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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2011 年第 4 期
大量 Pichia pastoris酵母基因组 DNA的提取
刘晓志 高健 韩柱 王志明 陈伟斌
(华北制药集团新药研究开发有限责任公司 抗体药物研制国家重点实验室，石家庄 050015)
摘 要: 巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)表达系统是目前应用最广泛的外源基因表达系统之一，提取酵母基因组是研
究酵母必需的方法之一。针对常用的几种毕赤酵母基因组 DNA的制备方法进行比较，并对玻璃珠法进行改进。改良的玻璃
珠法不但具有省时省力、操作简便且结果稳定的优点，适合于大量 DNA的提取。该方法的革新将对酵母重组子的 PCR 鉴定
检测及表达产品 DNA相关检测提供更高效稳定的保证，将成为酵母等类似微生物基因组 DNA制备的首选方法。
关键词: Pichia pastoris 酵母 基因组 蜗牛酶法 玻璃珠法 改良玻璃珠法
DNA Extraction for Large Genome of Pichia pastoris
Liu Xiaozhi Gao Jian Han Zhu Wang Zhiming Chen Weibin
(New Drug Research and Development Co．，Ltd． of North China Pharmaceutical Corporation，
State Key Laboratory of Antibody Drug Development，Shijiazhuang 050015)
Abstract: Pichia pastoris expression system that has been widely used for expressing foreign protein． The refore，has drawn growing
attention to develop methods for extracting yeast genome． In this paper，several kinds of yeast genomic DNA preparation methods were com-
pared，and the glass bead method was improved，which not only saves time but also can be operated easily with satisfactory results of large
number of DNA extraction． This approach could be used as the genome DNA preparation method for yeast and other microbial．
Key words: Pichia pastoris Genome DNA Snail enzyme method Glass bead method Improved glass bead method
收稿日期:2010-10-15
基金项目:国家“十一五”重大新药创制项目(2009ZX09102)
作者简介:刘晓志，男，博士，研究方向:生物药物的质量研究及质量控制;E-mail:liuxiaozhi666@ 163． com
巴斯德毕赤酵母表达系统是目前应用最广泛的
外源基因表达系统之一。近年来已有 600 多种外源
蛋白在该表达系统中获得表达［1］。毕赤酵母表达
系统中外源目的基因能够稳定表达，必须整合到酵
母染色体中。为了确保能够正确表达，首先要确认
外源基因是否正确插入，必须对酵母重组子染色
体 DNA 进行鉴定和筛选，提取高质量的酵母基
因组 DNA［2］。酵母基因组 DNA 制备比大肠杆菌
难度大，原因是由于酵母细胞壁难于破坏，酵母
基因组 DNA 不能很好地释放出来［3 － 5］。制备的
酵母基因组 DNA 作为模板进行 PCR 等常规方法
时，如果基因组 DNA 的质量要求不高，很可能出
现假阳性或假阴性的现象，极大地影响了鉴定可
靠性及和筛选进度。另外，在进行 Southern 杂交
等试验时需要至少 10 μg 高质量的基因组 DNA
用于酶切消化，这就对酵母基因组 DNA 的提取
技术提出了挑战。
毕赤酵母拥有较厚实的细胞壁，因此对于基因
组 DNA 提取的主要问题就集中在如何高效破坏细
胞壁。毕赤酵母的细胞壁厚约 25 nm，约占细胞干
质量的 30%，并且具有坚韧的结构。它的结构分 3
层，外层是甘露聚搪，内层为葡聚糖，均是具有复杂
结构的分枝状聚合物，中间层含有丰富的蛋白质。
传统破坏细胞壁的做法大致可以分为两类:酶法和
机械法。酶法包括使用 Zymolyase、蜗牛酶和蛋白酶
K等;机械法包括超声波破碎法、液氮研磨法和玻璃
珠法等，各种方法都存在一定的缺点。
本研究将两种方法结合，旨在使得毕赤酵母基
因组 DNA的提取变得快速、简便，提取的 DNA质量
及稳定性也较其他方法具有明显优势。本试验利用
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2011 年第 4 期
试剂盒、蜗牛法酶法、玻璃珠法和改良玻璃珠法提取
酵母基因组 DNA，每种方法都经过 3 次重复试验，
提纯样品经紫外分光光度计和电泳检测，并考察各
种方法提取 DNA的稳定性。
1 材料与方法
1. 1 材料
1. 1. 1 菌种 巴斯德毕赤酵母 X-33 菌种由本研究
室保存。
1. 1. 2 主要试剂 Multi-Copy Pichia Expression Kit
(Invitrogen) ;玻璃珠(Sigma-G8772) ;蛋白酶 K(Mer-
ck) ，蜗牛酶，其他试剂为国产分析纯。
1. 2 方法
1. 2. 1 酵母培养 将巴斯德毕赤酵母 X-33 菌种接
种于 100 mL YPD 培养基中，30℃，震荡培养 48 h;
取 10 mL酵母菌液离心去上清，用去离子水洗 1 次，
用残余的液体重悬沉淀［6］。
1. 2. 2 试剂盒提取法 菌体用 2 mL SCED(1 mol /L
山梨醇、10 mmol /L 柠檬酸钠、10 mmol /L EDTA、10
mmol /L DTT二硫苏糖醇)溶液重悬，加入 0. 1 － 0. 3
mg Zymolyase 溶菌酶 37℃水浴 1 h;加入 1% SDS 2
mL冰浴 5 min，加入饱和酚和氯仿各 2 mL 充分混
匀，10 000 r /min 离心 10 min;取上清加入 1 /10 体积
的 3 mmol /L醋酸钠溶液，再加两倍体积入预冷无水
乙醇，充分混合。13 000 r /min 离心 15 min，用 1 /2
离心管体积的 70%乙醇溶液洗涤沉淀 1 次，13 000
r /min离心 10 min，吸弃上清。37℃放置 15 min，加
1 mL 灭菌水溶解。
加入 4 mg /mL RNA酶 1 μL，37℃放置 3 h。加
入等体积的氯仿 /异戊醇(24∶ 1) ，抽提 1 次，再加入
1 /10体积的 3 mmol /L 醋酸钠溶液和两倍体积预冷
无水乙醇沉淀回收。加 1 mL 灭菌水溶解，4℃过夜。
经紫外分光光度计和电泳对其含量和纯度进行检测。
1. 2. 3 蜗牛酶提取法 菌体用 2 mL 2%蜗牛酶
30℃消化 1 h(2%蜗牛酶用原生质体缓冲液配置，
原生质体缓冲液的配置 1 mol /L山梨醇，0. 02 mol /L
柠檬酸 pH5. 8，配制经 0. 22 μm 微孔滤膜过滤除
菌)。加入 2 mL NDS缓冲液:0. 01 mol /L Tris-HCl，
pH9. 5 0. 5 mol /L EDTA，pH8. 0 1% SDS(Sigma 公
司) ，2 mg /mL Pk，37℃水浴 1 h;加入饱和酚和氯仿
各 2 mL 充分混匀，10 000 r /min 离心 10 min;取上
清加入 1 /10 体积的 3 mmol /L 醋酸钠溶液，再加两
倍体积入预冷无水乙醇，充分混合。13 000 r /min
离心 15 min，用 1 /2 离心管体积的 70%乙醇溶液洗
涤沉淀一次，13 000 r /min 离心 10 min，吸弃上清。
37℃放置 15 min，加 1 mL 灭菌水溶解。
加入4 mg /mL RNA酶1 μL，37℃放置3 h。加入
等体积的氯仿 /异戊醇(24∶ 1) ，抽提 1 次，再加入 1 /
10体积的 3 mmol /L 醋酸钠溶液和两倍体积预冷无
水乙醇沉淀回收。加 1 mL 灭菌水溶解，4℃过夜。经
紫外分光光度计和电泳对其含量和纯度进行检测。
1. 2. 4 玻璃珠提取法 菌体加入裂解液 2 mL(2%
TritonX-100，1% SDS，100 mmol /L NaCl，10 mmol /L
Tris-HCl，1 mmol /L EDTA) ，酚 ∶ 氯仿 ∶ 异戊醇(25 ∶
24∶ 1)2 mL，0. 1g玻璃珠，利用振荡器剧烈充分震荡
10 min 以上。10 000 r /min 离心 15 min，取上清加
入1 /10体积的 3 mmol /L醋酸钠溶液，再加两倍体积
入预冷无水乙醇，充分混合。13 000 r /min 离心 15
min，用 1 /2 离心管体积的 70%乙醇溶液洗涤沉淀 1
次，13 000 r /min离心 10 min，吸弃上清。37℃放置
15 min，加 1 mL 灭菌水溶解［7］。
加入4 mg /mL RNA酶1 μL，37℃放置3 h。加入
等体积的氯仿 /异戊醇(24∶ 1) ，抽提 1 次，再加入1 /10
体积的 3 mmol /L醋酸钠溶液和两倍体积预冷无水乙
醇沉淀回收。加 1 mL 灭菌水溶解，4℃过夜。经紫外
分光光度计和电泳对其含量和纯度进行检测。
1. 2. 5 改良玻璃珠提取法 菌体加入裂解液 2 mL
(2% TritonX-100，1% SDS，100 mmol /L NaCl，10
mmol /L Tris-HCl，1 mmol /L EDTA) ，加入 0. 1 g玻璃
珠利用振荡器剧烈充分震荡 10 min 以 上，
10 000 r /min离心 15 min，吸弃上清，加入 2 mL NDS
缓冲液:0. 01 mol /L Tris-HCl，0. 5 mol /L EDTA，1%
SDS，2 mg /mL Pk，37℃水浴 1 h;加入酚∶氯仿∶异戊
醇(25∶ 24∶ 1)2 mL，震荡混匀，10 000 r /min 离心 10
min。取上清加入 1 /10 体积的 3 mmol /L 醋酸钠溶
液，再加两倍体积入预冷无水乙醇，充分混合。
13 000 r /min离心 15 min，用 1 /2 离心管体积的 70%
乙醇溶液洗涤沉淀 1 次，13 000 r /min离心10 min，吸
弃上清。37℃放置 15 min，加 1 mL 灭菌水溶解。
加入4 mg /mL RNA酶1 μL，37℃放置3 h。加入
等体积的氯仿 /异戊醇(24∶ 1) ，抽提 1 次，再加入1 /10
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2011 年第 4 期 刘晓志等:大量 Pichia pastoris酵母基因组 DNA的提取
体积的 3 mmol /L醋酸钠溶液和两倍体积预冷无水乙
醇沉淀回收。加 1 mL 灭菌水溶解，4℃过夜。经紫外
分光光度计和电泳对其含量和纯度进行检测。
1. 2. 6 电泳检测酵母基因组 DNA 电泳条件如
下，1%琼脂糖凝胶，每种方法提取的 DNA，分别点
样 3 μL，10 μL。130 V 恒定电压 35 min，然后用凝
胶成像系统拍照。
1. 2. 7 测定酵母基因组 DNA纯度及浓度 使紫外
分光光度计测定分析各种方法所提酵母基因组 DNA
纯度及浓度。OD280 ＜ 1. 8，表明样品中蛋白质含量过
多;OD260 /OD280 ＞ 2. 0，表明 RNA 含量过多;OD260 /
OD280为 1. 9 表示纯度好。DNA 浓度(ng /μL)= 50 ×
OD260 ×稀释倍数。
1. 2. 8 DNA稳定性考察 将不同方法提取的 DNA，
4℃放置 30 d，取 10 μL进行电泳检测，观察 DNA的降
解情况。
2 结果
2. 1 电泳检测酵母基因组 DNA
将不同方法提取的 DNA，取 10 μL 进行电泳检
测。电泳结果(图 1)显示，使用试剂盒、蜗牛法酶法
和玻璃珠法提取的 DNA，电泳条带整齐，无 RNA 存
在，蜗牛法酶法和玻璃珠法提取的 DNA浓度较高。
M． 1 kb DNA Ladder;1．试剂盒方法;2．蜗牛酶法;
3．玻璃珠法;4．改良玻璃珠法
图 1 不同方法提取酵母基因组 DNA电泳图
2. 2 测定酵母基因组 DNA纯度及浓度
使用分光光度计对不同方法提取的 DNA浓度进
行测定，测定结果见表 1。分光光度计的测定结果同
电泳结果一致，DNA纯度及浓度可以达到实验要求，
其中蜗牛法酶法和玻璃珠法提取的 DNA浓度较高。
表 1 不同方法提取酵母基因组 DNA纯度及浓度测定结果
DNA提取法 OD260 /280 浓度(ng /μL)
试剂盒法 1. 86 ± 0. 03 17. 6 ± 1. 5
蜗牛酶法 1. 92 ± 0. 05 18. 9 ± 2. 5
玻璃珠法 1. 95 ± 0. 03 126. 6 ± 1. 5
改良玻璃珠法 1. 90 ± 0. 04 196. 9 ± 2. 0
2. 3 不同方法提取酵母基因组 DNA稳定性的检测
将不同方法提取的 DNA，4℃放置 30 d，取 10
μL进行电泳检测，观察 DNA 的降解情况。电泳结
果(图 2)显示，使用试剂盒、蜗牛法酶法和玻璃珠法
提取的 DNA电泳条带呈弥散的带状，发生了比较严
重的降解，而使用改良玻璃珠法提取酵母基因组
DNA电泳条带单一整齐，没有发生降解。
3 分析与讨论
毕赤酵母表达系统是近年来发展起来的极具潜
力的酵母表达体系，提取高质量基因组 DNA是酵母
M． 1 kb DNA Ladder;1．试剂盒方法;2．蜗牛酶法;
3．玻璃珠法;4．改良玻璃珠法
图 2 不同方法提取酵母基因组 DNA稳定性
试验电泳图
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生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2011 年第 4 期
菌株鉴定等一系列分子生物学检测的重要基础。提
取基因组 DNA 的困难主要是因为毕赤酵母拥有比
较厚实的细胞壁，细胞壁厚约 25 nm，约占细胞干质
量的 30%，并且具有坚韧的结构。它的结构分 3
层，外层是甘露聚搪，内层为葡聚糖，它们都是具有
复杂结构的分枝状聚合物，中间层含有丰富的蛋白
质［8］。此外，细胞壁上还含有少量的类脂和以环状
形式存在于芽痕周围的几丁质。
由于酵母菌细胞壁的特殊结构，使得 DNA的释
放需要一些特殊的方法和试剂［9］。本试验室对酵
母基因组 DNA的提取方法进行优化，采用 4 种不同
的方法，致力于获得一种快速、稳定、可靠和简便的
制备酵母 DNA的方法。
本试验使用试剂盒法、蜗牛酶法、玻璃珠法和改
良玻璃珠法 4 种方法提取酵母基因组 DNA。传统
提取试验中多采用酶法或者机械破壁法，本试验使
用了酶法同机械相结合的改良玻璃珠法，该法不但
具有省时省力、操作简便且结果稳定的优点，并且较
适合于大量 DNA 的提取。本研究比较了 4 种提取
酵母基因组 DNA 的试验表明，Invitrogen 公司推荐
的酵母 DNA提取方法是采取消溶解酶(Zymolyase)
对细胞进行破壁，不仅试剂昂贵而且过程繁琐。使
用蜗牛酶代替 Zymolyase 虽然降低了试验成本，但
是由于蜗牛酶消化效率低并且由于杂质较多对后期
的 DNA纯化工作带来了麻烦;两种酶法所提酵母基
因组 DNA的质量比较高，其中蜗牛酶法提取效果不
如 Zymolyase 酶法好，主要是由于蜗牛酶成分复杂
且效率不稳定。使用经典的玻璃珠法提取的酵母基
因组 DNA 纯度和浓度都比较好，可以达到试验要
求。但是使用上述 3 种提取的 DNA 稳定性都比较
差，通过一段时间储存后，都会发生较严重的降解，
而使用改良玻璃珠法提取的 DNA 就表现出比较好
的稳定性。
改良玻璃珠法在经典的玻璃珠法基础上进行了
大胆改进，在利用玻璃珠破坏细胞壁后再加入蛋白
酶 K进行消化，促进酵母核酸的释放，不但达到了
提高产量的目的，同时也提高了 DNA 的稳定性，主
要是由于蛋白酶 K 对酵母蛋白进行了比较彻底的
消化。
试验结果显示 4 种方法提取的基因组 DNA 质
量均可以达到试验要求，但综合比较产量、试验成本
及 DNA的稳定性，改良玻璃珠法较其他方法具有较
明显优势［10］。该方法的革新将对酵母重组子的
PCR 鉴定检测及表达产品 DNA 相关检测提供更高
效稳定的保证，将成为酵母等类似微生物基因组
DNA制备的首选方法。
参 考 文 献
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(责任编辑 李楠)
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