入等体积的酚/
氯仿/异戊醇(25:24:1),室温 8000r/min离心 10min。取上清液,加入等体积的氯仿/异戊醇(24:1),充分混
匀后 8000r/min离心 10min。取上清液加入 2/3体积冰冷异丙醇混匀,-20℃放置 30min,4℃12000r/min离
心 5min,弃上清液,沉淀用 70%的乙醇脱盐离心,弃上清自然风干,DNA溶于无菌双蒸水中,-20℃保存。
1.3 线粒体 18SrDNA和叶绿体 16SrDNA的 PCR扩增
用扩增细菌 16SrDNA的通用引物(8f,1492r)扩增人参线粒体 18SrDNA和叶绿体 16SrDNA。引物序
列分别为:8f(5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3)[8],1492r(5-GGTTACCTTGTTACGACTT-3)[9]。PCR扩增体
系(50μl):1.5μl经 100倍稀释的基因组 DNA,2.5mmol/LdNTP混合物,10pmol/μl正、反向引物,2.5ULong
TaqDNA聚合酶,5μl反应缓冲液(10×bufer)。PCR反应条件:94℃预变性 5min;94℃1min,48℃2min,72℃
3min,30个循环;72℃延伸 10min。
1.4 目的片段的纯化、克隆、转化和测序
在切胶仪上分别将 1.5kb和 1.9kb左右的条带切下,用 Promega公司的凝胶回收纯化试剂盒回收得到
纯化片段。按 pGEM-TEasy载体试剂盒操作指南,分别将两个目的片段与 pGEMT-Easy载体连接,连接产
物转入感受态细胞 TOP10进行蓝白筛选。挑取 2～3个白斑,用 pGEM-TEasy载体克隆位点两端的引物 SP6
和 T7序列进行菌落 PCR扩增鉴定阳性克隆。扩增得到长度分别约为 1.6kb和 2.0kb的目的片段 (载体两
端的序列长约 100bp),阳性克隆菌株由上海生工生物工程技术服务有限公司测序。
1.5 序列分析
将测序得到的序列提交到 NCBI进行 blastn比对,并与 NCBI数据库中有关植物细胞器 DNA全序列中
核糖体小亚单位的 rDNA序列一起用 ClustalX进行多序列比对。
2 结果与分析
2.1 人参基因组 DNA的提取和 PCR扩增
本实验采用略加修改的 CTAB(cetyltrimethylammoniumbromide)法[5~7]提取植物基因组 DNA,取得了比较
满意的结果,提取的 DNA可直接用于 PCR扩增。采用细菌 16SrDNA的通用引物 8f-1492r扩增人参基因组
DNA,得到长度为 1.5kb和 1.9kb的目的片段(图 1)。经克隆转化后,用引物 SP6和 T7进行 PCR扩增得到
的目的片段长度为 1.6kb和 2.0kb(图 2)。Sessitsch等(2002)以 8f～518r为引物构建马铃薯内生细菌的 16S
邱服斌等:人参细胞器核糖体小亚单位DNA的PCR扩增与序列测定 125
生物技术通报Biotechnology Buletin 2008年第1期
rDNA克隆文库时,得到的 400个阳性克隆中主要是线粒体和叶绿体核糖体小亚单位 DNA,只有 13个克隆
为细菌的 16SrDNA,高浓度的植物细胞器核糖体 DNA是影响非培养方法研究植物内生细菌的主要障碍[10]。
用 8f-1492r这对引物扩增人参线粒体 18SrDNA片段长度约为 1.9kb,远大于人参叶绿体 16SrDNA和细菌
16SrDNA片段长度(约为 1.5kb)。本研究从两个文库中各选了3个阳性克隆进行鉴定,结果均分别为人参叶
绿体16SrDNA和人参线粒体18SrDNA的序列,所以该实验方法可以很大程度上排除人参内生细菌的干扰。
图 1 叶绿体 16SrDNA和线粒体 18SrDNA扩增产物
1～3PCR扩增产物
图 2 叶绿体 16rDNA和线粒体 18SrDNA克隆扩增产物
1～3线粒体 18SrDNA克隆扩增产物
4～7叶绿体 16SrDNA克隆扩增产物
2.2 序列分析
GenBank中尚未见人参线粒体 18SrDNA的序列报道,但已报道了 12个维管植物的线粒体 DNA全长
序列,其中线粒体 18SrDNA长度从 1890～1970左右不等。将克隆测序得到的 18SrDNA序列(1891bp)
(NCBI登录号:EF550996)与 NCBI上已报道 12个维管植物的线粒体全长序列中的 18SrDNA序列用
ClustalX进行多序列比对分析 (图 3),发现它们具有极高的相似性,可以推定所测序列就是人参线粒体
18SrDNA,而且在所测定的人参线粒体 18SrDNA序列中,上游 16～35nt中只有第 29位核苷酸缺少一个碱
基 C,其余序列与正向引物 8f序列完全一致,下游 1980～1998nt与反向引物 1492r完全反向互补;其它维
管植物的线粒体 18SrDNA序列中,有 7个第 16位核苷酸序列为 T,与正向引物 8f的碱基 A互补,T.
aestivum(AP008982)第 16～21位核苷酸序列空缺,但是此后的核苷酸序列与 8f完全一致;而 12个维管植
物线粒体18SrDNA序列下游1980～1998nt
核苷酸碱基序列与反向引物 1492r完全反
向互补。根据 PCR引物设计要求,引物 3
端的序列与模板 DNA能够复性结合就可
以用来扩增该模板 DNA,因此根据已知的
序列信息,可以推测 8f～1492r这对引物可
以用来扩增大多数植物线粒体 18SrDNA。
同样将克隆测序所得的 16SrDNA序
列 (1449bp)(NCBI登录号:EF550997)与
GenBank中已发表的人参叶绿体 DNA全
长(AY582139)的 16SrDNA进行序列比
对,除上游第 16位核苷酸序列和下游第
1459位核苷酸序列不同外,其余核苷酸
序列完全一致,可以确定该目的片段就是
叶 绿 体 16SrDNA。 同 时 将 该 序 列 与
GenBank公开发表的几种维管植物的 16S
图 3 人参样品与 12个维管植物线粒体 18SrDNA多序列比对结果
序列上方数字代表自上游核苷酸位置,“·”代表与人参 mt18SrDNA
相同的核苷酸序列
图 4人参样品与 7种维管植物叶绿体 16SrDNA多序列比对结果
序列上方数字代表自上游核苷酸位置,“·”代表与人参 cp16SrDNA
相同的核苷酸序列
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rDNA序列用 ClustalX对序列进行多序列 Alignment分析(图 4),结果发现 8f～1492r这对引物与绝大部分
植物叶绿体 16SrRNA基因序列完全匹配,因此 8f～1492r这对引物也可以用来扩增人参叶绿体 16SrRNA
基因。
3 讨论
16SrDNA是原核生物核糖体 16SrRNA的编码基因,是细菌分类鉴定中最为重要的分类标准之一,但
由于植物叶绿体 16SrDNA和线粒体 18SrDNA的序列同细菌 16SrDNA高度同源[13],所以用核糖体 DNA分
析方法研究植物内生细菌多样性时往往受到植物细胞器核糖体 DNA的严重干扰。也曾有学者提出用扩增
细菌核糖体 DNA的引物应该可以扩增得到植物叶绿体 16SrDNA和线粒体 18SrDNA[3,14],但尚未见有研究
证实报道。本研究经过鉴定排除了人参内生细菌的影响成功扩增得到了人参叶绿体 16SrDNA和线粒体
18SrDNA。根据文献报道,用 799f-1492r引物扩增了水稻和人参植物内生细菌的 16SrDNA,又可成功地避
开植物细胞器小亚单位核糖体 DNA的干扰[10~12]。
用扩增细菌的通用引物 8f～1492r扩增人参细胞器核糖体小亚单位 DNA,分别从两个目的片段的克隆
文库中挑选了 3个阳性克隆进行鉴定,经过与 GenBank中已报道的序列进行对比,结果证实均分别为人参
叶绿体 16SrDNA和人参线粒体 18SrDNA的序列,目的片段长度分别为 1449bp和 1891bp,而且通过序列
比对分析,可以确定该方法适用于扩增大多数绿色植物叶绿体 16SrDNA和线粒体 18SrDNA,因此该方法
可以在免于提取植物叶绿体和线粒体细胞器的情况下,作为鉴定植物叶绿体 16SrDNA和线粒体 18S
rDNA的一项基本实验技术,有助于对植物细胞器核糖体 DNA的深入研究。
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