全 文 ：生物杖术通报
· 研究报告 · 丑了口了百月 口 功凭 年增刊
鸡传染性支气管炎病毒 基因与猪 基因
在 细胞中的融合表达
张明富’, 陈汉阳 ’, 彭博, , 俘铁侍, , 陈焕春, , 郭爱珍 , ,
’华中农业大学农业微生物学国家重点实验室 , 武汉 华中农业大学动物医学院 , 武汉
, 华中农业大学湖北省预防兽医学重点实验室 , 武汉
摘 要 根据 中发表的猪 娇 段基 因及 基因序列 , 设计并合成引物 。 以猪肝组织总
为模扩增出猪 药 基因 , 以含全长 基因的质粒为模板扩增出 基因 , 分别克隆至 载体 。
测序表明 , 所获得的 基因大小为 , 大小为 , 序列正确 。 将 !∀ 与 基因串连 , 插入
含有人组织型纤维蛋白溶酶原激活物分泌信号肤序列 真核表达载体 一 上 , 在 细胞上进
行瞬时融合表达 。 经免疫荧光和斑点杂交检测 , 表达产物同时具有 蛋白和 药 活性 。
关键词 禽传染性支气管炎病毒 基因 猪 茄 基 因 真核表达 融合表达
! 药
,
, 罗 一 !∀ 罗
罗 浦
· !∀ #∃ #% &∋ ()∗ + , − ,++. / 0 1 2∃3 ( 4 5# − 6&& 7 /0 1 8 )&∀! ()9
+ , #∃ # 2∃ 3 0 &: ∃# 6娇Fegene w ere sub eloned into the sam e PeD N A3.l一 t P A v e e t o r s w i t h t h e t i s s u e P l a s m i n o g e n a e t i v at o r
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晓y words: IBV 51 gene Porcine IgG Fe gene Euk柳otie ex讲ession Fu sion expTession
鸡传染性支气管炎病毒(A vi a。 infe ct i ou , b ro n -
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I B V
) 是具有囊膜的单股正链 R N A 病
毒 , 与近年新发现 的 SA R S ( severe aeute re spira to口
sy n d ro m e , S A R S
) 冠 状 病毒 (SA RS eoro naviru s ,
s A R s
一
co V ) 同属于冠状病毒科成员[’〕。 随着 sA Rs
的爆发流行及 SA RS 溯源研究的重大进展 , 冠状病
毒跨种感染已成为研究热点〔’, , 〕。 而与跨种感染相
关的病毒受体结合蛋白因此倍受关注 。 IB V 是冠状
病毒的代表种 , 导致鸡的急性 、高度接触传染性呼吸
道疾病 , 是较为严重的动物冠状病毒病 , 有研究者将
IB V 作为 SA R S一 C o v 的模式病毒进行研究〔’,4 5〕。
IB V 虽血清型众多 , 但宿主嗜性十分严格 , 自然宿主
仅限于鸡 , 组织培养敏感细胞为鸡胚肾细胞 , 经适应
后可感染 v ero 细胞〔’J 。 据报道 IB v 可利用猫冠状
基金项目:973SA R S 防制基础研究专项 (20 3C B5 141 22 ) ;湖北省科技攻关计划 (项目编号 :20 6A A2 05 A0 2)
作者简介:张明富(1981一 ) , 男 ,硕士研究生 ;E 一 m a , l : z n l fl le 一10 @ w e b m a il. h zau . e du .C n
通讯作者:郭爱珍 , E 一 m a i l : a i z h e n @ m a i l . h z au . e d u . c n
年增刊 张明富等:鸡传染性支气管炎病毒 Sl 基因与猪 I娇 Fc 基因在 H eL a细胞中的融合表达 277
病毒受体? 猫氨基肤酶 (。m in o p e p tid a s 。 , A P N ) [ 6 ] ,
但其自然受体尚不清楚 。 不过业已证明 , IB V 的受
体结合蛋白为病毒囊膜的纤突蛋白(Spike , S) 〔’〕。
S 蛋白在翻译后被宿主蛋白酶切割成 Sl 和 S2 两个
部分 , Sl 蛋白与受体结合及细胞膜融合有关 , 决定
病毒的组织嗜性[s] 。 同时也是 IB v 的主要免疫原
基因 , 可以诱导抗体中和作用 、血凝抑制抗体以及特
异胜 C孔反应[, , 1 。] 。
哺乳动物免疫球蛋白IgG 的 Fc 段具有较强的
sPG 及 sPA 非特异性结合力 , 这种特性使其作为一
种蛋白质标签 , 在蛋白质鉴定和纯化等下游操作过
程被广泛应用于基因工程研究[川 。 同时 FC 段通过
与免疫细胞的 FC受体特异性结合 , 可促进与之偶联
的蛋白质抗原的免疫提呈过程 , 因此 , Fc 标签也被
用作抗原的分子佐剂【”〕。 本研究克隆并融合表达
了 IB V 51 基因与猪 IgG Fe 基因 , 旨在运用猪IgG Fe
片段作为 IB V SI 的蛋白质标签 , 以期进一步通过
sP 灯sP G 与Igc FC 的结合及 s1 蛋白与细胞受体的
特异性结合特征 , 分离和鉴定 IB V 自然受体。 同时
sl 一 I g G 融合表达在 IB V 免疫预防中具有潜在应用 。
1 材料和方法
1.1 菌种和质粒
大肠杆菌(E .co li )D H5a 由本室保存;人宫颈癌
细胞系 H e肠 购 自中国典型培养物保藏中心 (武
汉 );克隆载体 pM D 18一 T 购 自TaKaR a 公司 ;含有 S
全长基因的载体 pE程SCS 由本试验室彭博硕士构
建并惠赠;在真核表达载体 Pc D N A3.1 Bam H I位点
含人组织型纤维蛋白溶酶原激活物(tP A )分泌信号
肤序列的 Pc D NA 3.1一tP A 由本实验室改造并保存 。
1
.
2 试剂
D M E M 粉剂和胎牛血清 (FBS )购 自 G IBC O 公
司。 R N A 提取试剂盒 R N A 一s o L v À R e a g e n t R N A x -
5 0 一atio n s o lv e n t , 购 自美 国 o M EG A 公 司 。 抗兔抗
IB V 阳性血清由本实验室 自行制备 , 系将 IB V M4 1
株病毒 (本实验室保存)免疫家兔后制备 。 异硫氰
酸荧光素(FI TC )标记羊抗兔 IgG 、羊抗猪 IgG 及辣
根过氧化物酶(H R P) 标记的羊抗兔 IgG 、羊抗猪 IgG
均为 SBA 公司产品 。 脂质体转染试剂盒为 GI B cO
公司产品 。 T a K a R a Tw o S t e p R N A p C R K i t ( A M v )
试剂盒 , 各种工具酶均为 Ta K aRa 公司产品 。
1
.
3 引物
根据 NCB I公布的猪 IgG 序列 (Ge nBank A eees-sion num ber:91505204 9 )设计特异性引物 , 扩增猪
IgG Fc 段自绞链区至 C 末端 1002 个氨基酸 ,在序列
两端引人 EeoR I与 X hol酶切位点 。 根据 IBV M4 1
51 基 因 序 列 ( G enBank aeeession num ber:
A Y561712.l)设计特异性引物 , 扩增 IB V 51 基因上
5 一 1 6 08 位之间的序列 , 在序列两端引人 Bam HI
与 Eco RI 酶切位点 。 引物由上海生物工程公司合
成 , 序列如下 :
FeF :Pri m er s ’一G A A 竹C GTTGAGGTCGTC(;TGT-3‘ ( 下划线加粗字体为 Ec oR I酶切位点)
FeR :Pri m er s ‘一C T C G A G A C C C T G A G T C T G G A -
3
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( 下划线加粗字体为 Xh 。 I 酶切位点)
SIF :Pri me r s‘~ (芜G G G A rrC C G (:T frG rA T G A C A C-
TA 引T CT 一3 ( 下划线加粗字体为及抓HI 酶切位点)
SIR :Pri me r s’- C C G ( ; A A T T C T C T A A A A C G A C (了r~
(;T l, 一3 ’ ( 下划线加粗字体为及。RI 酶切位点)
1.4 猪 IgG Fe 基因的 R T 一P C R 扩增
选健康猪一头 , 屠宰取其肝脏 , 立即置于液氮 。
剪取 19 肝脏 , 加人液氮进行研磨 , 按 R N A 一 s 0 Lv ?
R e a g e n t R N A Is o la tio n S o lv e n t 试剂盒说明书进行操
作 , 提取猪肝脏总 RN A 。 以上述 R N A 为模板 , 用
TaK aR a Tw o Step R N A PCR Kit (A M V )试剂盒进行
两步法扩增 。 反应体系按该两步法试验盒说明配
制 , 扩增引物为 Fc F 和 Fc R , 第一步反转录条件为 :
50℃延伸 30m in , 9 9 ℃变性 sm in , 4 ℃保存 sm in 。 第
二步 PCR 扩增条件为:94 预热 Zm in 后 , 进人下列循
环 :94℃ 305 , 5 7 ℃ 30 5 , 7 2 ℃ 1.s m in , 3 5 个循环后 ,
7 2 ℃延伸 10m in , 于 4℃保存 。
1
.
5 I B V S I 基因的 PC R 扩增
将含有 IB V S 基因全长的重组质粒 pE犯SC 转
化大肠杆菌 D H 5a 感受态细胞 , 增殖培养后提取质
粒 D N A 。 以上述质粒 D N A 为模板 , 按常规体系进
行 pCR 扩增 , 扩增引物为 Slr 和 SIR , 9 4 预热 sm in
后 , 进入下 列循环 : 94 ℃ 405 , 5 ℃ 复性 1.sm in ,
7 2 ℃ 延伸 lm in , 3 5 个循环后 , 7 2 ℃ 延伸 10m in , 反
应结束后置 4℃保存 。
1
.
6 I g G F C 基因与 IB V sl 基因的克隆及序列分析
取 6闪 纯化后的扩增产物及 1闪 T ve ct or , 通过
生物杖术通报 B to te ch no le gy 200 8 年增刊
T4 D N A Li ga se进行连接 , 1 6 ℃下反应过夜 , 连接产
物转化 DH 5a 感受态细胞 。 扩大培养后 , 提取质粒
进行限性酶切 鉴 定 , 分别获得 重组 克隆载体
pM D18T一 I g G F e 和 pM D 18T 一5 1 。 挑取阳性克隆送上
海生物工程公司进行序列测定。 用 D NAs si t软件
分别推导 Sl 基因 、 I g G Fc 基因序列的氮基酸序列 。
用 BLA ST 软件 比较各序列与 NCBI 已知序列相似
性 。
1
.
7 I g
GF
c 一
sl 融合基因重组真核表达载体的构建
利用 IgG Fc 基因引物引人的5 ’Ec o R I 及 3 ’Xh 。
I 位点 , E c O R I + Xh o l 双 酶 切从 重组 质 粒
pM D 18T 一I g G F e 上切割下一个 1 o obp 的片段 , 1 .
0 % 琼脂糖凝胶电泳回收;同时利用 Pc D NA 3.l一tP A
上的 Xh o l + EeoR I 位点 , 双酶切 peD NA 3.l一t P A
空载体 , 电泳 回收 。 配好连接体系 , T4 D N A Li g as e
16 ℃连接过夜 , 连接产物转化 E .co li D H 5a , 挑取单
菌落扩大培养后小提质粒 。 Xh o l + Ec o R I 双酶切
筛选阳性克隆 ,命名为 Pc D NA 3.1一tP A 一I g G Fc 。
利用 Sl 基因上游引物引人的 Bam HI 位点及下
游引 物 引人 的 Ec oRI 酶切 位点 , 从 重组 质 粒
pM D1 8T 一 S1 上切割下 Sl 片段 , 电泳回收 Sl 片段 。
同时 , 利用 Pc D N A 3. 1一 tP A 一 I g G Fc 上 的 Ec oRI 及
B am H I位点 , 用 Bam H I + Ec oRI 双酶切 peD N A3.l-
tpA 一 I g G F e , 电泳回收;51与 PeD NA 3.l一t p A 一 I g G F e 由
T4 D N A Li ga s。 在 16 ℃ 连接过夜 。 连接产物转化
D H 5a 感受态细胞 。 挑取重组菌小提质粒 。 B a m HI
+
Xh
o l 双酶切鉴定 Sl 的插人 , 用 Nde l 鉴定插人方
向。 阳性重组载体命名为 peD NA 3.1一t PA 一I g G F e S I 。
挑取 阳性克隆子扩大 培养 , 大量提取质粒并用
PEG80(X) 加以纯化 。
1
.
8 阳性重组质粒转染 H eLa 细胞
按脂质体转染试剂盒说明书操作。 具体步骤
为:转染前 ld , 在6 孔细胞培养板中接种细胞 , 待细
胞单层铺满底面积的 80 % 时 , 准备转染 。 取两只
1.5 m l无菌 Eppendorf 管 A 和 B 。 管 A 加人 8卜1 L l-
P o r E C T IN 2 0 0 和 250协l 无血清培养基 o刃I -
M EM , 混匀后 室温静置 sm in 。 其间于管 B 中加人
25 0 闪无血清培养基 0四一 M E M 和适量的 8此 重组
载体 DN A 。 同时设 Pc D NA3 .1一tP A 空载体对照 。 将
管 A 中的 LIPO FE Cn N 2000 和 O盯I一 M E M 混合液
滴加至管 B 中 , 混匀后于室温静置 20 m in 。 其间吸
弃待转染细胞孔的培养基 , 更换无血清培养基(O P-
TI 一M E M) 。 吸弃待转染细胞孔的无血清培养基 , 将
管 B 中的50 闪混合液滴加到细胞单层上 , 补加
500 林1 0叩一 M E M ,轻轻摇匀。 于 5% C OZ培养箱中
37 ℃培养。 培养6h 后 , 吸弃转染混合液 , 加相应的
生长液继续培养 , 36 h 后即检测 。
1
.
9 IB v sl
一
I g G Fc 瞬时表达的鉴定
1.9 .1 免疫荧光检测 将待检细胞单层用 PBS 洗
涤 l 次 。 每孔加 500林1 10 % 甲醇室温固定 sm in 。
P B S 洗涤 3 次 , 加含 3% 灭活小牛血清的 PBS 封闭
30 m in 。 以 PB s 洗涤 3 次 , s m i可次 , 即进行直接和
间接免疫荧光检测 。 间接检测是先与兔抗 IB V 血
清(500 x稀释)于 37℃下作用 lh , P B S 洗涤后再与
羊抗兔荧光二抗(Zo x 稀释 )于 37 ℃作用 lh 。 直
接检测即直接加羊抗猪荧光二抗 (Zo x 稀释 )于
37 ℃ 下作用 lh 。 荧光二抗作用完之后吸弃上清 , 以
PB S 洗涤 5 次 , 立即于荧光显微镜 (O lym pus IX7 0 )
下观察 。
1
.
9
.
2 斑点杂交检测 (D ot 一 bl ot ) 收集转染 36 h
后的细胞上清及 1% Trit on 处理 30 m in 的细胞裂解
液 。 以枪 头吸 ro 闪 样点于硝酸纤维素膜上 , 于
37 ℃温箱内烘干 , 继续在原点样处滴加 10闪样品 ,
烘干 。 如此反复5 次至总上样量在 50林l。 于 TBST
稀释的 3% BSA 中封闭过夜 。 取 出 , T B S T 漂洗 3
次 , s mi 可次 , 即可进行直接和间接酶联免疫吸附检
测 。 直接检测即加入 H RP 标记羊抗猪二抗 (5 00
x 稀释) , 室温下振摇作用 lh; 间接检测即先加人
TB ST 稀释的一抗 (兔抗 IB V 血清 , 作 1 oo x 稀
释) , 室温内轻轻振摇作用 lh 。 取出 , T B S T 漂洗 3
次 , 再加人 T BST 稀释 H RP 标记的羊抗兔二抗 (5
OO0 x 稀释 ) , 室温内轻轻振摇 lh 。 二抗作用完毕
后 ,将膜在 TBST 中漂洗 3 次 , 再转人 TB S 中漂洗 2
次 。 加底物液显色 , 去离子水终止反应 。
2 结果
2.1 基因克隆与序列鉴定
以猪肝总 R N A 为模板 , 通过 RT 一 P C R 扩增猪
IgG Fc , 结果得到预期大小 (l 00 bp ) 的目的片段
(图 1) 。 试剂盒阳性对照扩增出阳性带 , 而阴性对
照无扩增带 , 表明方法有效 。
年增刊 张明富等:鸡传染性支气管炎病毒 Sl 基因与猪 I笋 Fc 基因在 H eL a细胞中的融合表达 279
图 l 猪 IgG Fe 基因的 RT 一p C R 扩增
M : DNA ladder DIZ 仪洲〕; l , 2 : P i g l i v e r s am p l e s ; 3 : p o s t i v e
e o n 吻1provided by rhe kir;4: negat ive eontro l
以含有 IBV M 4 l S 全长基因质粒 pET2 8CS 为
模板进行扩增 S1 基因 , 预期大小为 1554 帅 , 对应第
19 ~ 53 6 位氨基酸 , 不包括信号肤序列 (1 一 18 位氨
基酸)及蛋白酶裂解位点的部分碱基 。 P C R 产物经
琼脂糖凝胶电泳检测 , 在 1 SO0bp 左右有一条特异
带(图 2 ) , 与预期结果相符。
基相似程度达到 10 0% , 序列内部不含终止子 , 表明
已经成功获得猪 IgG Fc 基因。 所获得的鸡传染性支
气管炎病毒 S1 基因与 M 41 株 Sl 基因参考序列
(G enB ank aeeession num ber: A Y5 617 12.1 )相似性
为 9 % , 无氨基酸突变 , 其内部也无中止子出现 。
用 TM H M M 软件对 sl 蛋白序列进行跨膜区分析 , 证
实该序列已经不含跨膜区 。
2
.
2 IB v sl
一
I g G F 。 融合蛋白真核表达载体的构建
将 IB v sl 基因与 Igc FC 基因根据预先设计好
的酶切位点 , 分别克隆在 Pc DN A 3.1一tP A 的 Bam HI+ Ec oR I位点间与E eoR I + Xh ol 位点间 。 阳性重组
子经 B am H I + Ec oRI 双酶切鉴定 , 结果显示 Pc D-
NA3 .1一 t p A 一 I g G F e 出现 5.skb + Ikb 两条带 , p e D -
N 月 .1一t以 一I g G Fc s l 出现 5.skb + 2.6kb 两条带 , 与
预期相符(图 3 ) 。 取双酶切正确的重组真核表达载
体 peD N A3.1一 t p A 一 I g G F e S I 进一步用 N del单酶切鉴
定方向 , 正向连接的重组子会出现三条带 , 依次为
soobp + 1 600bp + 5 60obp , 电泳结果与预期相符
(图 4 ) ,表明 Sl 基因和 IgG Fc 均为正向插人 , Sl 基
因位于融合基因的5 ‘端 , 载体构建正确 。
图 3 peD NA3 .l一t P A 一 I g G F e s l 经 Bam H I+ 尤入。 1 酶切
M l:D NA ladder DIZ (翔);M2 :DNA lad derD L15《X X)
图 2 51 基因的 PC R 扩增
M :DNA lad derDU (XX);l, 2 : P C R p rod u e t o f 5 1 g e n e
P C R 产物经回收后 , 经 A 一T 克隆法插人 pM D1 8
一 T 载体 , 构建了 pM n l8T 一 I g G F e 和 pM D 18T 一5 1 克
隆载体 。 挑取阳性重组子送 Ta K aR a 公司测序 , 将
测序结果与 N CBI 数据库进行 比对 。 结果表明所获
得的 IgG 基因与 NC BI 上已知猪 IgG 重链基因(G en -
Bank aeeession num ber: 91505204 9 及 9147523191)相
似性为 100% , 与 91433127 猪 IgG3 序列有 983 个碱
2.3 IB vs l一 I g G Fc 融合蛋白的瞬时表达及检测
2 .3 . 1 免疫荧光检测 重组真核表达载体 Pc D -
N A 3.1一t P A 一I g G F e s l 转染 H eLa 细胞 36h 小时后进
行免疫荧光检测 , 分别用直接和间接免疫荧光两种
方法检测猪 IgGFc 和 IB V SI 基因的表达情况 。 结
果显示 , 无论间接免疫荧光还是直接免疫荧光检测 ,
均能观察到细胞的特异性绿色荧光 , 而空载体转染
对照组细胞不产生绿色荧光 (图 5 ) 。 这表明 IgG Fc
生物技术通报 B to te chn olo gy 200 8 年增刊
图 4 peD N A3 .l一 t p A 一I g G F e s l 经 刀己已 1 酶切鉴定
M : DNA la dderDL 15(X刃 ;l : pe D N A3 . l 一 I g(; F e S 1 e u t b y 八妞e
;2 : p e D N A 3 . 1 eu t场 N 己吧 I
和 IB v sl 基因在 H eLa 细胞上均获得了表达 , 且表
达产物主要存在于细胞内。 产物具与抗 IB V 抗体
及抗猪 IgG 抗体结合的双重活性 。
图 5 免疫荧光检测 s1 一F C 融合基因在 H eLa 细胞的表达
A I ,
A2
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pre ssion :B I , B Z : D i re e t i m m u n o fl u o re s e e n e e as s a y fo r I
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g
e n e
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P 化SS10 fl
2 . 3 . 2 斑点杂交检测用胰酶 重组质粒转染 H eLa
细胞后进行斑点杂交检测 , 结果从细胞破碎液中能
观察到特异性的阳性反应斑点 , 而细胞上清中则观
察不到阳性反应 。 表明两个基因均在在 H eLa 细胞
上得到 , 产物具有天然 Sl 蛋白和猪 IgG 的免疫活
性 。
3 讨论
克隆了 IB v sl 基 因与猪IgG FC基因 , 为提高表
达效率同时使目的蛋白能充分保持两种蛋白独立的
生物学活性 , 在选择 IB V SI 基因克隆区域时保留了
水解位点部分氨基酸以增加蛋白间的距离 , 且去掉
了两个基因自身的信号肤序列 。 鉴于 Sl 蛋白功能
区在 N 端[9, ’。〕, 在构建融合表达载体时将 IB v sl 放
在了表达的上游 。 重组表达载体 pe DA N 3.1一 t PA 一 1 9 -
G F C SI 在脂质体作用下转染 H eLa 细胞 , 孵育 36h
小时后用免疫荧光检测 , 无论直接还是间接法均能
观察到明显的绿色荧光。 进一步用斑点杂交检测证
实了产物表达 , 且发现表达产物主要存在于细胞内。
至于表达中tP A 分泌信号肤没有发挥作用的原因有
待深人研究 。 由于表达的 Sl 蛋白与 IgG Fc 均能与
相应抗体发生免疫反应 , 表明两种蛋白具有良好的
生物学活性 。 这对下一步利用免疫共成淀或亲和层
析方法研究 Sl 蛋白与细胞受体的相互作用奠定了
良好基础 。
鸡传染性支气管炎是由传染性支气管炎病毒
(IB V )引起的鸡的一种急性 、高度接触传染性的病
毒性疾病 , 给世界范 围内的养鸡带来了巨 大危
害[’} 。 作为 IB v 最重要的抗原 , sl 蛋 白历来就是
IB v 研究的热点 。 戴亚斌等〔” }利用杆状病毒表达
系统构建了2 株重组杆状病毒 , 分别在昆虫细胞中
表达了两株致病性不同的传染性支气管炎病毒的
Sl 蛋白 , 表达的蛋白可以诱导抗体产生和免疫保护
反应 。 余祖华等[’4 〕在毕赤酵母中表达了 sl 基因 ,
表达产物具有一定的免疫原性 , 可以与抗 IB v 血清
结合。 赵宝华等[‘, 〕在真核表达载体系统 pIR Sine 。
中表达同 IB V M 41 的 Sl 基因 , 转染 H eLa 细胞后获
得表达 , 表达蛋白具有中和活性 。 虽然本研究未对
所表达的 IB v sl 一 l g G F 。 融合蛋白进行免疫学试验 ,
借助以上证据 , 及 IgG Fc 段的免疫增强作用〔”〕, 可
以预测 sl 一F 。 将较 sl 具有更强的免疫活性 , 在鸡传
染性支气管炎防制中具有应用前景 。
参 考 文 献
Cavan agh D. Avian Pathol , 2 (X) 3 , 3 2 ( 6 )
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e t 习. N atu re , 2
0()
3
,
4 2 3
年增刊 张明富等:鸡传染性支气管炎病毒 Sl 基因与猪 IgG FC基因在 H eLa 细胞中的融合表达 28 1
So ng H D , T u C C , Z h an g G W , e t al . P 概 Natl Aead Sei U SA ,
2
(X)
5
,
1 0 2
(
7
)
:
2 4 3 0
一 24 3 5
.
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B ij l
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( 上接第275 页 )
多形汉逊酵母表达研究发现 , 培养基中酵母细
胞的浓度与外源基因的表达量通常呈正相关 , 一般
来说 , 细胞 浓度越 高 , 外 源基 因 的表达量 也越
高〔” , ”〕。 多形汉逊酵母在适宜的培养基中非常容
易进行高密度发酵 , 菌体密度可高达 10 0 一 1 30 岁L
菌液〔6 , “ ] , 因此外源基因可以获得的较高表达量 。
本次表达的蛋白在 PA G E 电泳中只能观察到较弱的
条带 , 主要原因是本次表达只是在普通条件下进行
的 , 而没有进行发酵表达 。 将来如果需要则可以在
发酵条件下 , 充分优化目的蛋白高效表达的各种指
标 , 包括培养基的各种营养成分 、发酵液的 pH 值 、
通气量 、 以及碳源的添加策略等等 , 以获得大量的目
的蛋白。
参 考 文 献
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S t
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1
,
1 9 9 2
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1 0
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4 1 3
一 4 1 7
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