全 文 ：技术与方法
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2010年第 2期
PCR技术在食品微生物检测中的应用
王华 1 刘斌 2
( 1中国环境管理干部学院生态学系,秦皇岛 066004; 2上海交通大学农业与生物学院食品科学系 陆伯勋食品安全研究中心,上海 200240)
摘 要: PCR技术以其高强的特异性和灵敏度以及检测速度快、准确性好等优点, 广泛地应用在食品微生物检测的各
个领域, 尤其对培养困难的细菌检测和抗原结构复杂的细菌鉴定方面。介绍了几种 PCR方法的原理, 以及其在食品微生物检
测中的应用情况。
关键词: PCR 微生物 检测
Latest Application of PCR Technology in
FoodM icroorganism Inspection
W ang Hua
1
L iu B in
2
(
1
D epartm ent of Ecology, Environm entalM anagement College of China, Q inhuangdao 066004;
2
D epartment of Food Science and Bor Luh F ood Safety Center,
School of A griculture and Biology, Shanghai J iaoT ong University, Shanghai 200240)
Abstrac:t Th is article summ ar ized the pr inciple, m ethod and applica tion in m any fie lds of PCR techno logy. PCR techno logy could
be w ide ly used in the m icroo rganism inspection in food. PCR has the sensitive, differentia,l sim ple, convenient and fast v irtues, wh ich
have been used in m ic roorgan ism inspection, espec ia lly in bac teria inspec tion incubated d ifficu ltly and w ith com plex structure antig en.
Key words: PCR M icroo rganism Inspection
收稿日期: 20091123
基金项目:中国环境管理干部学院精品课建设基金 ( 200809)
作者简介:王华,讲师,研究方向:食品微生物检验与食品安全; Em ai:l m snhuaw ang@ 126. com
聚合酶链反应 ( po lym erase cha in reaction,
PCR ), 是一种体外酶促合成,扩增特定 DNA片段的
方法。该技术于 1985年由美国的 K array等首创并
由美国 Cetus公司开发。PCR技术已成为调查食品
源疾病暴发及鉴定相应病原菌的有用工具, 可以提
高检测灵敏度、缩短操作时间、提高检出率, 有效检
测食品中的致病微生物。随着人们对食品安全性要
求的不断提高, PCR技术以其特异性强、灵敏度高
和快速准确等优点在食品检测领域得以广泛的
应用。
1 常规 PCR检测
常规 PCR检测原理是在存在 DNA模板、引物、
dNTP、适当缓冲液和 MgC l2溶液的反应混合物中,在
热稳定 DNA聚合酶的催化下,对一对寡核苷酸引物
所界定的 DNA片段进行扩增。这种扩增是通过模
板 DNA、引物之间的变性、退火 (复性 )、延伸等 3步
反应为一个周期,循环进行, 使目标 DNA片段得以
扩增。由于每一周期产生的 DNA片段均能成为下
一次循环的模板,故 PCR产物以指数形式增加。
在 1992年 R ahn等 [ 1 ]利用沙门氏菌的 invA基
因设计了一对引物,第一次用 PCR的方法对沙门氏
菌进行了检测试验。共检测了 630株沙门氏菌, 约
100多种血清型和 21个菌属的 142株非沙门氏菌。
结果显示, 有两株 S. litchf ield 和两株 S. senf tenberg
没有检测出,检出率为 994%。
2 多重 PCR
多重 PCR ( mult ip lex PCR)原理与常规 PCR相
同, 只是在同一反应体系中加入一对以上的特异性
引物,如果存在与各引物对特异性互补的模板,则可
同时在同一个反应管中扩增出一条以上的目的
生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2010年第 2期
DNA片段。这种方法既保留了常规 PCR的特异性、
敏感性,又减少了操作步骤及试剂,实现了一次扩增
的同时检测多种微生物的目的。利用这一方法可以
同时检测多个目的基因或借助其交叉限制进行确
认。但多重 PCR技术也存在较明显的不足, 如扩增
效率不高,敏感性偏低;扩增条件需要摸索与协调;
可能出现引物间干扰等。
Be j等 [ 2]在 1990年利用多重 PCR的方法检测
了 L eg ionella类菌种和大肠类细菌。使用大量不同
种类的 lacZ和 lamB基因的引物, 可以检测到大肠
杆菌、沙门氏菌和志贺杆菌等肠道菌。其结果是通
过点对点方法固定的多聚 dT尾捕捉探针,和生物素
标记的扩增 DNA进行杂交来检测的。 Cortez等 [ 3]
用多重 PCR检测了家鸡屠宰场不同来源样品中的
鼠伤寒沙门氏菌、肠炎沙门氏菌和其他血清型的沙
门氏菌。其使用了 3对引物,分别来自沙门氏菌的
invA, pefA和 se fA基因。在检测的 288份样品中,
鼠伤寒沙门氏菌和肠炎沙门氏菌的检出率为 62% ,
其他血清型的沙门氏菌为 10%。
K aw asak i等 [ 4]利用多重 PCR的方法检测了肉
制品中沙门氏菌, 单核增生李斯特菌和大肠杆菌
157 H 7。这一方法的检测灵敏度是 103 CFU /mL。
当这一方法应用于猪肉样品的检测时, 起始接菌量
为 1cell/25 g的人为污染样品可以在 30 h内检测
出,而在自然污染的肉制品检测时, 沙门氏菌、单核
增生李斯特菌和大肠杆菌 O157 H7可以在相同的
时间内检测出。并且与传统的培养方法比较, 也得
到了几乎一致的结果。
3 RTPCR
逆转录 聚合酶链反应 ( reverse transcript ionpo l
ymerase cha in reaction, RTPCR )的原理是提取组织
或细胞中的总 RNA, 以其中的 mRNA作为模板,采
用 O ligo( dT )或随机引物利用逆转录酶反转录成
cDNA。再以 cDNA为模板进行 PCR扩增, 而获得
目的基因或检测基因表达。RTPCR使 RNA检测
的灵敏性提高了几个数量级,使一些极为微量 RNA
样品分析成为可能。
在 Y ee等 [ 5]的研究中,对 16条河流样品和 183
份动物粪便样进行了检测, 使用了涂布有鼠伤寒沙
门氏菌WG49和WG25的两种平板。这两种平板可
以区别出 ma lespecif ic和 SC ( somat ic phages)型噬
菌体。RN ase试验能够显示 DNA和 RNA的噬菌体
差别,再应用 RTPCR技术进行特异性的鉴定 FR
NA噬菌体。Fspecific大肠杆菌噬菌体总发现率为
80%。平板计数的方法检测出 FRNA大肠杆菌噬
菌体为 65% , ma lespecif icDNA大肠杆菌噬菌体为
70%。RTPCR在所有的 FRNA 平板为阳性, 在
FRNA, FDNA、SC噬菌体混合的体系中,能够很好的
鉴定出 FRNA噬菌体。
4 巢式 PCR
巢式 PCR( nest ing PCR )是指先后用两套引物
进行扩增的 PCR技术,用内外两对引物先后扩增靶
基因片段。通常是先用第一套引物扩增 15- 30个
循环,再用已扩增的 DNA片段内设定的第二套引物
扩增 15- 30个循环。由于第二套引物设计片段位
于第一套引物扩增的片段内, 所以将第一套引物称
为外引物,而把第二套引物叫做内引物。巢式 PCR
既可增加反应的物异性, 又可得到丰产的特异性靶
序列,增加敏感性。巢式 PCR技术对微生物的检测
和单拷贝基因靶 DNA的扩增都是非常有效。
由于常规巢式引物 PCR技术在第一次扩增反
应结束后要打开反应管,除去第一套引物,再加入第
二套引物,所以操作比较复杂,而且易造成反应系统
污染。因此, 最近有人改进了巢式 PCR反应的引
物, 使外引物的退火温度明显高于内引物, PCR反
应一开始就可以将两套引物一起加入反应系统中。
当外引物在退火温度下做双温循环扩增时, 内引物
不能与模板结合形成稳定的双链而不起作用。当外
引物扩增结束后, 再进行低火温的 PCR循环, 在低
退火温度下,内引物开始工作。经过几次循环后,将
变性温度降低,这样可防止反应体系中在 PCR最初
几个循环形成的原始样品模板序列的产物解链, 避
免它们再成为外引物的模板。
H ashimo to等 [ 6]基于编码 V i抗体的基因序列 G
改进了巢式 PCR,所有的伤寒菌 (包括丙型副伤寒 )
都能检出, 灵敏度可以达到单个细胞水平。在
Prakash
[ 7 ]的研究设计了肠沙门氏菌 Typh i血清型菌
株的 H1d特异引物对进行巢式 PCR,结果显示, 该
巢式 PCR能够作为金标的方法代替 W ida l测试方
法诊断伤寒症。
64
2010年第 2期 王华等: PCR技术在食品微生物检测中的应用
Gom ezCouso[ 8]用多重巢氏 PCR检测软体动物
贝类中的隐性孢子和鞭毛虫,在来自西班牙 49个贝
类样品中 ( 18蛤, 22蚌类, 9牡蛎 ),卵囊隐性孢子用
荧光显微镜的捡出率为 56%, 用多重巢氏 PCR捡出
率为 44%。显微镜观察的结果和 PCR的结果没有
明显的相关性,而鞭毛虫只在 1个牡蛎样品中通过
PCR检出。通过该方法检测来自英国的 38个样品
( 20蚌类, 18海扇 ), 鞭毛虫没有被检测出, 26个样
品中含有卵囊隐性孢子。
5 免疫 PCR
免疫PCR由 Sano等首创, 是指用 DNA分子作
为标记物,在做一般的免疫反应的同时进行 PCR扩
增和电泳分析的免疫试验。此法把 PCR的扩增能
力与抗原抗体反应的特异性结合在一起, 从而极大
地提高了检测抗原的灵敏度 (与 ELISA平行对照
时,其敏感性可高达 10万倍 ), 而且因其所用的
DNA分子是任意的可以选定一个固定的分子, 合成
一对引物就可以了,从而避免了每换一种检测对象,
就要设计一对引物的弊病。在免疫 PCR中,多用生
物素作为连接分子。生物素具有两个独立的结合位
点,一个可与 DNA分子结合, 另一个能与抗原 2抗
体复合物上的亲和素结合, 由此将 DNA分子和抗
原 抗体复合物专一性地连接在一起, 形成抗原 抗
体 亲和素 生物素 DNA复合物,然后加入 PCR扩增
系统, 标记的 DNA便可。
M etzgerBodd ien等 [ 9]对 PCRELISA的方法进
行了评价,首先是对人为污染和自然污染沙门氏菌
的食品样品进行评价, 其次是对 1 100多份不同类
型的食品样品进行评价,结果显示,样品中沙门氏菌
的检出率可以达到 98%。
6 荧光定量 PCR
实时荧光定量 PCR ( rea ltim e flurescent quant i
t ive PCR)是将荧光能量传递技术 ( fluorescence reso
nance energy transfer, FRET)应用于常规多聚酶链式
反应仪中, 通过受体发色团之间偶极偶极相互作
用,能量从供体发色团转移到受体发色团,受体荧光
染料发射出的荧光讯号强度与 DNA产量成正比,检
测 PCR过程的荧光讯号便可得知靶序列初始浓度,
从而达到定量目的。
实时定量 PCR的化学原理包括探针类和非探
针类两种,探针类是利用与靶序列特异杂交的探针
来指示扩增产物的增加,特异性高;非探针类则是利
用染料或者特殊设计的引物来指示扩增的增加, 特
异性受到质疑,但简便易行。
61 非探针类
在 PCR 反应体系中, 加入过量 SYBR荧光染
料, SYBR荧光染料特异性地掺入 DNA双链后, 发
射荧光信号,而不掺入链中的 SYBR染料分子不会
发射任何荧光信号, 从而保证荧光信号的增加与
PCR产物的增加完全同步。目前主要使用的是美
国 Molecu lar Probes公司的 SYBRG reen 1和 SYBR
Go ld。但此方法末使用特异性探针, 其特异性完全
由引物决定。在有非特异双链 DNA产生时, 其荧光
也同样增强,因此, 与常规 PCR的特异性差别不大。
Nam等 [ 10]建立和评价了 SYBR G reen 1实时
PCR特异检测沙门氏菌的方法。用大小为 119 bp
的 invA基因作为检测靶点, 对 124株沙门氏菌和
116株非沙门氏菌进行了检测。检测结果显示, 所
有的沙门氏菌有 invA基因阳性条带, 而非沙门氏菌
均没有扩增条带。为证实该方法的有效性, 对自然
污染的样品如泻湖水,青稞饲料, 土壤及牛奶罐中的
牛奶进行了检测, 这些样品中沙门的含量为 10 -
10
5
CFU /mL。该方法的灵敏度是, 如果不进行增
菌, 样品中的沙门含量需 103 - 104 CFU /mL,如果增
菌, 着样品中沙门含量不到 10 CFU /mL。将该方法
与传统的分离检测沙门比较, 没有出现假阴性和假
阳性的结果。
62 TaqM an探针
TaqM an荧光探针为一寡核苷酸, 两端分别标记
一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。在 PCR
反应液中加入一对引物的同时加入此特异性的荧光
探针,末扩增前此探针是完整的, 此时报告基团发射
的荧光信号被淬灭基团吸收。而当 PCR扩增时,
Taq酶的 5!3!外切酶活性将探针酶切降解, 使报告
荧光基团和淬灭荧光基团分离, 从而荧光监测系统
可接收到荧光信号, 即每扩增一条 DNA链, 就有一
个荧光分子形成,实现了荧光信号的累积与 PCR产
物形成完全同步。
H ein等 [ 11]应用 TaqM an荧光 PCR的方法检测
了沙门氏菌, 获得的检测限在 95个基因组拷贝 /
65
生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2010年第 2期
PCR。在蛋白胨培养基中增菌 16h后, 可从 25 g碎
肉制品中检测出 25 CFU的沙门氏菌, 从 25 g鸡肉
或者 25mL原料乳中检测出 5 CFU的沙门氏菌。在
检测食品中的沙门氏菌时, 此方法显示出很高的灵
敏度和特异性。
M alorny等 [ 12]通过沙门氏菌的 DNA中 ttrRSB
CA中的特异片段, 设计了检测引物和 TaqM an探
针。共鉴定了 110株沙门氏菌和 87株非沙门氏菌,
得到了良好的检测结果。在此试验中还添加了扩增
内标, 当沙门氏菌的浓度在 103 CFU /mL时, 可以检
测出 70%的阳性样品;而浓度在 104 CFU /mL时,则
可以得到 100%的检测结果。与传统的培养方法相
比,得到了 100%的一致性。
63 分子信标
在同一探针的两末端分别标记荧光分子和淬灭
分子。与 TaqM sM探针不同的是该探针 5!和 3!末
端自身可形成一个碱基左右的发卡结构, 此时荧光
分子和淬灭分子邻近,因此不会产生荧光。当溶液
中有特异模板时该探针与模板杂交, 从而破坏探针
的发卡结构,于是溶液便产生荧光,荧光的强度与溶
液中模板的量成正比, 因此可用于 PCR定量分析。
该方法的持点是采用非荧光染料作为淬灭分子,因
此荧光本底低。
L im ing
[ 13]利用分子信标的方法对沙门氏菌进
行了检测, 结果显示检测限可以达到 1 - 4 CFU /
PCR。检测认为污染的鱼肉制品和蔬菜类食品时,
在蛋白胨培养基中增菌 16 h后,可以从 4 CFU /25 g
的样品检测出沙门氏菌。
7 热起动 PCR
热起动 PCR(Ho t start PCR)指的是使 Taq DNA
聚合酶只在样品温度超过至少 70∀ 时才发挥作用
的 PCR。它是为提高反应的特异性设计的。如所
周知道, Taq DNA聚合酶通常在比适宜温度低得多
的条件下仍有较强的活性,会导致非靶序列的扩增,
影响 PCR反应的特异性。热起动可减少非靶序列
的扩增,从而提高反应的特异性。
热起动的基本方法是在进行 PCR反应之初,将
Taq DNA聚合酶、氯化镁和引物这些 DNA合成所必
需的关键性试剂先不要加入样品管内; 而将样品管
加热, 待温度上升至 70∀ 以上时, 再将上述试剂加
入, 开始 PCR反应。还有人使用一种高熔点的蜡,
先将 Taq DNA聚合酶与 PCR反应系统的其他成分
分开,待反应系统的温度超过 80∀ 时, 蜡熔解, Taq
DNA聚合酶即混入反应系统中, 保证 PCR在高温
下开始。还有人研制出一种特异性抗体,它在不超
过 70∀ 的条件下,可与 Taq DNA聚合酶结合而阻断
其活性。当反应体系达到第一次变性温度时, 抗体
因高温而破坏, Taq DNA聚合酶随即恢复活性,由此
开始 PCR扩增。
Yang等 [ 14]设计了 12对引物进行多重 PCR, 并
使用了热启动酶, 检测腊样芽孢杆菌毒素基因。该
体系成功的检测出了与食物中毒及与食品相关的
162株菌中潜在的毒素。所有的菌株都至少带有一
个毒素基因, 70%以上的菌株带有未知基因。Y ang
等 [ 15]用多重 PCR的方法对从韩国的动物中分离的
两种沙门氏菌:肠炎沙门和鼠伤寒沙门进行了多重
抗药基因的鉴定。为了研究相关的抗药基因, 用了
4对引物进行了热启动 PCR检测。结果发现, 有两
株鼠伤寒沙门氏菌分离株发生了氨苄青霉素抗性
突变。
8 其他 PCR检测方法
Cano等 [ 16]采用了荧光检测 PCR的方法检测
了食品中的微生物。先用 Chelex 100抽提食品样品
中的培养物,作为在微平板中 PCR的模板。 PCR产
物经过热变性后转移到带有共价结合寡聚核苷酸的
CovaL inkNH平板上,在 55∀ 杂交 1 h, 经洗涤后,添
加有碱性磷酸酶标记的探针,严格洗涤后,加入底物
检测荧光。检测的灵敏度可以达到 1- 10 CFU。用
FDPCR和培养方法一起检测了 172份食品样品,
FDPCR发现方法的灵敏性为 100%, 特异性为
901% ,阳性率和阴性率分别为 828%和 100%。
A larcon等 [ 17]使用毛细管凝胶电泳激光激发荧
光多重 PCR( mu lt ip lexPCRCGELIF)检测了金黄色
葡萄球菌、单核细胞增生李斯特菌、沙门氏菌 3种病
原菌,该方法灵敏度是多重 PCR的 10- 1 000倍,在
人工污染的样品,不需要增菌时, 检出限分别为金黄
色葡萄球菌为 26 # 103 CFU /mL、单核细胞增生李
斯特菌 570 CFU /mL和沙门氏 790 CFU /mL。如果
经过 6 h的增菌, 则检测限可以分别降低到金黄色
葡萄球菌为 260 CFU /mL、单核细胞增生李斯特菌
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2010年第 2期 王华等: PCR技术在食品微生物检测中的应用
57 CFU /mL和沙门氏 79 CFU /mL。试验证明, 此方
法可以作为检测食品致病菌的一种有效手段。
食品微生物检测技术的发展方向是提高检测效
率,即方便、快速和大批量;试验条件标准化;检测的
高精度和高灵敏度。诚然, PCR技术在实践的应用
中仍然发现其存在一些缺陷。随着, PCR技术的不
断发展和完善,在食品微生物的检测中的应用前景
会越来越广泛。总之, 微生物的快速检测方法在食
品卫生微生物检验方面起着越来越重要的作用。从
长远的发展看,免疫学、分子生物学、自动化和计算
机技术的发展对建立更敏感快捷的食品微生物学检
测方法已经起到了积极的促进作用。食品微生物检
验技术向高效率、高标准、高精度和高灵敏度的方向
发展, 必定对人类公共卫生、食品安全、营养健康与
疾病预防等做出巨大贡献。
参 考 文 献
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