全 文 ：技术与方法
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2009年第 4期
Bt毒素蛋白与昆虫受体结合的研究方法比较
王青云 1 王发祥 2 夏立秋2
( 1中南林业科技大学食品科学与工程学院,长沙 410004; 2湖南师范大学生命科学学院微生物分子生物学湖南省重点试验,长沙 410081)
摘 要: B t毒素蛋白与昆虫受体的结合是决定其杀虫活性的一个关键步骤, 研究这种结合关系的方法也不断丰富和发
展。综述了这些研究方法的操作和特点, 并简单比较了它们的优缺点和适用范围,为从事相关研究时选择合适的方法提供参考。
关键词: 毒素蛋白 BBMV 受体 结合 研究方法
Study on AnalysisM ethods ofBacillus thuringiensis Toxin
Binding to InsectReceptors
W ang Q ingyun W ang Fax iang Xia L iqiu
(
1
College of Food Science and Engineering, Central South University of Forestry and T echnology, Changsha 410004;
2
K ey Laboratory
forM olecularM icrobialM olecularB iology of H unan Province, College of Life Science, H unanN ormal University, Changsha 410081)
Abstrac:t Bacillus thuringiensis tox ins b inding to the ir receptors is a key step that can de term ine the insectic idal activ ities as a
nalysis m ethods invo lved in Several m ethods and operation process w ere rev iew ed in this pape r, and the ir advantages, d isadvantages
and scope o f app lication w ere a lso sim ply summ arized Therefore, it can prov ide refe rence fo r furthe r research to conduct stud ies in this
fie ld
Key words: Tox ins BBMV Receptor B ind ing Ana lysis m ethod
收稿日期: 20081112
基金项目:国家自然科学基金 ( 30670052 )
作者简介:王青云 ( 1975) ,女,讲师,主要从事微生物和食品生物技术方面的教学和研究
苏云金杆菌 (Bacillus thuringiensis, 简称 B t)在细
胞生长的稳定期产生伴孢晶体,包含一种或多种毒素
蛋白,对 7大类昆虫和几类无脊椎动物具有选择性致
病能力 [ 1]。目前普遍认为 B t毒素蛋白通过与受体结
合而在昆虫中肠细胞形成孔道,插入膜并最终导致昆
虫死亡 [ 1] ;最近又有研究者提出了一种模式,即晶体
蛋白与受体的结合激活了某个信号传导途径从而导
致昆虫致死 [ 2]。在这两种作用模式中,毒素蛋白与昆
虫受体的结合都是决定其杀虫活性的一个关键步
骤 [ 3] ,因此其研究方法的发展和创新,对探讨毒蛋白
功能和杀虫机理具有非常重要的作用。科学家已在
昆虫的中肠刷状缘膜囊泡 ( BBMV )上发现和鉴定了
多个与毒素蛋白作用的受体 [ 3 ],并发展了一系列研究
毒蛋白与受体结合的方法。
1 表面等离子体共振技术
表面等离子体共振 ( surface p lasma resonance,
SPR)是用于表征表面折射系数改变的光学专业技
术。SPR试验能实时探测不同 Bt毒素蛋白与受体分
子相互作用的特征和结合能力的大小。SPR试验是
利用生物分子相互作用系统,如 B iacore 3000或表面
等离子共振谱仪和生物传感芯片如甲基化葡聚糖金
属膜 ( CM 5)将一定量毒蛋白固定在 CM5芯片上,按
一定流速滴加纯化的受体或 BBMV,通过分析仪器显
示的响应数据来比较结合的特征和强弱 (图 1A ) [ 4, 5 ]。
Masson等 [ 4]利用该技术发现了 C ry1Ac和 Cry1Ab蛋
白与昆虫受体的结合特征不同,从而发现 C ry1Ac与
受体分子氨肽酶 (APN )具有两个结合位点。
SPR技术是一种利用表面等离子体波进行检测
的技术,具有免标记、高速化、灵敏度高、操作简单及
大量平行筛选等优点;但对仪器设备的依赖程度高,
因而其应用受到限制。
2009年第 4期 王青云等 : B t毒素蛋白与昆虫受体结合的研究方法比较
2 晶体蛋白标记法
21 放射性同位素标记法
I
125标记是在 B t晶体蛋白和受体结合研究中用
的最多的一种方法。首先将 Na125 I加入有碘化玻璃
珠 ( IODOBEAD )的试管孵育, 再加入激活的毒素蛋
白,孵育一定时间后,取出 IODOBEAD终止碘化反
应,标记后的蛋白再与系列浓度的昆虫 BBMV结
合,以结合缓冲液洗涤数次除去未结合的毒蛋白,离
心后的沉淀用射线计数管或放射自显影测量其放射
性强度,从而计算出晶体蛋白与 BBMV结合的强弱
(图 1B) [ 6, 7 ]。在结合步骤中同时加入标记和未标
记的毒素蛋白还可进行可逆与不可逆结合、同源和
异源竞争结合分析 [ 7]。该方法能准确分析毒素蛋
白与 BBMV结合的解离常数 ( Kd)和结合位点浓度
( Bmax) ,适用于对毒蛋白结合能力的准确定量和多
个毒蛋白结合能力的比较。
S
35标记法是一种用来标记细胞的方法, 也有用
来研究 B t晶体蛋白和受体结合,主要是通过向培养
液中添加 [ S35 ]甲硫氨酸使渗入 B t细胞而达到标记
B t毒素蛋白的目的, 标记后的蛋白与 BBMV结合,
洗涤数次的沉淀与闪烁计数液 ( scintillation cock
tail)混合,然后用液相闪烁计数器来测量放射性强
度,从而分析结合情况 [ 8]。该方法与 I125标记法类
似,但标记时间长,操作复杂,因而应用不多。
22 生物素标记法
生物素 ( biot in)又名辅酶 R或维生素 H, 其羧基
经活化修饰后能与蛋白质结合,并可用链霉亲和素标
记的荧光或者二抗检测, 因而可用于 B t毒素蛋白和
受体结合的研究。该方法首先将毒素蛋白用活化的
生物素进行标记,以凝胶过滤或透析法除去游离的生
物素后与昆虫 BBMV孵育结合,未结合的毒素蛋白通
过离心和洗涤除去, 沉淀经 SDSPAGE分离后转至
PVDF或硝酸纤维素膜, 再通过 HRP酶标链亲和素
( streptav idin)杂交后用化学发光底物 ( ECL)显色, 通
过信号强弱判断毒素蛋白与 BBMV结合能力的大小
(图 1E ) [ 9]。主要用于标记蛋白质氨基的生物素衍生
物有生物素酰N羟基丁二酰亚胺酯 ( BNHS )和生物
素对硝基酚酯 ( pBNP)等,其中以 BNHS最常用。此
外,在结合反应步骤中同时加入不同浓度的未标记蛋
白,可进行同源或异源竞争结合分析 [ 3, 5, 10]。生物素
标记法操作相对简单,不需要特殊的仪器设备, 因而
被许多研究者广泛使用, 但其是一种半定量的方法,
只适合于定性和粗略的定量分析。
也有研究者用地高辛 ( digox ig in in, DIG)代替生
物素标记毒素蛋白,用抗 DIG的 HRP酶联结合物杂
交后 ECL显色,以消除链亲和素在生物素标记中引
入的杂交背景,增强结果的准确性 [ 11]。
23 其它标记法
NBDC l( N[ 7n itrobenz2oxa1, 3diazo le4yl]
chloride)具有高反应性,可在温和条件下标记伯胺和
仲胺。NBD标记的化合物为橙色, 其激发和发射波
长分别为 467 nm和 530 nm,因而,可用来标记小分子
Bt毒蛋白片段。这种方法是通过向标记的毒素蛋白
中加入递增量的 BBMV,通过测定其荧光强度而计算
出毒素蛋白与 BBMV的结合量 [ 12]。NBDC l是一种
用于小分子 HPLC分析的预先标记化合物,因而适合
小分子 Bt毒素片段与 BBMV的结合分析,该方法操
作和计算复杂,需要特殊的仪器设备,若非特殊要求,
如毒素片段太小,一般很少使用。
3 配体免疫印迹法
配体免疫印迹法 ( L igand blot)是由经典的 West
ern blot发展而来,是将 BBMV通过 SDSPAGE分离
后转移至固相载体 (例如硝酸纤维素薄膜, PVDF膜 )
上,以分离出来的 BBMV中的特异受体为抗原与 Bt
毒素蛋白免疫反应过夜,洗涤后再与对应 B t毒素蛋
白的抗血清和 HRP酶标的二抗杂交后显色, 通过杂
交带信号分析结合情况 (图 1D ) [ 13]。相对于生物素
标记法, L igand blot法则只是一种定性的结合研究方
法,但其结果能直观的反映毒素蛋白结合在 BBMV中
的位置,通过有杂交信号的蛋白条带的分子量大小,
能粗略估计受体分子地大小; 结合质谱分析, 能对对
应的受体分子进行鉴定, 还有希望找到新的受体
种类。
4 酶联免疫吸附法
酶联免疫吸附法 ( ELISA )最近几年才开始应用
于 Bt毒素与受体分子的结合研究。将纯化的受体
蛋白加入 96孔的 ELISA板中孵育, 再加入 2% 的
BSA孵育,用封闭液洗涤 3次后每孔加入封闭液稀
释的 B t毒素蛋白结合反应, 过量的毒素洗涤除去;
每孔再加入结合了过氧化物酶的对应毒素的单克隆
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生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2009年第 4期
抗体, 孵育 15 h后洗涤数次。最后加入底物如 2,
2氨基 二 ( 3乙基苯丙噻唑啉6磺酸 )和过氧化
氢 (H 2O2 ), 通过酶标仪测定每孔的吸光度获得
ELISA信号, 从而分析和计算结合的动力学参数 (图
1C )
[ 14]。
ELISA法灵敏度高,操作简单, 适用范围广, 但
需要用纯化的受体或抗体蛋白。ELISA法步骤灵
活, 除了上述步骤, 还可将毒素和受体结合反应后再
转入 EL ISA板进行后续杂交和显色, 杂交还可用抗
受体的酶标抗体;显色的底物也有很多选择,如邻苯
二胺、对硝基苯磷酸酯 ( PNPP)等。此外, 结合中加
入其它的毒素,可进行竞争结合分析 [ 15, 16]。
ASPR; B I125 lab elled; CELISA; DL igand b lot; EB iotinlab elled
图 1 应用不同方法分析 Bt毒蛋白与受体子结合的结果
5 其它方法
在结合试验中, 通常将几种方法结合运用可以
简化操作,或获得更准确的结果。在 L igand blot法
中,如果用生物素标记的毒素蛋白进行结合反应,则
可省去与抗血清杂交的步骤,直接以酶标亲和素杂
交显色, 结果更加灵敏 [ 17]。A tsum i等 [ 18]也以生物
素标记的毒素蛋白进行 ELISA结合分析, 用亲和
素 /生物素系统测定吸附在固相上的酶活性,从而分
析受体和单克隆抗体与毒素蛋白之间的竞争结合
关系。
6 结语
在 B t毒蛋白的作用模式中,与昆虫 BBMV上受
体的结合是一个关键步骤, 直接影响其杀虫活力和
其它功能。因此,毒蛋白与受体的结合关系通常是
探讨毒蛋白作用机制的一个重要方面, 研究的方法
也得到了不断丰富和发展。在这些方法中, SPR法
最简单, I125标记法和 ELISA法的结果最精确,但都
需要借助特定的仪器条件; L igand b lot法和生物素
标记法适合在大多数实验室应用, 但只能定性或半
定量分析。这些研究方法各有优缺点, 结果的表述
形式也各不相同 (图 1) , 只能结合研究目的和实验
条件选择。另外,如果将几种方法结合起来,可能会
达到更好的效果。相信随着研究深入,还会涌现很
多新的结合方法、标记方法和检测方式, 必将促成
Bt毒蛋白与昆虫受体结合研究的新发展。
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