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猪圆环病毒Ⅱ型的研究进展



全 文 :·综述与专论·
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2010 年第 6 期
猪圆环病毒Ⅱ型的研究进展
徐娜 李宝玉 娄忠子 柳纪省
(中国农业科学院兰州兽医研究所传染病室 家畜疫病病原生物学国家重点实验室 农业部兽医公共卫生重点开放实验室,兰州 730046)
摘 要: 猪圆环病毒Ⅱ型(porcine circovirus type 2,PCV-2)是引起猪圆环病毒病(porcine circovirus desease,PCVD)的主
要病原,在猪群中广泛存在。本病毒可以单独或者与其它病原混合感染猪只,引起断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)、育肥
猪皮炎与肾病综合征(PDNS)等一系列较为复杂的疾病,严重威胁猪只的健康。经过 10 余年持续不断的努力,各国对 PCV-2
的研究日益深入,对病毒的相关特性也有了较为清晰的认识。对病毒的病原学、流行病学、致病机理、临床症状、病理变化、诊
断和防制对策等方面的研究进展进行了简要综述。
关键词: 猪圆环病毒 病原学 致病机理 诊断 防制
Research Approach of Porcine Circovirus TypeⅡ
Xu Na Li Baoyu Lou Zhongzi Liu Jixing
(Animal Infectious Diseases Research Laboratory,Lanzhou Veterinary Research Institute,Chinese
Academy of Agricultural Sciences,State Key Laboratory of Veterinary Etiological Biology,Key Laboratory
of Veterinary Public Health of Ministry of Agriculture,Lanzhou 730046)
Abstract: Porcine circovirus typeⅡ (PCV2)plays a crucial role in the pathogenesis of PCVD in swine,which have spread wide-
ly The virus can infect independently or impact other pathogens of pigs PCV-2 causes postweaning multisystemic wasting syndrome
(PMWS) ,porcine dermatitis and nephropathy syndrome (PDNS) ,which can severely jeopardize swinery health After more than ten
years efforts,the study of PCV-2 is in depth,relevant characteristics of the virus have been more clear The article described Character-
istics of the virus,epidemiology,pathogenesis,clinical symptoms,pathological changes,diagnosis and control measures
Key words: Porcine circovims virus Etiology Pathogenesis Diagnosis Control measures
收稿日期:2010-01-25
作者简介:徐娜,女,在读硕士研究生,研究方向:分子病毒学;E-mail:junjun258660350@ 126 com
通讯作者:柳纪省,研究员,博士生导师,E-mail:liujixing@ hotmail com
猪圆环病毒病 (porcine circovirus desease,
PCVD)是继猪繁殖与呼吸综合征(porcine reproduc-
tive and respiratory syndrome,PRRS)之后新发现的猪
的重要传染病。猪圆环病毒分为 PCV-l 和 PCV-2
血清型。1974 年,德国学者 Tischer 首次从猪肾传
代细胞系 PK-15 中分离到一种小的病毒,并于 1982
年将其命名为猪圆环病毒(PCV1)。随后,血清学调
查证实德国(1982)、加拿大(1989)、新西兰(1991)、
英国(1994)、美国(1995)都有本病毒存在,该病毒
对猪无致病性,广泛存在于猪源细胞系(PK-l5 细
胞)[1]及猪中。1997 年 Clark 等研究人员从加拿大
西部患有断奶仔猪多系统衰竭综合征(postweaning
multisystemic wasting syndroom,PMWS)的猪群中分
离到一种新的病毒,该病毒与 PK-15 细胞中圆环病
毒相似,并命名为Ⅱ型猪圆环病毒(porcine circovir-
us-2,PCV-2)。PCV-2 具有致病性,引起的各种疾
病给世界养猪业造成巨大的经济损失,已受到国外
学者的高度重视。
PCV-2 感染除了引起 PMWS 之外,还可导致母
猪繁殖障碍、断奶和育肥猪的呼吸道疾病,猪皮炎和
肾病综合征(poreine derlnatitis and nephropathy syn-
drome,PDNS)以及猪的先天性震颤(congenital trem-
ors)。PCV-2 及其相关的猪病已在全世界范围内发
生和流行。发病率最高可达 60%,死亡率 3% -
10%不等。较严重的地区猪场在暴发本病时死淘率
高达 40%左右,其危害和造成的重大经济损失显而
2010 年第 6 期 徐娜等:猪圆环病毒Ⅱ型的研究进展
易见。现已被世界各国的兽医与养猪业者公认为本
病是继猪繁殖与呼吸综合征之后新发现的重要的猪
的传染病。近期国内各地临床发病调查情况表明,
猪圆环病毒病在我国规模化猪场的发病猪群越来越
多,给不少猪场造成了巨大的经济损失。
1 病原特征
猪圆环病毒(PCV)在分类上属圆环病毒科、圆
环病毒属,不引起细胞病变,该病毒无囊膜,基因组
仅由一个单股环状脱氧核糖核酸(DNA)链组成。
呈 20 面体对称,平均直径 17 nm,是迄今发现的一
种最小的动物病毒。它以滚环方式复制,病毒粒子
的浮密度为 1 37 g /cm,沉降系数为 52S。猪圆环病
毒 PCV1 共有 22 个血清型。PCV-1 基因组大小为 1
759 bp,包含 7 个阅读框(ORF) ,其中 2 个重要的
ORF分别编码复制起始蛋白 Rep 和 Rep 以及结构
蛋白 Cap。PCV-2 基因组分两种,一种为 1 767 bp,
另一种为 1 768 bp,含有 11 个 ORF,其中有两个主
要 ORF,即 ORF1 和 ORF2,ORF1 有 945 个碱基,编
码 314 个氨基酸,ORF2 有 704 个碱基,编码 233 个
氨基酸。从氨基酸序列推测,ORF1 有 3 个糖基化
位点,编码病毒 DNA 复制必需的相关蛋白,ORF2
编码与鸡传染性贫血病毒 N-末端主要结构相似的
保守氨基酸序列,ORF2 还有 4 个免疫反应位点,其
中 69 - 83 和 117 - 131 位氨基酸多肽对 PCV-2 抗血
清有特异性。
PCV对外界环境抵抗力较强,70℃时可存活 15
min,56℃不能将其灭活,在 pH 为 3 的酸性环境中
及氯仿中可存活较长时间。该病毒无囊膜,因此对
氯仿等有机溶剂不敏感。对苯酚、季胺类化合物、氢
氧化钠和氧化剂等较敏感。PCV 不凝集牛、羊、猪、
鸡等多种动物和人的红细胞,其抗血清不能抑制猪
细小病毒 fPPⅥ对红细胞的凝集性[2]。PCV 在原代
胎猪肾细胞、恒河猴肾细胞、BHK-21 细胞上不生
长,可在 PK15 细胞中生长,但不引起细胞病变,且
需将 PCV盲传多代才能使病毒有效增殖。在接种
PCV的 PK15 细胞培养物中加入 d-氨基葡萄糖,可
促进 PCV 复制,使得感染 PCV 的细胞数量提高
30%。感染 PCV的细胞内含有许多胞浆内包涵体,
少数感染细胞内含有核内包涵体。
2 流行病学
PCV2 主要易感动物是猪,各种年龄、不同性别
的猪都可以感染 PCV2,但它们的临床症状不尽相
同,常见的 PMWS 可见于 5 - 16 周龄的猪,但最常
见于 6 - 8 周龄。病猪和带毒猪是本病主要的传染
源。本病发展缓慢,猪群 1 次发病可持续 12 - 18 个
月。猪群中血清阳性率常高达 20% - 80%,猪群发
病率为 3% -50%,病死率为 8% -35%。在疫病感
染流行过程中发病率和死亡率都较低,急性发病猪
群中的死亡率可达 10%,在感染的猪群中 PCV2 常
与猪细小病毒(PPV)或猪呼吸与繁殖障碍综合症病
毒(PRRS)混合感染猪只。猪感染 PCV2 后,尤其是
混合感染 PCV1、PPV及 PRRSV等后,可发生多系统
衰竭综合症(PMWS) ,而使死亡率大大增加。PCV
经口、呼吸道感染不同日龄的猪,少数怀孕母猪感染
PCV后,经胎盘垂直感染给仔猪。病猪或带毒猪可
以通过分泌物、粪便将病毒排到体外而污染饲料、水
和周围的环境,造成病毒在猪群中的蔓延和扩散。
由于 PK-15 细胞是国内猪源细胞疫苗的主要培养
细胞,因而,PCV在国内可能已广泛传播开来。
3 致病机理
Posell等[3]研究发现,PCV-2 从猪的鼻、口腔侵
入体内,在扁桃体、局部淋巴结增殖后,向其他淋巴
组织、肺、肝、肾扩散。受慢性感染的影响,诱发免疫
抑制、肠炎、间质性肾炎及肝损伤。MeNeilly 等研究
了 PCV感染对猪肺巨噬细胞体外免疫功能的影响,
结果发现 PCV感染对抗体 Fc 和补体受体或吞噬作
用无任何影响。但他们观察到 PCV感染后 4 d对细
胞 MHC-I 类抗原的表达有上调作用,而感染后 8 d
可降低细胞 MHC-Ⅱ类抗原的表达,并且对巨噬细
胞介导的、分裂素诱导的淋巴细胞增生有明显抑制
作用。Shibahar 等证实 PCV 诱导了淋巴系统中 B
细胞凋亡,使患猪处于免疫抑制状态。Krakowka 等
(2000)研究表明,PMWS 症状的出现不仅需要
PCV2,而且 PPV 也具有重要的作用。PMWS 和
PRRS具有许多相似的病理变化。猪的皮炎与肾病
综合症(PDNS)与 PCV感染有一定相关性;在 PCV2
感染猪群中,很容易发生副猪嗜血杆菌等细菌的继
发感染。Segales 等[4]用流式细胞计数器分析感染
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生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2010 年第 6 期
猪外周血液中白细胞变化,发现单核细胞增加,T淋
巴细胞 f主要是 CD4﹢T和 B淋巴细胞减少,不成熟
粒细胞的密度偏低。以上表明,PCV 引起了淋巴细
胞凋亡,APC 递呈抗原能力的减弱,同时降低了 B
淋巴细胞和 CD4﹢ T 细胞的机能。因此,使患猪处
于免疫抑制状态,导致患猪抵抗力下降。
PCV的基因组为单股、负链、环状 DNA,病毒基
因组以滚环模式(rolling circle model)进行复制。
PCV-2的复制起始区位于一个 324 bp 的片段上,其
包含 1个茎-环结构、保守的九核苷酸基序(AAGTAT-
TAC)、3个六核苷酸重复序列(CGGCAG)和 2 个五核
苷酸重复序列,Rep 和 Rep’的共表达是起始 PCV-2
的复制所必须的,对 PCV-2 的保守九核苷酸基序进
行突变,从而影响病毒的复制过程,Rep 和 Rep’蛋白
协同定位于同一个细胞的细胞核内,二者既可以形成
同源复合物,也可以形成异源复合物,一般认为,这种
复合物对转录过程起调控作用。可以通过控制病毒
的复制和转录,降低该种病毒的致病性。
4 临床症状和病理变化
PMWS主要感染 6 - 8 周龄的小猪,极少感染乳
猪。临床上表现为多系统进行性功能衰弱为特征的
症状。表现为渐进性消瘦,生长迟缓,采食量下降,
被毛粗乱,精神差,体重减轻,皮肤与可视黏膜苍白
或黄疸,贫血。皮肤和被毛发黄,有相当一部分猪只
出现呼吸困难、喘气,呈腹式呼吸,肌肉萎缩,衰弱无
力。一些不常见的症状有下痢、咳嗽和中枢神经系
统紊乱。先天性颤抖的症状差异极大,颤抖由轻微
到严重不等。颤抖是两侧性的,影响骨髓肌,乳猪躺
卧或睡眠时颤抖停止,外界刺激可引发或加重震颤。
本病常与 PRRS、猪伪狂犬病、猪细小病毒病、猪喘
气病等疫病混合感染,故临诊表现可能多样。剖检
病死猪可见全身淋巴结水肿,特别是颌下、腹股沟、
纵膈、肺门和肠系膜淋巴结显著肿大,切面硬度增
大,呈苍白色。集合淋巴小结也肿大。心脏有轻度
或中度的心肌炎。肺肿胀,坚硬或似橡皮,表面点缀
有灰褐色小叶,表现为多灶性间质性肺炎。如有继
发性感染,则出现多灶性脓液性肺炎。严重病例肺
泡出血,并与胸壁粘连。肝脏萎缩,肝小叶间结缔组
织增生。严重时肝脏肿大、黄疸,有时呈花斑状外
表。脾肿大,部分猪脾脏、胸腺萎缩。肾脏灰白色,
水肿,盲肠和结肠黏膜充血或瘀血。
5 诊断
根据临床症状和病理剖检变化进行初步诊断,
但 PCV、PPV、PRRS感染发病的临床症状、流行病学
及病理变化相似,因此必须结合实验室诊断方法才
能确诊。已建立的诊断方法主要有以下几种:
5 1 病毒分离
从 PMWS暴发流行时采集样品,将病料制成 100
g /L的组织悬液。加青霉素(100 IU /mL)、链霉素
(100 mL) ,4℃3 000 r /min离心 20 min。取上清液接
种于 Dulac细胞接种后 6 h,用 300 mmol /L D-葡萄糖
胺,37℃处理 30 min,再培养 72 - 96 h。将增殖病毒
的细胞冻融 3次,收集细胞病毒液。用细胞病毒液再
接种细胞传代 6 次。第 6 代细胞病毒液反复冻融 3
次,按5 rCL加 rri-tionl14,37℃处理30 min。10 000 r /
min分离 30 min。弃沉淀,将上清液加入盛有 300 g /
L蔗糖垫的离心管中。15 000 r /min 离心 3 h;弃上
清,用 0 01 mmo1 /L pH8 0的 TE缓冲液重悬并收集
病毒。乙酸双氧铀负染色后电镜观察。
5 2 酶联免疫吸附试验(ELISA)
Naw等分别采有 PK-15 细胞增殖的病毒粒子
和昆虫细胞表达 PCV ORF 的特异性衣壳蛋白作为
抗原建立了间接 ELISA。用该法对人工感染 PCV
的猪进行了血清学抗体检测,发现以 PCV2 病毒粒
子和 ORF2 作为抗原的 ELISA 的敏感性、特异性和
准确性相似,接种后 14 - 21 d 即可检测出 PCV 抗
体,抗体含量逐步增加。但与间接免疫荧光试验相
比,ELISA简捷、快速,而且一次可以检测大量样品,
非常适合用于血清学调查,但其敏感性略低于免疫
荧光技术。国内崔尚金等采用 PCV 抗原和正常细
胞对照抗原,建立了间接 ELISA,并被农业部推荐进
行流行病学调查。
5 3 免疫荧光技术[5]
免疫荧光技术常用于猪圆环病毒感染的血清学
普查,快速、特异、敏感,其缺点是不能区分 PCV-1
与 PCV-2 产生的抗体。周继勇等(2004)报道,应用
间接免疫荧光技术,测定了浙江地区 44 个猪场
2000 - 2002 年间的 2 039 个血清样本,对不同年龄
和品种猪血清学数据进行了系统分析。结果显示,
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浙江 44 个猪场均有猪圆环病毒感染,猪的平均阳性
率为 58 31%,其中种猪感染血清 阳 性 率 为
59 38%,在 断 奶 以 后 猪 感 染 的 血 清 阳 性 率
56 65%。品种方面,长白种猪感染的血清阳性率为
44 83%,长白仔猪感染的血清阳性率 64 28%,明
显高于大约克和杜洛克种猪和仔猪的感染率。
PCV-2 感染的血清阳性率高的仔猪和种猪群,其
PRRSV和伪狂犬病毒(PRV)的抗体阳性率较低,这
种现象表明,PCV-2 感染可能会引起免疫抑制。
5 4 原位杂交试验(ISH)
Nawagitgul(2000)研究制备了能区别 PCV-1 和
PCV-2 的探针,根据 PCV-2 的 ORF1 和 ORF2 的有
义链和反义链合成核酸探针。在 42℃ 和 58℃,
ORF1 反义链探针与感染细胞中 PCV-1 和 PCV-2 都
杂交。在 58℃时,ORF2 反义链探针和 PCV-2 核酸
杂交,不与 PCV-l核酸杂交。ORF1 和 ORF2 有义链
探针只与 PCV-2 核苷酸结合。反义链探针产生的
信号比有义链强。研究结果表明,ORF1 反义链探
针适合检测两种类 PCV(PCV-1 和 PCV-2)。ORF2
反义链探针可区分 PCV-l和 PCV-2。
5 5 核酸环介导等温扩增技术(loop-mediated iso-
thermal amplification,LAMP)
该方法主要是利用 4 种不同的特异性引物识别
靶基因的 6个特定区域,且可在等温条件进行扩增反
应。基因的扩增和产物的检测可一步完成,扩增效率
和特异性高,可在 l5 - 60 min 扩增 109 - 1010倍,而且
所有靶基因序列的检测可只通过扩增产物的有、无来
判别。Chen等[6]用核酸环介导等温扩增技术建立了
诊断 PCV-2的快速检测方法,较普通 PCR 节省近一
半左右的时间,而且操作简单,敏感性高。
5 6 聚合酶链式反应(PCR)
PCR技术[7]以其特异、快速、准确的优点成为
目前病毒学诊断、分子生物学试验最常用的技术之
一,也是 PCR的病原检测和定型中最常用的技术。
Larochelle 等建立了多重 PCR 方法成功检测
PCV,并可对 PCV定型,弥补了常规 PCR 检测的不
足。他们根据 PCV-1 和 PCV-2 设计两对引物,一对
扩增 PCV-1 的 ORF1 的 349 bp 片段,特异性检测
PCV-1。另一对引物特异性扩增 PCV-2 的 ORF2 的
263 bp 片段,可特异性检测 PCV-2。检测发现,
PCV-2 不仅是 PMWS的原发病原,而且是猪繁殖障
碍病、猪呼吸道综合症(PRDC)、仔猪震颤病的主要
元凶之一。
在国内,PCR 技术发展很快,许多学者相继建
立了多种 PCR 方法用于猪圆环病毒的分离鉴定或
分子流行病学调查。王忠田、杨汉春[8]对北京、天
津、深圳、山东、山西等地 12 个规模化猪场疑似
PCV-2 感染猪群进行了临床发病情况调查,并采用
PCR对收集的 55 份组织病料进行 PCV-2 检测,然
后用限制性内切酶对 PCV 产物进行了酶切鉴定。
结果表明,12 个猪场中有 11 个猪场发病猪群表现
为 PMWS,1 个猪场表现为猪皮炎和肾病综合症。
另外,梁红虎等(2004)采用 PCR方法对发病仔猪的
全血、血清、尿、粪便进行扩增,结果发现,生血的
PCR的阳性率最高可达(6 /7,85 7%) ,粪便的阳性
率最低(2 /7,28 6%)。余旭平等采用复合 PCR 方
法对浙江、上海等地的猪场具有明显“高热综合症”
临床表现的猪淋巴结进行检测,发现 PCV-2 的阳性
率为 33 333%,2001 年入夏前后在浙江省和周边地
区暴发的“猪高热综合症”可能与 PCV-2 的感染具
有一定相关性。
5 7 限制性片段长度多态性(RFLP)
该方法是先用 PCR扩增相应目的片段,而后进
行限制性内切酶切反应,电泳后观察比较限制性图
谱来分析序列之间的差异。Hamel 等[9]借助于
RFLP建立了可以分型的 PCR 诊断方法,可以很容
易地检测出 PCV-1 和 PCV-2。Fenaux 等[10]根据已
有的 PCV株的基因序列,建立了通用的 PCR-RFLP
分析方法,该方法可以用于 PCV-2 的致病性研究,
也可以用来检测不同区域的 PCV-2 感染情况。
5 8 DNA芯片(DNA chip)
生物芯片技术是借助计算机控制的机械手按预
定的位置点阵,让众多探针与固相支持片的待测样
品进行分子杂交并进行检测的技术。芯片具有特异
性强、灵敏度高(可检测到的最低探针量为 3 pg /
μL)和可重复利用(至少 10 次)的优点。肖驰等[11]
根据 PRRSV、CSFV和 PCV-2 的序列选取靶标,制备
相应的探针并构建 DNA 芯片,能同时检测 PRRSV、
CSFV和 PCV-2 感染,并能区分 PRRSV 的美洲型和
欧洲型毒株。
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生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2010 年第 6 期
6 防制对策
目前国内外已研制出多种疫苗,美国 Charreyre
等通过后备母猪以灭活的 PCV2 佐剂疫苗免疫,其
子代在 3 - 4 周龄进行强毒攻毒获得保护,免疫后备
母猪所产仔猪比对照母猪所产仔猪的 PCV2 感染的
相关临床症状和病变明显减少。美国 Urniza 等研
究在 PCV2 欧洲株攻毒前用嵌合的 PCV1-2 灭活疫
苗免疫猪,在免疫后 18 - 132 d 之间,在免疫组和对
照组间抗体滴度差异显著,免疫后任何猪都没有检
测到 PCV2 病毒血症。但是 PMWS 并非仅由 PCV
引起,其必须与 PPV、PRRSV 等病原协同作用于免
疫系统才能使猪发病,所以对 PCV 的感染很难奏
效。因此,目前采取的主要对策是抗生素注射和良
好的管理有助于解决继发感染或并发感染的问题,
但对此病本身无效,所以要控制此病只能采取综合
性的防制措施,加强饲养管理,降低饲养密度,良好
的圈舍通风,减少应激因素,合理分群与混养,实行
严格的全进全出制度,避免将不同日龄的猪混群饲
养。从而减少和降低猪群之间 PCV 及其它病原的
接触感染机会,建立完善的生物安全体系。将消毒
卫生工作贯穿于养猪生产的各个环节,最大限度地
降低猪场内污染的病原微生物,减少或杜绝猪群继
发感染的几率,有效预防和控制其它感染性疾病。
做好猪瘟、猪伪狂犬病、猪细小病毒病、猪喘气病等
疫苗的免疫接种,提高猪群整体的免疫水平,减少呼
吸道病原体的继发感染。增强肺脏对 PCV 的抵抗
力。对于早期发现疑似感染猪进行检查、隔离和淘
汰。避免从疫区引进猪只,严格控制外来人员、车
辆、货物进入猪场。同时避免其它动物接近猪场,对
老鼠和飞鸟也要进行严格控制[12]。
7 展望
PCV作为一种新发现的病毒,与其有关的疾病
已经成为世界养猪业的重要传染病,给养猪业带来
了巨大的经济损失。尽管许多实验室对 PPV 和
PRRSV与 PCV 在治病方面的协同机制,该病毒及
其所导致的疾病及 PMWS 的人工复制等方面进行
了大量的研究,使我们获得了大量的知识。但对其
分子生物学特性,病毒对动物免疫性能的影响,致病
机理,有效地预防和控制该病毒引起的各种疾病,以
及一些潜在的问题等缺乏全面而系统地了解。因此,
还应该进行更详细,更深入地研究。由于该病毒广泛
存在于猪体内,与猪的健康密切相关,尤其是考虑用
猪的器官进行人的异体移植时,更应该加强对此病原
体的研究。另外,目前国内关于 PCV 的分子生物学
和基因工程方面的研究鲜有报道,给国内的兽医科技
工作者提供了新的研究课题。但通过对 PCV更深入
的研究,将发现有效的疫苗来预防此病,对降低全球
养猪业的经济损失起着不可估量的作用。
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