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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2011年第 1期
血管紧张素转换酶的克隆及序列分析
刘淑集1, 2 单超 3 吴成业 1 王宗华 3 王茵 1 刘智禹 1
( 1福建省水产研究所, 厦门 361012; 2福建农林大学食品科学学院, 福州 350002; 3福建农林大学生命科学学院,福州 350002)
摘 要: 根据 GenBank上公布的小鼠血管紧张素转换酶 ( ACE)基因序列, 经多重比较设计 1对特异性引物, 从小鼠
Ba lb /c肺部组织中提取总 RNA, 进行 RT-PCR。产物经纯化回收, 克隆到 pMD-18T载体,转化大肠杆菌 DH 5A感受态细胞,检
测阳性克隆、测序并进行序列分析。测序结果显示, 该片段全长 4 023 bp, 开放阅读框 ( ORF )包含 3 985 bp, 编码 1 328个氨基
酸, 相对分子质量为 152177 kD,等电点 6. 35。此序列与 GenBank已登录的小鼠 ACE同源性达 99% , 差异的 5个碱基位于基
因的非关键部位,说明小鼠 ACE成功克隆。经同源性比较分析, 达 50%以上相同性的物种有 17个,且符合种属之间的进化关
系。因此, 该序列可于研究物种亲缘关系或遗传距离的理想标记, 为下一步研究其在酵母中的表达、生物活性和应用奠定了
一定的基础。
关键词: 血管紧张素转换酶 克隆 序列分析
Cloning and Sequence Analysis of Agiotensin Converting Enzyme
L iu Shuji
1, 2 Shan Chao3 W u Chengye1 W ang Zonghua3 W ang Y in1 L iu Zh iyu1
(
1
Fisheries Research Institute of Fujian, X iamen 361012;
2
Co llege of Food Science, Fujian A griculture and Forestry
University, Fuzhou 350002;
3
Schoo l of L ife Science, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou 350002)
Abstrac:t One pa ir o f pr ime rs to am plify the gene o f ag iotensin converting enzyme w as designed and synthesized acco rd ing to the
published resu lts of ACE sequence in G enBank. The production o f RT-PCR w as pur ified and c loned into pMD-18T vector, then conve r-
ted to competent cell of theE. co li DH5A. Positive plasm idsw ere se lected and the sequencew as ana lyzed. The consequence showed that
the sequencew as compr ised a fragm ent o f 4 023 nucleo tides, includ ing a ORF o f 3 985 nuc leotides, encod ing 1 328 am ino ac ids. The
m olecularw e ightw as 1521 77 kD and pIwas 6. 35. The nucleotide hom o logy be tw een the sequence and the pub lished mouse sequence in
GenBank reached up to 99% , only 5 nuc leo tides m utan t in the un important areas, approv ing that the gene ACE o f m ouse had been
cloned successfu lly. The homo logy and phy logenetic ana lys is o f sequences revea led that therew ere 17 spec ies w ith m ore than 50% iden-
tity compared w ith the sequence, suggesting that ACE is conserved through the evo lution process. The clon ingw ou ld fac ilitate the further
research on the expression in yeast, b io activ ity and application o fACE.
Key words: Ag io tensin converting enzyme C lone Sequence ana lys is
收稿日期: 2010-06-09
基金项目:福建省自然科学基金项目 ( 2008 J0251)
作者简介:刘淑集,女,博士研究生,助理研究员,研究方向:海洋生物学利用; E-m ai:l cute506636@ 163. com
通讯作者:吴成业,男,研究员,研究方向:水产品加工利用; E-m ai:l w cy@ f jscs. ac. cn
血管紧张素转换酶 ( ang io tensin converting en-
zyme, ACE )最早是在 1954年 Skeggs从马血中发现
的,又称肽酰基二肽水解酶,几乎存在于所有哺乳动
物的组织和体液中,主要存在于肺、脉管系统内皮细
胞、肾脏、心脏、小肠、睾丸和子宫等。ACE参与调
节许多哺乳动物生物活性肽的特异性成熟或降
解 [ 1] ,是肾素 -血管紧张素系统 ( renia l ang iotensin
system, RAS)的重要组成部分, 对血压、电解质和体
液平衡、心血管系统发育和结构重塑起重要调节作
用 [ 2, 3]。ACE可以将 RAS系统中十肽的血管紧张
素 I( ang io tensin I)的 C端水解, 转变成具活性的八
肽血管紧张素 Ò ( ang iotensin Ò ) [ 4] ,导致血压升高;
也能够使激肽释放酶 - 激肽系统 ( kallikre in-k in in
system, KKS)中的缓激肽 ( bradyk in in)的 C端水解失
活, 使血管收缩引起血压升高 [ 5]。Bernstein等 [ 6]研
究发现 ACE除了具有降血压的功能外,还能在巨噬
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细胞中高水平表达且能产生强大的抗癌反应。目
前, ACE已成为筛药物及疫苗的靶点 [ 7]。然而,
ACE的活性受荷尔、ACE抑制剂和内皮细胞的生长
状态的动力学调节 [ 8]。 Soub fier等 [ 9]、Hubert等 [ 10]
先后在 1988年、1991年成功地克隆了人体 ACE基
因。人 ACE基因位于染色体 17q23上, 编码 1 306
个氨基酸 [ 11]。目前老鼠全基因测序工作的完成,发
现了老鼠基因组含有 ACE序列。因此, 本试验对
小鼠 ACE基因进行克隆与序列分析, 旨在为下一
步构建 ACE毕赤酵母表达载体, 研究 ACE的表达
情况,深入开展 ACE分子生物学特性及功能研究
奠定基础。
1 材料与方法
111 材料
供试菌株:大肠杆菌 (E scherichia coli) DH5A由
福建农林大学真菌实验室保存。供试动物: 小鼠
Balb /c。克隆载体与试剂:载体 pMD-18T V ecto r(图
1), N otÑ、SnaBÑ、ExTaq DNA 聚合酶及缓冲液、
dNTPs、氨苄青霉素 ( Amp)购自 TAKARA 公司。
TRN zo l总 RNA提取试剂盒、DL 2000 M arker购自
T IANGEN公司。第一链 cDNA 合成试剂盒购自
Promega公司; PCR产物割胶回收试剂盒购自 A xy-
gen公司;琼脂糖为 Oxo id公司产品; 其余试剂除另
有注明外,均为国产分析纯或化学纯。
图 1 pMD-18T载体图
112 总 RNA的提取
断颈法杀死小鼠, 解剖取其肺部, 放入到研钵
中,加入少许液氮研磨, 匀浆。加入 210mL TRIZOL
试剂,并用吸头混匀细胞悬液, 转移至 2 mL的 EP
管中, 室温静置 5m in,加入 012mL酚 B氯仿B异戊醇
( 25B24B1) ,盖好 EP管,用手快速摇动 15 s, 然后静
置室温 2- 3 m in; 4e , 12 000 r/m in, 离心 15m in,取
上层无色水相层 (RNA溶于此层 ),将其转移至一新的
115mL EP管中;加入等体积的氯仿B异戊醇 ( 24B1),摇
匀, 4e , 12 000 r/m in, 离心 15 m in, 取上清至新的
115mL EP管中, 加入 016倍体积的异丙醇,轻摇均
匀, 置 - 20e 不少于 30 m in后, 4e , 12 000 r/m in,
离心 10 m in,除去上清后,用 75%乙醇洗 RNA沉淀
2- 3次, 4e , 12 000 r/m in, 离心 3 m in,除去乙醇,
于无菌环境风干 RNA沉淀 (不可太干,否则 RNA很
难溶解 ), 用 40 LL DEPC 处理的双蒸水溶解 RNA
沉淀,置 - 80e 冰箱中备用。
113 引物设计
根据已报道的 ACE基因全序列, 选择保守的区
域, 利用软件 Primer Prem ier 510设计 ACE全长基因
的特异性引物, 由 Inv itrogen公司合成。上游引物
为: 5c-GCTACGTAATGGGGGCCGCGTC-3c;下游引物
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为: 5c-ATGCGGCCGCTTAATGATGATGATGATGGTG-
GGAGTGTCTGAGCTCCACCTC-3c。在上游引物中
加入 SnaBÑ酶切位点, 在下游引物中加入 N ot I酶
切位点,并将 ACE基因的终止密码子突变掉,在其
后加入 6 @H is标签,然后再加入终止密码子。
114 RT-PCR
11411 第一链 cDNA合成 按照 Promega公司反
转录试剂盒操作: 取一个经 DEPC处理过的 PCR
管,加入提取的总 RNA110 LL, O ligo ( dT ) 15 primer
110 LL, 用 Nuclease-free w ater 稀释 到总 体积
510 LL, 70e 加热 5 m in后迅速置冰上 5 m in, 加入
M gC l2 ( 25 mmo l /L ) 310 LL, 5 @ React ion Buffer
410 LL, dNTP M ixture( 25 mmo l/L ) 110 LL, RN asin
R ibonuclease inhibitor 015 LL, Reverse T ranscriptase
110 LL,用 Nuclease- free w ater补至 1510 LL, 25e 反
应 5 m in, 42e 反应 50 m in, 70e 加热 15m in后置于
冰上, 即获得第一链 cDNA。
11412 PCR扩增 PCR扩增体系: 取 110 LL cDNA
为模板,加入 10 @ExPCR Buffer 510 LL, dNTPM ixture
( 25mmo l/L ) 410 LL, ExTaq 015 LL, 反义链 110 LL,
正义链 110 LL, ddH2O 3715 LL至总体积 5010 LL。
反应程序: 94e 预变性 3 m in, 94e 变性 30 s, 52e 退
火 45 s, 68e 延伸 4 m in, 共 30个循环,最后 68e 延
伸 8 m in, PCR产物于 4e 保存。
115 PCR产物的克隆及测序
RT-PCR产物经 1%琼脂糖凝胶电泳 ( TBE缓冲
液 )分离后, 切胶回收。用 PCR产物割胶回收试剂
盒纯化符合预测长度的电泳条带, 并将纯化后的反
应产物连接于 pMD-18T载体。操作按说明书进行,
即加入 DNA 210 LL, pMD-18T vector 015 LL, So lu-
t ionÑ 215 LL至总体积 510 LL, 16e ,连接过夜。然
后热击转化大肠杆菌 ( E1coli ) DH5A感受态细胞。
挑取阳性菌落,经菌液 PCR和 SnaB I/N o tÑ双酶切
验证后, 委托 T iangen公司对载体插入片段进行
测序。
116 序列分析
利用在线 B last工在线 B last工具和 DNAS tar软
件对测序序列进行同源性分析, 绘制系统进化树。
通过 ExPASy在线工具对测序序列翻译成的蛋白质
理化性质、活性位点和跨膜结构进行分析。
2 结果与分析
211 总 RNA的提取
从小鼠肺部提取的总 RNA琼脂糖凝胶电泳见
图 2。从图 2可以看出, 提取 F3和 F4两管小鼠肺
部总 RNA均较完整, 28S和 18S rRNA条带清晰。
分光光度计测定 F3和 F4管总 RNA的浓度,分别为
912 ng /LL和 720 ng /LL, OD260 /OD280的比值分别为
21131和 21143,说明所提取 RNA均较纯, 无蛋白质
污染; OD260 /OD230的比值分别为 21054和 11429, F3
管 RNA的比值大于 2, 较理想; 而 F4管的比值小于
2,说明盐去不充分,可能是 G IT污染所致,可以再次
沉淀和 70%乙醇洗涤,因此以 F3管的总 RNA为后
续试验材料,保存于 - 70e 。
图 2 小鼠总 RNA的琼脂糖凝胶电泳
212 RT-PCR
以按第一链 cDNA合成试剂盒说明书反转录的
cDNA为模板, PCR扩增全长基因, 结果扩增出的条
带中有一条与预测长度相近,约 4 000 bp特异性条带
(图 3),将此条带切胶,用 PCR产物割胶回收试剂盒
回收 DNA,与预期结果大小一致,只有单条带 (图 4)。
ACE. PCR产物;M. DNA分子量
图 3 RT-PCR产物琼脂
糖凝胶电泳
M1DNA分子量; ACE1PCR产物
图 4 PCR产物回收琼脂
糖凝胶电泳验证
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213 重组质粒鉴定
将纯化的 PCR产物克隆到 pMD-18T载体, 转
化 E1coli DH5A感受态细胞,获得重组转化子, 编号
3、6、7、19、21和 22, 以转化子培养菌液为模板进
行 PCR鉴定, 编号 3、19转化子得到约 4 000 bp
的特异性片段 (图 5 ) , 判定为阳性菌落, 其余均
为假阳性。提取编号 3、19转化子重组质粒,经N ot I
与 SnaBÑ双酶切鉴定, 得到 4 000 bp和 2 700 bp的
片段 (图 6) ,与预期结果一致。因此,经过菌液 PCR
和双酶切验证, 足以说明已成功克隆出 ACE全长
基因。
M1DNA分子量; 3-241转化子 PCR产物
图 5 菌液 PCR验证
M 11DNA分子量; 113号质粒; 213号质粒酶切; 3119号
质粒; 4119号质粒酶切; M 21DNA分子量
图 6 双酶切验证
214 RT-PCR扩增测序结果
测序结果显示扩增序列片段长为 4 023 bp, 经
ORF inder分析表明于 37- 4 022 bp碱基处含有一
个完整的开放性阅读框 ( ORF) ,编码 1 328个氨基
酸 (图 7), 与 GenB ank登录号 NP _99750711的相
似度达 99%, 仅有 5个核苷酸发生突变 (图 7方框
部分 ) ,其中 4个是编码氨基酸三联体密码子的第
二位突变, 1个三联体密码子第三位突变。从氨基
酸水平上看, 有 4个氨基酸发生突变。相对分子
质量为 152177 kD, 含 148个酸性氨基酸, 133个碱
性氨基酸,等电点为 6135。
215 测序结果与 GenBank中其他物种 ACE基因的
同源比较及系统进化树的构建
在 GenBank中,收录了小鼠 (Musmusculus)、大
鼠 ( Rattus norvegicus )、金黄地鼠 (M esocricetus aura-
tus)、家犬 (Canis fam iliaris)、野兔 (Ory ctolagus cunicu-
lus)、大猩猩 ( Pan troglody tes )、人 (H omo sap iens)、马
(Equus caballus)、野猪 (Sus scrofa )、绵羊 (Ovis aries)、
南美负鼠 (Monodelphis domestica)、红原鸡 (Gallus gal-
lus)、斑胸草雀 (Taeniopyg ia guttata)、非洲爪蟾 (X eno-
pus (S ilurana) trop icalis)、斑马鱼 (Danio rerio )、绿河
豚 (Tetraodon nigroviridis)和佛州文昌鱼 (Branchiosto-
ma f loridae )等动物的 ACE基因的 mRNA或 cDNA序
列。本研究将测序的结果与上述物种进行同源性比
较 (表 1) ,并构建系统进化树 (图 8)。
由表 1可见,测序结果与小鼠 ACE的同源性达
到了 99%,说明成功克隆出小鼠的 ACE基因;与其他
物种 ACE同源性均较高,相同达 50%以上的有 17个
物种。
由图 8可见小、大鼠先聚为一支,后与金黄地鼠
聚类;人与大猩猩聚为一支, 后与马、家犬、野兔聚成
一类;野猪和绵羊聚为一支, 与说明啮齿类和哺乳动
物各自聚类;鱼类动物斑马鱼和绿河豚聚一类,鸟类
动物如红原鸡和斑胸草雀聚一类, 两栖类动物非洲
爪蟾自成一类。鱼类、鸟类和两栖类 ACE与小鼠
ACE的进化距离比犬、马、人及大猩猩等哺乳动物
的远,与系统进化结果相一致。说明 ACE在物种进
化过程中根据保守性原则遵循了进化秩序, 既包含
了决定其基本结构和功能的高度保守的氨基酸, 也
体现了与种系进化相一致的变异性。
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双下划线表示两个 ZINC蛋白酶活位点;方框表示发生突变的核苷酸;波浪线表示跨膜区域
图 7 ACE基因的克隆序列及推到的氨基酸序列
表 1 测序结果与 GenBank中其他物种 ACE基因的同源性分析
物种 同一性 (% ) 相似性 (% ) 物种 同一性 (% ) 相似性 (% )
sequen ced 100 100 Sus scrofa 82 91
Mu s mu scu lu s 99 99 Ov is arie s 78 90
Ra ttu s n orv eg icus 93 96 G allus ga llu s 68 82
M esocricetus aura tu s 87 93 Ta en iopyg ia gu tta ta 67 81
Can is fam iliaris 84 94 X enopu s(S ilurana ) trop ica lis 65 80
Oryctolagus cuniculus 83 92 Dan io rerio 64 79
Pan trog lodytes 82 92 T etraodon n igrovirid is 63 78
H om o sapien s 82 92 M onod elph is d om estica 61 76
Equu s ca ballus 82 91 B ranch iostom a f loridae 50 65
图 8 基于不同种属动物 ACE基因的系统进化树
3 讨论
本研究通过多次优化调整 RT-PCR反应条件体
系, 在体外成功克隆出小鼠总 RNA中 ACE基因完
整的 ORF序列到载体 pMD-18T上,经测定该 cDNA
全长为 4 023 bp, ORF为 3 985 bp, 编码 1 328个氨
基酸, 与 GenBank公布的小鼠 ACE基因相比具有
99%同源性,仅有 5个碱基发生突变,即第 1 286位
碱基 Ty A、第 1 340位碱基 A y G、第 2252位碱基
Ay G、第 2 478位碱基 Ay G和第 3 605位碱基 Ty
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C,其中有 3个是由碱基 A突变为 G; 从翻译成氨基
酸水平来看,除了第 4个突变碱基位于三联体密码
子的第 3位,翻译的氨基酸没有影响,体现了密码子
的简并性;其他 4个碱基突变于三联体密码子的第
2位,主要对氨基酸的极性发生影响。 ScanProsite
软件分析序列中有两个 ZINC-蛋白酶活性位点, 分
别位于氨基酸 392 - 401: THHEMGHVQ和氨基酸
990- 991: IAHHEMGH IQ (图 7中双下划线部分 ) ;
TMHMM软件分析跨膜区域位于氨基酸第 1 264- 1
286: QWVLLFLGVALLVATVGLAHRLY (图 7中波浪
线部分 )。突变的氨基酸并没有位于蛋白的重要区
域,一般来讲, 这些突变不会影响蛋白质的结构和
功能。
小鼠 ACE与其他物种的 ACE 同源性较高,
GenBank登录的与小鼠 ACE相同性达 50%的物种
就有 17种, 体现了 ACE基因在进化过程中的保守
性。有研究证实, 如果蛋白质间有 30% 序列相同
性,则可以根据已知蛋白推测其同源蛋白的空间结
构及相似的功能 [ 12]。从构建的系统进化树可以看
出, ACE的进化顺序符合种属间的进化亲缘关系,
同个鼠科的距离很近,再次是犬、马、猪等哺乳动物,
与鸟类、鱼类基因的祖先相距甚远。
本试验成功克隆小鼠 ACE基因,为进行下一步
研究其在酵母中的表达、生物活性和应用奠定了一
定的基础。
参 考 文 献
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(责任编辑 李楠 )
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