全 文 ：·综述与专论·
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2010 年第 7 期
猪精液冷冻损伤机理研究进展
宋德荣2 王棋文1 刘光瑞3 张尤嘉4
(1毕节学院草业生态研究所，毕节 551700;2毕节地区畜牧兽医科学研究所，毕节 551700;
3兰州市动物疫病预防控制中心，兰州 730050;4兰州三和生物技术研究所，兰州 730050)
摘 要: 阐明降温-升温过程精子损伤的原因是目前冷冻生物学的研究热点之一。借助分子生物学手段，猪精子冷冻损
伤研究已深入到分子水平，对在冷冻过程中的损伤机理研究方面取得很大突破。在参考国内外文献的基础上，综述了猪精液
冷冻损伤机理在近几年来的研究进展。
关键词: 猪 精液冷冻 损伤机理 进展
Advances in Damage Mechanism of Cryopreservation of Boar Semen
Song Derong2 Wang Qiwen1 Liu Guangrui3 Zhang Youjia4
(1Pratacultural Ecological Institute of Bijie University，Bijie 551700;2 Institute of Zootechnics
and Veterinary Science of Bijie Region，Bijie 551700;3Lanzhou Center for Animal Diseases Control ＆ Prevention，
Lanzhou 730050;4Sanhe Biological Technology Research Institute of Lanzhou，Lanzhou 730050)
Abstract: Clarifying the reason of sperm damage between the cooling-heating processes is a hotspot in frozen biology． By means of
molecular biology，the research of spermatozoa injury during cryopreservation have reached molecular level，and made great breakthrough
in damage mechanism study． The research and development were reviewed based on the literature from home and abroad in recent
years．
Key words: Boar Sperm cryopreservation Damage mechanism Development
收稿日期:2010-03-04
基金项目:毕节学院校级项目(20092021) ，贵州省优秀科技教育人才省长专项资金项目(黔省专合字 2009129)
作者简介:宋德荣，男，副研究员，主要从事动物遗传育种学研究;E-mail:sdr0857@ 126． cn
通讯作者:王棋文，男，讲师，主要从事哺乳动物生殖生理研究;E-mail:wangqiwen123@ hotmail． com
猪精液的冷冻保存始于 20 世纪 50 年代，
1970 年，Polge 用腹腔手术授精法将解冻后的精
子直接注入输卵管获得 83%的受精卵，并得到冻
精生产的小猪，自此拉开了猪冻精技术的序幕。
由于对精液在冷冻-解冻过程中所发生的变化及
其受冻害的机理不十分了解，仅凭实践摸索提高
冻后品质，缺乏理论依据。所以，虽然猪冻精在
1975 年就有商业应用，但其应用还不到 1%，且
这个比例在许多年里都没有大的变化［1］。近年
来研究发现，冻精即使是液氮保存期间损伤也在
进行中［2］，蛋白质等大分子的含量、功能的改变
是精子冷冻损伤的主要形式［3，4］，只有深入研究
猪精液冷冻损伤的分子机理才能为其冷冻保存
提供强有力的理论指导，使其技术方法的探索和
优化取得突破性进展。
1 猪精液冷冻特点
与其它家畜相比，猪精子对低温打击和冷冻都
很敏感，不同物种之间由于精子质膜的不同而对冷
冻的敏感性不同。可能是精子膜上胆固醇和磷脂的
比例、烃链的饱和程度、蛋白质和磷脂的比例等影响
着质膜的流动性和精子抗冷休克的能力。一方面猪
精子膜上胆固醇 /磷脂的比例较低，磷脂酰乙醇胺和
鞘磷脂的含量较高［5］，胆固醇的分布不对称，外膜
的大于内膜，使内膜对冷休克特别敏感。当温度降
低的时候，膜磷脂的侧移受到限制，从液晶相转为凝
胶相，膜的刚性增强，膜上不同磷脂的相变温度不
同，可导致膜成分侧移和重排，膜表面脂质分离，蛋
白质不可逆凝集在一起［6］。He［7］挑选了 5 种具有
2010 年第 7 期 宋德荣等:猪精液冷冻损伤机理研究进展
特定酞链的磷脂加入猪的冷冻精液中，显著提高
了冻后精子的活力和生存力，可能因为该脂质体
与猪精子膜融合，改变了膜脂质成分的组成比例，
降低了精子对冷冻的敏感性。另外，膜状态的改
变还将伴随游离 Ca2 +从细胞外流入细胞内，刺激
依赖 Ca2 +的细胞获能，诱导提前获能［8］。此外，受
猪精子遗传特点的影响，冻精的体外活力和解冻
后受精能力在不同的种公猪个体之间也存在很大
的差异。依据多变模型分析系统分析精子冻后活
力，Thurston等［9］把个体猪分成好、一般和不好的
冷冻精子供体组。
2 冷冻-解冻过程中造成的损伤
2． 1 精清的影响
精清充当着精子载体的作用，并且有稀释精子，
为精子提供代谢物质的功能。但精清中同时存在着
许多尚未被人类所了解清楚的蛋白质成分［10］。在
多种动物的精清中已发现许多抗生育因子，如去能
因子(D，F) ，人类抗生育因子，兔顶体稳定因子，牛
精浆素，山羊卵黄凝结酶等［11］。这些因素通过抑制
精子的获能，顶体反应的发生，诱导顶体酶的提前释
放等机制影响精子活力;猪精液中 Zn2 +对冷冻保存
不利，它能在低温下与精子蛋白质膜发生反应，在精
液中添加卵黄就可以阻止 Zn2 +与蛋白质膜发生反
应，降低精子的死亡率，而且卵黄还有防止精子发
生冷休克的作用［12］。但是研究结果显示，当稀释
液中含有卵黄时，精清对解冻后精子活力有不利
影响，精浆中尿道球腺分泌物(BUS)则是造成这
一现象的主要原因。Morton等［13］从山羊精浆中提
纯了一种分子量为 55 － 60 kD的糖蛋白 BUSgp60，
它具有三酰甘油水解酶活性，可以将脱脂乳中剩
余的甘油三脂水解成脂肪酸，后者对精子有毒副
作用，其部分序列同各种类型胰脂肪酶具有 50%
－ 70%同源性，猪 PL对精子的伤害作用同 BUS 和
BUSgp60 一致。因此，在精子的冷冻保存等体外
处理过程中需要去除一定量的精清，减少精清对
精子的毒害作用。
2． 2 冷冻造成的损伤
低温打击学说包含降温对细胞膜的损害和精子
代谢功能的改变，这种改变很可能是由于细胞膜的
结构和组成发生重组而形成的［14］。这种侧向移行
可能会产生脂类非双分子层结构的微区，也可能改
变细胞内围绕蛋白质的环境。在解冻时，这些变化
诱发了细胞膜和顶体膜的融合，同时影响了蛋白质
的活性，导致细胞膜对水和溶质的通透性发生根本
性的变化［15］。降温对精液的影响可能是由于降温
造成精细胞内物质状态发生分离移行，其程度主要
决定于细胞膜组成元素的结合程度，如胆固醇与磷
脂的比例，脂类非双分子层物质的浓度，饱和的碳氢
化合物和细胞膜上蛋白质与磷脂的比例等［16，17］。
当胞内处于超冷状态，如细胞尚未充分脱水，冰晶会
迅速集聚而引起温度瞬间剧增，细胞将会在此温度
的剧烈变化过程中遭受致命的损伤。Guthrie［14］研
究了冻前精液在 15℃保存不同时间后对冷冻后精
子质膜功能和受精能力的影响。发现保存 3 h 或
24 h，用冷冻后的精子输精，对 23 d 妊娠率无显著
影响，但保存 24 h 可诱导精子质膜磷脂聚集而获
能并出现早期凋亡，从而导致胚胎回收数和窝产
仔数都显著下降。因为不同动物精子质膜的组成
不同，所以，降温对不同动物精子的影响程度也不
同:猪精子对温度的改变特别是对降温非常敏感，
牛、羊、马精子的敏感性次之，犬和猫的精子有一
定的敏感性，兔、人和禽类精子对低温打击的敏感
性较差［18］。
在冷冻过程中，一方面，细胞内外形成的冰晶本
身对细胞膜及细胞的内部结构会产生机械性损害，
导致细胞死亡，这是冷冻的物理损伤，而且损伤不可
逆;另一方面，降温速度过慢，精细胞会长时间暴露
于高渗环境中引起过度脱水死亡即“溶液效应”，
即溶质浓度升高，导致细胞脱水，蛋白质变性，膜
破坏、酶泄露等，还能使其对冷冻的敏感性增加。
如能以 5 000℃ /s 的速度降温，即在 0． 026 s 内
0℃的液态精液冷却到 － 130℃以下，就能越过
－ 60℃至 0℃这一冰晶化温度区域形成对精子无
害的玻璃化冷冻状态，但是目前技术尚不能达到
此降温速度。
2． 3 精子自身过氧化损伤
精子在冷冻过程中会产生活性氧(ROS) ，可
以氧化多不饱和脂肪酸，使膜发生脂质过氧
(LPO)［19］，这是引起精子损伤的一个重要原因。
哺乳动物精浆中含有清除 ROS 的抗氧化酶，包括
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生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2010 年第 7 期
超氧化物歧化酶 (SOD)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱
甘肽过氧化物酶(GPX)等，保护精子免受氧化损
伤。研究发现，猪精浆和精子中 SOD 活性较高，一
定活性的 GPX，但 GR 活性极低，没有检测到
CAT［20］;精子质膜上多不饱和脂肪酸的含量差异
也是导致动物精子遭受过氧化损伤的原因之一，
牛、羊、猪的精子膜上的多不饱和脂肪酸含量比
兔、犬、人的多。Waterhouse 等［21］还证明不同品种
猪精子的质膜脂肪酸含量也有所不同。猪精子膜
上含有比其它家畜更多的多不饱和脂肪酸，更易
受 ROS攻击发生脂质过氧化，结果使大量的精子
膜损伤，呼吸抑制，细胞内酶泄漏［22］，所以猪精液
对超低温冷冻更加敏感。在猪精液冷冻稀释液中
添加抗氧化剂(如 SOD、CAT 等)可以减少精子的
脂质过氧化损伤［23］。
3 精子形态结构的变化
与其它家畜的精子相比，猪精子极不耐冻。冷
冻和解冻之后，其精子总体结构变化不大，但由于细
胞膜内脂类-蛋白的结合发生改变，细胞膜的通透性
增加，致使氨基酸、脂肪酸和有关酶损失［24］。观察
发现，冻后精子的主要变化为质膜膨大，破裂甚至散
失，顶体肿胀，外膜形成空泡，顶体内容物丢失等。
在精液解冻以后，顶体遭受损害，顶体外膜发生膨
胀、剥离和破损，顶体层膨胀、透亮，顶体内膜的颗粒
状物质分解。在某种情况下，精子的核也发生透亮
及颈部的某些成分被溶解的现象。不过郭年藩［25］
认为，细胞内多种物质的损失并不影响细胞核中的
DNA。冷冻后的损伤精子顶体发生与精子体外获能
和顶体反应类似的囊泡化现象，称之为假顶体反应。
在猪的冷冻后精液中，顶体通常呈现膨胀现象，但有
的顶体双层外膜发生内折然后形成串状囊泡;有时
双层顶体外膜有经自我融合形成囊泡;也有一些却
成堆位于顶体内。从猪的精子顶体反应中发现，囊
泡似乎是在某侧的特定区域内先发生，但冻后大多
数精子质膜的丢失晚于顶体双层外膜囊泡的
形成［26］。
4 细胞、分子水平的变化
近年来，随着各种新的检测手段的相继建立，人
们可以检测到精子细胞质膜化学组成的变化、冷冻
前后基因、蛋白表达量的变化，从而为分析冷冻损伤
机理提供了更确凿的科学依据。Cerolini 等［27］测得
质膜各种脂肪酸的比例，在不同的个体含量不同。
Thurston等［9］分析了质膜表面基因限制性片段多态
性的不同，发现其中 16 个片段对冷冻结果影响较
大。2006 年，Ricker等［28］用傅氏转换红外光谱仪和
扫描电镜检测到在低温下质膜膜相的变化，由于膜
相的变化引起膜通透性改变、活力下降、信号通路改
变，直至引起细胞死亡。Gadca 等［12］发现低水平的
活性氧，特别是 O2 －、H2O2，调控着获能和顶体反应
的发生。过量的 Ros 导致精子的获能样变化、膜的
损伤、DNA损伤，从而引起精子的活力下降、死亡，
受精率降低。Fraser 等［29］用改良的中性彗星试验
评价 DNA的损伤。DNA 的完整对于自然受精和人
工授精的受精率、胚胎的正常发育、胎儿和后代的生
长都是至关重要的。在冷冻前后精子成分的变化
上，Zeng 等［30］对比了冷冻前和冷冻后猪精子蛋白
成分的变化，发现冷冻后一种 90 kD 的热应激蛋白
(HSP90)有所降低，进一步研究发现，与未冷冻精子
相比，当温度降至 5℃时，HSP90 降低幅度达 64%。
因此，HSP90 水平的降低有可能与解冻后精子活力
降低有关。金一等［31］以冷休克处理过的猪精液为
试验材料，在精液稀释液中添加可以快速选择性地
抑制 HSP90 活性的抗生素抑制剂(CA) ，发现精子
运动能力和 HSP90 表达水平均下降，推测可能冷
却过程中 HSP90 水平下降导致 ATP 合成减少，从
而引起精子运动能力下降，但是两者的相关程度
及由哪个信号通路所决定仍需要进一步的研究。
Martin等［4］在冻融的牛精子中检测出一种线粒体
核孔蛋白，这种蛋白是一种细胞凋亡前因子 Bax，
却没有检测到其拮抗因子，同时还检测到了细胞
色素 C、凋亡诱导因子(AIF)和半胱天冬酶-9。由
此得出，在猪的精液冷冻中用上述技术手段进行
检测的很少，这也是猪精液冷冻技术长期迟滞不
前原因之一。
5 小结和展望
就目前研究而言，对猪精液冷冻损伤机制并
没有获得根本性的改进。虽然精液的天然异源
性丧失以及精子发生了假成熟变化是导致冻精
受胎率低的重要原因，但是在冷冻前后精子的微
观变化了解的还不太清楚。近年来还有人提出
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2010 年第 7 期 宋德荣等:猪精液冷冻损伤机理研究进展
“组合强化效应”［32］，强调受精能力的获得并不
是由于某一个成熟步骤而是相互关联的许多步
骤间相互作用的结果，应用冷冻保存精液能影响
“组合强化效应”。虽然作为可育的精子需具有
一些必要品质已经被证实，但是在一些不同的环
境中所需要的组合效应仍然不清楚。因此，进一
步探索温度、应激反应对精子膜的影响，了解个
体间精子膜的分子组成结构，如构成膜的磷脂不
饱和程度及膜的分子流动性间的差异是否与精
子抗冻能力有着直接的关系，分析各种蛋白在冷
冻前后表达差异，是将来研究精液冷冻损伤的一
个很重要的研究方向。
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