全 文 ：生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN·研究报告· 2008年第5期
收稿日期:2008-03-21
作者简介:王晓飞(1982-),女,河北人,硕士研究生,研究方向:植物抗逆的分子机制
通讯作者:程宪国,副研究员,从事植物抗逆性分子机制研究
引言
自然界诸多环境因子,如干旱、盐渍和低温是制约植物正常生长发育、影响农作物产量与质量的重要
因素,尤其是干旱和盐渍是影响作物生长最普遍的两种胁迫因子。据统计,全球 43%的耕地为干旱、半干旱
地区,20%的耕地受到盐害胁迫。在我国仅旱地面积就占总土地面积的 52.5%[1],盐渍土分布也十分广泛,
面积约为 3.5×107hm2,相当于耕地面积的 1/3。因此,如何培育具有耐旱、耐盐的作物新品种已成了科学界
的广泛关注的话题。但是,由于植物抗逆性状本身的复杂性及其与数量性状位点连锁关系的复杂性,传统
的育种方法在一定程度上已很难获得优良的抗逆品种。分子生物学的发展及其在农业领域的广泛应用为
Floral-dip法大豆GmDREB转录因子转拟南芥研究
王晓飞 程宪国 王迎波 吴庆钰 白由路 梁永超
(中国农业科学院农业资源与农业区划研究所 农业部植物营养与养分循环重点实验室,北京 100081)
摘 要: DREB(dehydrationresponsiveelementbinding)转录因子通过调控下游多个抗逆相关基因的表达,能有效
提高植物的抗逆性。将构建的植物高效表达载体GmDREB::pCAMBIA1304,借助优化的floral-dip法,转入模式植物拟南
芥,并经潮霉素Hygromycine(40~50mg·L-1)抗性筛选得到22棵抗性植株。对抗性植株再进行PCR和 GUS检测获得19
颗阳性苗,阳性率为86.3%。对T1代种子进行抗性分离比例统计,有 4个株系的分离比例接近 3:1,符合孟德尔遗传定
律,说明外源基因GmDREB在这些株系的染色体中可能是单拷贝插入。继续对上述4个株系的后代进行抗性筛选,现已
得到2个纯合的转基因株系。导入的报告基因GUS组织染色检测表明,转入大豆DREB基因在拟南芥的根系和子叶中
均有大量表达,并在叶脉中表达。
关键词: Floral-dip 转录因子 GmDREB 转基因拟南芥
StudyonTransgenicArabidopsiswithaSoybeanTranscription
FactorGeneGmDREBbyFloral-dipMethod
WangXiaofeiChengXianguo WangYingbo WuQingyu BaiYoulu LiangYongchao
(ChineseAcademgofAgriculturalSciencesInstituteofAgriculturalResourcesandRegionalPlanningKeyLaboratoryof
PlantNutrition&NutrientCirclingUnderMinistryofAgriculture,Beijing100081)
Abstract: DREB(dehydrationresponsiveelementbinding)transcriptionfactorcanenhanceplantresistanceto
environmentalstresthroughregulatingexpresingdownstream targetgeneswhichrelatetostresresistance.Inthisstudy,
GmDREB::pCAMBIA1304,ahigheficientexpresionvector,wasconstructedandtransferedintowildtypeArabidopsis
byusingfloral-dipmethod.22regeneratedplantwasselectedinT0generationbyHygromycine(40~50mg·L-1).19positive
seedlingswasobtainedbyPCR andGUSdetection.Thepositiverationwas86.3%.Theresultofresistantseparation
rationofT1transgenicseedswas3:1in4transgeniclines,whichisconsistentwithMendelLaw ofInheritance.The
resultsindicatedthattheexogenousgeneGmDREBmaybesinglecopyinsertioninchromosomeoftransgeniclines.
Continuetoscreenabovefourofspring,twohomozygoustransgeniclineswereobtained.Histochemicalstaininganalysis
showedthatmoreDREBgeneswereexpresedinrootsandleaffromtransgenicArabidopsisplants.
Keywords: Floral-dip Transcriptionfactor GmDREB Transgenicarabidopsis
生物技术通报Biotechnology Buletin 2008年第5期
农作物改良提供了一条科学有效的途径,为创造丰富的植物育种资源开辟了广泛的支持空间。
有研究表明,当植物受到非生物逆境胁迫时,其本身会发生一系列的生理生化变化以对逆境刺激做出
反应[2,3]。在这个过程中,主要有两类基因被诱导表达:一类基因主要表达一些功能蛋白和渗透调节因子
(如 LEA,proA,mtl,gutD和 BADH等);另一类主要为传递信号和调控基因表达的转录因子(如 bZIP,MYC,
MYB和 DREB等)[4]。研究者已从各种植物中克隆出许多抗逆基因,并将其导入植物体内,提高了植物对逆
境的耐受性。Kishor等(1995)将脯氨酸合成酶基因 P5CS转入烟草,肖岗等(1995)将甜菜碱醛脱氢酶基因
BADH转入草莓和烟草中,均提高了植株的抗盐性。但是,这些基因大多只能增加植物的某种单一抗性,并
不能从整体上综合提高植物的抗逆性。随着分子生物技术的迅速发展和基因克隆技术的不断完善,对抗非
生物胁迫的研究已经由编码某种特定产物的功能基因向信号传导和基因表达调控等调节基因的方向发展 [5]。
与特定的功能基因不同,这些基因可以调控多个与同类性状相关的基因的表达,从而提高植物对环境胁迫
的耐受力。目前,对这类基因表达特性及基因产物调控作用的研究已成为植物分子生物学领域的一个前沿
内容,其中 DREB转录因子的研究极为活跃并取得了显著进展[6~8]。DREB即干旱应答元件结合蛋白,是
AP2/EREBP家族成员,能特异结合DRE/CRT顺式作用元件。其核心序列为TACCGACAT,1994年Yamaguchi-
Shinozaki在分析拟南芥 rd29A基因的启动子中首次发现了含 9bpTACCGACAT序列的 DRE核心序列,它能
对干旱、高盐和低温下逆境诱导基因表达起重要作用[2,9~11]。1998年,Jaglo-Otosen等利用强启动子在拟南
芥中过量 CBF1/DREB1B转录因子基因,提高了转基因植株的低温耐受性;Liu等利用 DREB1A和 DREB2A
基因转化拟南芥,发现转基因的拟南芥植株对低温、高盐以及干旱等耐性比野生型明显增强[12~14]。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 植物材料与菌株、质粒及载体 拟南芥(ArabidopsisthalianaColumbia)由中国农业科学院生物技术
研究所友好惠赠。大肠杆菌 (Escherichiacoli.)DH5α菌株为本实验室所保存;根癌农杆菌(Agrobacterium
tumefaciens)GV3101菌株为本实验室所保存;GmDREB目的片段连接在 pMD18-T克隆载体上,为本实验室
所保存;pEASY-T1Simple克隆载体购自北京全式金生物技术有限公司;真核表达载体 pCAMBIA1304由中
国农业大学农药分子生物学实验室友好惠赠。
1.1.2 酶及化学试剂 各种内切酶、T4DNA连接酶均购自 NEB公司;TaqDNA聚合酶购自北京鼎国生物
技术发展中心;DNase与 RNase购自 MBI公司;DNAMarker购自 Takara公司;EasyPureMiniPlasmid
PurificationKit购自北京全式金生物技术有限公司;各种培养用试剂购自 Oxoid公司和 Sigma公司;卡那霉
素(Kan)、利福平(Rif)、潮霉素(Hyg)等抗生素购自 Sigma公司。
1.1.3 引物合成与测序 合成引物及测序工作由北京三博远志生物技术有限公司完成。
引物序列:GmDREBF:5-CCATCCATGGAAGACAGGGATCACTGTTG-3
GmDREBR:5-ATTTACTAGTATCTTGAAGCTCTTCGAGTTTTGG-3
1.2 方法
1.2.1 植物高效表达载体的构建 将 GmDREB全长编码序列构建到具有 CaMV35S强启动子的真核表达
载体 pCAMBIA1304上,该载体携带 GFP绿色荧
光蛋白基因和 Gus报告基因,均由 CaMV35S启
动子启动(图 1)。
1.2.2 优化的 Floral-dip法转化拟南芥植株 挑
取带有重组质粒 GmDREB::pCAMBIA的农杆菌
转化子,28℃、250r/min振荡培养。待菌液 OD600=1.5~2.0时,将培养液按 1:100的比例转接培养,使其
OD600=2.0。终止培养后离心收集菌体,用花序浸泡液悬浮菌体,使 OD600=0.7。花序浸染菌液配好之后,立即
图 1 转化拟南芥的植物表达载体 GmDREB:pCAMBIA
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浸染植物,进行花序浸泡转基因实验。花序浸泡液:每个转化需准备
120ml5%的蔗糖溶液,如现配现用不需灭菌,否则高温灭菌后备用,
加入适量的 SilwetL-77,使其终浓度为 0.03%。Dip法浸染拟南芥花
序:选取初果期的健壮植株,一般以开花前 5～10d为宜(图 2),使整
个花序浸泡于浸染液中,而莲座叶片尽量不与浸染液接触。10s后
将盆取下,横放于暗箱中 16~24h,并保持较高的湿度。然后将处理
过的拟南芥植株放于 22℃～25℃的光照条件下正常生长。隔 3d处理
1次,如此将拟南芥处理 3次后使其正常开花结果,收获种子[16,17]。
1.2.3 转基因植株的筛选及纯合系的获得 农杆菌浸染拟南芥植
株当代所结的种子记为 T0代种子,将该种子消毒,均匀撒播于含有潮霉素 Hygromycine(40~50mg·L-1)的
MS平板上进行筛选。经抗性筛选长出的植株为 T1代植株,将阳性植株做好标记单株收获种子记为 T1代
种子,不同转基因株系的 T1代种子对潮霉素的抗性都发生了分离,且各个株系的分离比例不同,部分株系
的分离比例接近 3:1,符合孟德尔遗传定律,说明外源基因在这些株系的染色体中可能是单拷贝插入。选
取分离比例接近 3:1的株系收获种子记为 T2代种子,将部分 T2代种子播种于抗性平板上,如果 T3代植
株全部为绿色抗性苗,则证明该株系为纯合的转基因植株[18,19]。
1.2.4 转基因植株的 PCR检测 采用 CTAB法提取野生型和转基因型拟南芥的基因组 DNA[20]。根据外源
片段 GmDREB两侧的序列设计引物 GmDREBF和 GmDREBR,以基因组 DNA为模板,以含有目的基因的
质粒为阳性对照,进行 PCR扩增。PCR反应程序:94℃预变性 2min;94℃45s→62℃45s→72℃45s,35个循
环;72℃延伸 10min,4℃保存。
1.2.5 转基因植株的 GUS组织染色 GUS染色方法参考王关林等(2002)[21],并做了部分修改。将准备好
的材料浸泡于 GUS染色液 (100mmol/L磷酸缓冲液 pH7.2,0.5mmol/L铁氰化钾,0.5mmol/L亚铁氰化钾,
0.5mg/mlX-Gluc,2~3滴吐温-20)中,37℃避光染色 1~20h,然后用 70%的乙醇脱色 2~3次,置于显微镜下
观察、照相。
2 结果与分析
2.1 植物高效表达载体的构建
利用特异性引物:GmDREBF:5-CCATCCATGGAAGACAGGGATCACTGTTG-3GmDREBR:5-ATTTACT
AGTATCTTGAAGCTCTTCGAGTTTTGG-3以 GmDREB::pMD18-T质粒为模板,进行 PCR扩增目的片段,利
用其 3-端游离的 polyA,将其克隆到 pEASY-T1Simple载体上,然后用 NcoI、SpeI分别双酶切 GmDREB::
pEASY-T1Simple和 pCAMBIA1304,再经 T4DNALigase的连接作用,构建由 35S启动子驱动的 GmDREB
基因的植物表达载体 GmDREB::pCAMBIA,PCR及酶切检测结果见图 3。
2.2 转基因植株抗性筛选及纯合株系的获得
将收获的 T0代种子在含有潮霉素 Hygromycine(40~50mg·L-1)的 MS平板上进行初步筛选。未转化的
拟南芥种子虽然能在 Hyg-MS培养基上发芽,但待长
出两片子叶后,便会逐渐黄化、死亡;而转基因植株在
Hyg-MS培养基上能正常生长,且植株生长健壮,转化
效率约为 1.6%(图 4)。
将上述经抗性筛选的拟南芥植株 PCR鉴定,得
到 19株转基因拟南芥,按单株收取 7个株系的 T1代
种子,不同转基因株系的 T1代种子对潮霉素的抗性
都发生了分离,且各个株系的分离比例不同(表 1)。
图 2 用于转化的拟南芥植株[17]
王晓飞等:Floral-dip法大豆GmDREB转录因子转拟南芥研究 105
生物技术通报Biotechnology Buletin 2008年第5期
图 7 转基因拟南芥幼苗期的 GUS组织染色
其中,4个株系的分离比例接近 3:1,符合孟德尔遗传定律,说明外源基因在这些株系的染色体中可能
是单拷贝插入。选取分离比例接近 3:1的株系 Gm12、Gm16、Gm18和 Gm22单株收获种子记为 T2代种子,
将部分 T2代种子播种于抗性平板上,如果 T3代植株全部为绿色抗性苗,则证明该株系为纯合的转基因植
株,若再次出现分离现象需继续筛选,直至得到纯合体(图 5)。
2.3 转基因阳性植株的 PCR检测
利用特异性引物 GmDREBF和 GmDREBR,以上述 T1代抗性植株基因组 DNA为模板,以含有目的基
因的质粒为阳性对照,野生型的拟南芥基因组 DNA为阴性对照,进行 PCR扩增。22株抗性植株中有 19株
能扩增出预期的目标片段,阳性率为 86.3%(图 6)。
图 3 GmDREB:pCAMBIA表达载体的
PCR(A)和酶切(B)检测
图 4 转基因拟南芥在 Hyg-MS培养基
上的抗性筛选
图 6 T1代转基因苗的 PCR检测结果
M.DNAMakerDL10000,CK+阳性对照,
CK-阴性对照,1~4转基因阳性植株
图 5 纯合的转基因株系在抗性培养基上
的生长状况
2.4 转基因阳性植株的 GUS活性分析
选取分离比例接近 3:1株系的部分种子,将其播种于 MS潮霉素 Hygromycine(40~50mg·L-1)抗性培养
基上,取生长 7d左右的 T3代幼苗进行 GUS染色
检测[19,21]。通过对 GUS的表达特性分析,说明外源
基因已被整合到拟南芥基因组上并得以稳定遗
传。此外,对 GUS的组织特性分析,发现在拟南芥
幼苗期的真叶和根部有明显的深蓝色,说明外源
基因在其幼苗期的真叶和根部有较强的表达,但
对其不同发育时期及不同组织的基因表达需进一
步的研究和探讨(图 7)。
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3 结论
DREB转录因子是参与植物对干旱、高盐、低温等非生物胁迫应答,调节植物体内产生各种生理代谢反
应的关键因子[22,23]。自1994年,Yamaguchi-Shinozaki等[9]在拟南芥中首次检测到与 DRE作用的蛋白质因子,
DREB转录因子基因现已得到广泛研究。近年,大豆 DREB转录因子的研究也取得一定进展。目前,在
GenBank中注册的大豆 DREB转录因子基因不少于 15个。李雪平等[24,25]通过设计特异性引物,以大豆基因
组为模板,利用 PCR方法扩增出 3个 DREB基因:GmDREBa、GmDREBb和 GmDREBc。研究表明,这些基因
在植物应答非生物逆境胁迫途径中发挥着重要作用。
利用 Genbank中的大豆 EST文库设计特异性引物,通过 RT-PCR的方法,从大豆的 cDNA表达文库中
克隆了一个新的抗逆相关转录因子基因 GmDREB。该基因具有 525bp的 cDNA开放阅读框序列,编码 174
个氨基酸,具有一个由 58个氨基酸组成的 AP2/EREBP保守域,其中第 l4与第 l9位保守氨基酸分别是缬
氨酸(V)与谷氨酸(E),在 N-末端和 C-末端分别有一个核定位信号区和转录激活区[15]。
借助优化的 Floral-dip法,以生长健壮的野生型拟南芥植株为对象,将克隆得到的新基因——大豆逆
境诱导转录因子 GmDREB导入拟南芥植株。转基因后代经 PCR和 GUS组织检测,证明外源基因已整合到
拟南芥基因组上并得以稳定遗传。对转 GmDREB基因拟南芥应答高盐、干旱等逆境胁迫的抗性鉴定在进
一步的研究中,这不仅为进一步明确 DREB转录因子的分子调控与作用机制提供了帮助,也为今后研究该
基因对大豆本身的组织发育与抗逆调控提供了理论依据。
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