全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2013, 39(12): 2145−2153 http://zwxb.chinacrops.org/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn

本研究由国家自然科学基金项目(31201226), 植物细胞与染色体工程国家重点实验室开放课题(PCCE-KF-2011-05)和安徽省自然科学基金
(1308085QC49)。
* 通讯作者(Corresponding author): 童依平, E-mail: yptong@genetics.cas.cn
第一作者联系方式: E-mail: wxbphd@163.com
Received(收稿日期): 2013-04-07; Accepted(接受日期): 2013-07-25; Published online(网络出版日期): 2013-10-08.
URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20131008.1304.003.html
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2013.02145
大豆谷氨酰胺合成酶基因的分类及根瘤特异表达 GmGS1β2基因功能
的初步分析
王晓波 1 滕 婉 2 何 雪 2 童依平 2,∗
1 安徽农业大学农学院, 安徽合肥 230036; 2 中国科学院遗传与发育生物学研究所 / 植物细胞与染色体工程国家重点实验室, 北京
100101
摘 要: 从 Phytozome数据库中获得包括大豆在内的 12种植物的谷氨酰胺合成酶(glutamine synthetase, GS)氨基酸序
列, 利用MEGA5.10软件进行多序列比对、构建进化树。进化分析表明, 植物 GS可以分成胞质型(GS1)和质体型(GS2)
两大类, GS1可进一步分成分 5个亚类, 包括双子叶植物为主的 I、II和 III亚类、低等植物类(IV)和单子叶植物类(V)。这 5
亚类中, 第 II类是豆科植物特有的一类, 大豆的 4个 GS1 (GmGS1β1/2和 GmGS1γ1/2)属于该亚类; 利用 qPCR在大
豆盛花期分析 GS1 基因的组织表达特异性, 结果表明不同类型 GmGS1 基因在表达部位和表达丰度上存在较大差异,
而同一类基因之间具有相似的表达规律; 4个豆科植物特有的 GS1基因在大豆根瘤中都有较高的表达量, 其中位于大
豆第 18染色体上的 GmGS1β2基因表达丰度最高; 利用原核表达系统体外表达 GmGS1β2蛋白, 诱导出分子量大小与
理论预测值一致的目标蛋白, 酶活性分析表明 GmGS1β2可以与底物发生催化反应, 具有谷氨酰胺合成酶活性, 推测
该基因在大豆根瘤氮素同化代谢中具有重要作用。
关键词: 大豆; GmGS1基因; 组织特异表达; GS酶活性
Classification of Glutamine Synthetase Gene and Preliminary Functional
Analysis of the Nodule-Predominantly Expressed Gene GmGS1β2 in Soybean
WANG Xiao-Bo1, TENG Wan2, HE Xue2, and TONG Yi-Ping2,*
1 School of Agronomy, Anhui Agricultural University, Hefei 230036, China; 2 State Key Laboratory of Plant Cell and Chromosome Engineering /
Institute of Genetics and Developmental Biology, Chinese Academy of Sciences, Beijing, 100101, China
Abstract: The purpose of this study was to analyze the evolution, classification and tissue expression specificity of soybean cyto-
solic glutamine synthetase genes. Glutamine synthetase (GS) proteins from 12 species were downloaded from phytozome data-
base, and used for phylogenetic analysis. The GSs were divided into two groups, cytosolic glutamine synthetase (GS1) and plas-
tidic glutamine synthetase (GS2) based on the maximum likelihood of MEGA 5.10 software. The GS1 group was further divided
into five subgroups, including three dicotyledons subgroups(I, II, and III), lower plants subgroup (IV) and monocotyledons subgroup (V).
All GSs in subgroup II were mainly derived from leguminous plants including four GmGS1 proteins (GmGS1β1/2 and
GmGS1γ1/2) in soybean. Real-time RT-PCR analysis of GmGS1 genes indicated that soybean GS duplicated genes had the same
tissue specificity of expression, while the four subgroup II GmGS1 genes presented higher expression level in soybean nodules
than in other tissues. Among the six GmGS1 genes, GmGS1β2 located on chromosome 18 had the highest expression level and
predominantly expressed in developing nodules. GmGS1β2 was then ligated into pGEX4T-1 vector and transformed into
BL21 (DE3) for prokaryotic expression. GmGS1β2 recombinant protein was purified by 4B-Beads and tested for GS activity by
spectrophotometer. Prokaryotic expression result showed that the molecular weight of GmGS1β2 was 39 kD, which is consistent
with previous theoretical prediction. Catalyzing reaction showed that the recombinant protein had glutamine synthetase activity,
which means GmGS1β2 encoded a functional GmGS1β2 glutamine synthetase. These results provide useful information for fur-
ther functional research of GS1 proteins involved in nitrogen assimilation in soybean nodule.
2146 作 物 学 报 第 39卷


Keywords: Glycine max (L.) Merr; GmGS1 genes; Tissue specific expression; Glutamine synthetase activity
氮是植物生长发育最主要的营养因子, 是构成
生物体内核酸和蛋白的基本要素, 在农业生产中占
据十分重要的地位。豆科植物通过共生固氮作用固
定的氮素是自然和农田生态系统中氮素的重要来
源。大豆是一种典型的根瘤固氮作物, 对氮素营养
的需求量较高, 需氮总量是禾谷类作物的 4~5 倍。
共生固氮对于满足大豆对氮素的高需求起到了至关
重要的作用。据测定, 根瘤菌通过固氮作用每公顷
可积累氮素 45.0~52.5 kg, 相当于 262.5 kg 硫酸铵,
可满足大豆一半左右的需氮量。因此研究大豆根瘤
氮素同化机制对于培育高产、优质、高效大豆新品
种具有重要意义。
谷氨酰胺合成酶(glutamine synthetase, GS; EC
6.3.1.2)是植物 N素同化途径中最为关键的催化酶之
一, 被称为植物中无机态 N 转化为有机态 N 的“门
户”, 对植物 N素吸收、同化和利用效率有极重要的
作用。GS可以催化 NH4+和谷氨酸生成谷氨酰胺, 其
中铵的来源可以是植物光呼吸或种子萌发过程中氨
基酸的再氨基化所产生的次级氮, 也可以来自土壤
或根瘤菌的固定[1-3]。高等植物中的 GS 全酶均为八
聚体, 分子量为 360 kD 左右, 每个亚基分子量为
38~45 kD, GS 同工酶主要分为两类即胞质型 GS
(GS1)和质体型 GS(GS2), GS1 主要同化从土壤吸收
的初级铵及再同化植物体内 N 循环途径释放的铵,
在根、茎、叶、根瘤等植物组织中广泛存在; GS2可
以同化光呼吸过程所释放的氨, 主要存在于叶绿体
等质体中[4]。Edwards 等[5]对 GS1 和 GS2 的功能研
究发现, 它们在植物体内起着非重叠作用, GS1主要
同化植物根系统和维管组织中硝酸还原作用产生的
氨, 负责对铵盐的积累、无机氮的吸收和循环; GS2
与光合产物中氨的同化利用以及叶片衰老有关。
Bernard 等[6]研究表明植物 GS 基因的表达受外界环
境的影响, 是环境因子调节植物氮素积累和利用的
重要分子靶点。目前, 关于植物 GS基因的命名尚没
有统一标准, 拟南芥中胞质型 GS 可以写成 AtGLN1
或 AtGSR1, 质体型 GS 基因可以写成 AtGLN2 或
AtGS2 [2-3], 玉米胞质型 GS 多用 GLN 表示[7], 根据
3′非翻译区的序列多样性, 大豆 GS1基因可以用 α、
β和 γ表示, 即 GmGS1α、GmGS1β和 GmGS1γ [8]。
农作物体内 GS 活性与许多经济性状有密切关
系。王月福等[9]发现小麦开花后各器官的 GS均具一
定活性, 其中旗叶中 GS活性最高, 后期旗叶和根系
GS 活性逐渐降低, 籽粒中 GS 活性先升高后降低,
与小麦籽粒的灌浆关系密切。Habash等[10]研究发现
小麦 GS1 活性与籽粒和茎秆中的总氮量呈正相关;
在玉米第 2 染色体上存在同时控制细胞质 GS 活性
和小穗数的 QTL [11-13], 而水稻 GS1活性与籽粒数目
和籽粒大小显著相关[14-15]。Li等[16]通过细致分析小
麦 GS2 基因单倍型的遗传效应进行了, 发现小麦不
同染色体组上 GS2单倍型与小麦氮素代谢及相关农
艺性状显著关联。
虽然人们很早就已经明确 GS 是植物氮素同化
代谢作用的关键限速酶, 但对于 GS 是否参与豆科
植物的共生固氮作用还不清楚。直到 2010 年, Ma-
salkar 等[17]研究发现大豆 GS1 可以与位于根瘤共生
膜上的主要蛋白NOD26的 C端互作, 形成的蛋白复
合体在植物细胞膜处快速将外界铵离子转化为中性
分子谷氨酰胺, 这种发生在共生膜上的相互作用既
可以避免过多铵离子进入细胞质对植物产生毒害 ,
也大大提高了根瘤共生固氮效率, 该研究为 GS1 参
与大豆根瘤固氮作用提供了直接分子证据。在
Masalkar等[17]研究的基础上, 本研究对大豆GS基因
家族的进化和分类进行研究, 并在大豆氮素代谢关键
时期分析 GS1 基因的组织表达特异性, 利用原核表达
系统对主要在大豆根瘤中表达的 GS 基因进行表达,
体外获得目标蛋白, 并分析其催化功能, 为大豆根瘤
氮素同化代谢中分子机制的研究提供信息, 为大豆品
种氮素代谢水平的遗传改良提供可调控位点。
1 材料与方法
1.1 试验材料
大豆品种中品661来自中国农业科学院作物科学
研究所, 2012年6月中旬播种, 常规田间管理。选择花
期一致和生长状况相近的植株挂牌标记, 在大豆盛
花期取材, 选取大豆根、茎、叶、根瘤等组织, 快速清
洗干净, 以锡箔纸包裹, 液氮速冷, –80℃保存备用。
1.2 植物 GS基因家族的进化分析
从植物基因组数据库 Phytozome 中(http://phyto-
zome.net/)下载 12个物种共 61条 GS蛋白序列(入选
蛋白都具有完整的 GS beta-Grasp和 GS catalytic功能
域), 包括 3种豆科植物(大豆、苜蓿和菜豆)、4种单
子叶植物(水稻、玉米、高粱和二穗短柄草)、1个林
第 12期 王晓波等: 大豆谷氨酰胺合成酶基因的分类及根瘤特异表达 GmGS1β2基因功能的初步分析 2147


木植物(杨树)、1种瓜果类植物(黄瓜)、2个低等植物
(蕨类植物江南卷柏和藓类植物小立碗藓)和模式植
物拟南芥。利用 MEGA5.10[18]软件进行系统进化分
析 , 对聚类分析采用最大似然法 (maximum likeli-
hood), 氨基酸替换模型采用 p-distance 法。利用
Z-test程序中的Kimura 2-para模型计算大豆GS基因
家族碱基替换速率。
1.3 GmGS1基因的组织表达特异性分析
采用 TRIzol法从中品 661根、茎、叶、根瘤等
组织中提取 RNA, 反转录成 cDNA 后–20℃保存备
用。根据大豆 6个 GS1基因和大豆 ACT11基因(内
参)编码区序列利用 Primer Premer 6.0 设计荧光定
量 PCR引物(表 1)。引物由上海生物工程技术服务
有限公司合成。采用 ABI SybrGreen PCR Master
Mix(2X)试剂盒 , 参照其说明书 , 在 ABI Stepone
Plus 型荧光定量 PCR 仪上进行荧光定量。采用
2–∆∆Ct方法计算基因的相对表达量, 3次生物学重复
取平均值。
表 1 大豆 GmGS1基因 qPCR引物序列
Table 1 qPCR primer sequences for GmGS1 genes
基因号
Gene accession
number
名称[6]
Name[6]
正向引物序列
Forward primer sequence
反向引物序列
Revers primer sequence
扩增片段大小
Fragment size (bp)
Glyma09g30370 GmGS1α1 5-TAACACCAAACAGAGTCATTCACC-3 5-TGAGGTTGATGAGATCCGAAA-3 149
Glyma07g11810 GmGS1α2 5-GACTAATTTCCGGGGTTTCG-3 5-GGAGACCTTTTTCTTCCTCACAG-3 136
Glyma11g33560 GmGS1β1 5-GCTTTTCTTAGTAGGATTTGGTCTC-3 5-TAACAATCGGAAAACGAGGGA-3 142
Glyma18g04660 GmGS1β2 5-GTGGAAGCCATGAGCAAAACT-3 5-CGAGGGAAAGGAATAGAAAACA-3 213
Glyma14g39420 GmGS1γ1 5-TTGGAAACCATAAGCAGCCTC-3 5-GCCAAGCATTGAAGTGTGAGA-3 266
Glyma02g41120 GmGS1γ2 5-GCAACGTCAAAACAATCACATG-3 5-AACAACAGGCGAGGTAGTCACA-3 113
Glyma18g52780 ACT11 5-CTTCAGGCATTCACGAGACAA-3 5-TAGAACCACCGATCCAGACAC-3 222

1.4 GmGS1β2基因克隆与序列分析
根据大豆 GmGS1β2 基因全长设计引物, 其上游引
物 GSF 为 5′-ATGTCGCTGCTCTCAGATCTC-3′, 下游
引物 GSR为 5′-TCATGGCTTCCACAGAATGGTT-3′。
引物由上海生物工程技术服务有限公司合成。
以中品 661根瘤 cDNA为模板利用 GSF/GSR为引物
进行 PCR扩增。PCR反应体系 20 μL, 含模板 cDNA
40 ng、dNTPs 200 μmol L–1、10×buffer 2 μL、引物
各 2 μmol L–1、Ex Taq酶 1 U。采用降落 PCR扩增
程序, 94℃预变性 5 min; 94℃变性 1 min, 62℃退火
45 s, 72℃延伸 50 s, 35个循环(每个循环退火温度下
降 0.3 ); 72℃ ℃延伸 10 min。PCR扩增产物经 1%琼
脂糖凝胶电泳检测后, 回收目标片段进行 TA克隆。
提取阳性克隆质粒并进行酶切鉴定, 送上海生工生
物工程技术服务有限公司测序。利用 DNAMAN 软
件将碱基序列翻译成氨基酸序列, 利用 ExPASy 数
据库在线程序 Protparam和 Scanprosit分析基因编码
蛋白的理化特性。
1.5 GmGS1β2蛋白原核表达载体的构建
根据目的基因的完整编码区, 设计 1 对用于构
建原核表达载体的引物, 并在引物 5′端添加酶切位
点, 引物序列为 GS4T-F: 5′-CCCGGGTATGTCGCT
GCTCTCAGATCTC-3′, GS4T-R: 5′-CTCGAGTCAT
GGCTTCCACAGAATGGTT-3′(下画线处分别表示
Sma I和 Xho I酶切位点)。用 GS4TF/GS4TR对中品
661根瘤 cDNA进行 PCR扩增。反应体系和程序同
1.3。利用 Sma I 和 Xho I 对经测序验证正确的
pMD18-T-GmGS1β2和 pGEX4T-1载体质粒分别进行
双酶切, 纯化目标片段, T4连接酶连接。利用 Sma I
和Xho I对重组子进行双酶切鉴定, 并对重组质粒进
行测序验证。重组质粒插入片段序列正确, 并且目
的基因的阅读框与原核表达载体上的 GST-Tag 阅读
框正确融合, 表明 pGEX4T-1-GmGS1β2原核表达载
体构建成功。
1.6 重组质粒的诱导表达及纯化
将重组质粒 pGEX4T-1:GmGS1β2 转化至宿主
表达菌株 BL21(DE3)中, 挑取重组单菌落振荡过夜
培养, 培养物按 1∶100接种于选择性 LB液体培养
基, 待培养至 OD600 ≈ 0.6时, 加入 IPTG(终浓度为
0.5 mmol L–1), 30℃诱导表达融合蛋白。诱导 5~7 h
后 4 900×℃ g离心 20 min, 弃上清液, 用 1×PBS悬
浮沉淀, 4 900×℃ g 离心 15 min, 弃上清液, 再用
1×PBS洗涤一次沉淀。用超声波破碎洗涤后的沉淀,
用 4B-Beads 蛋白纯化试剂盒(GE 公司)纯化重组蛋
白, 具体操作步骤参考说明书。纯化后的重组蛋白
GST:GmGS1β2经 SDS-PAGE (4%浓缩胶和 12%分离
2148 作 物 学 报 第 39卷


胶)电泳检测, 考马斯亮蓝染色。
1.7 重组蛋白的谷氨酰胺合成酶(GS)活性分析
采用谷氨酰胺合成酶测定试剂盒(南京建成生
化试剂有限公司 ), 以分光光度计法对纯化后的
GmGS1β2重组蛋白 GS活性进行分析。利用 Bio-Rad
蛋白定量试剂盒(5000112)对目标蛋白定量, 具体操
作参考试剂盒说明书。
2 结果与分析
2.1 植物谷氨酰胺合成酶基因家族的进化
利用最大似然法对 12 种植物的 61 个 GS 聚类并
构建进化树, 由图 1 可以看出除了 2 个小立碗藓 GS
(pp1s241 33V6和 pp1s40 17V6)由于序列差异过大被
聚在树外, 大部分植物 GS可以分成胞质型 GS (GS1)
和质体型 GS (GS2) 2大类, 每一类又可分为若干亚
类, 其中 GS1 可以分为 5 个亚类, 包括主要由双子
叶植物组成的 I、II 和 III 亚类, 其中第 II 亚类由豆
科植物 GS 组成; 第 IV 亚类由单子叶植物组成, 第
V 亚类由低等植物(小立碗藓和江南卷柏)组成; GS2
可以分为单子叶和双子叶两亚类。由此看出, 植物
GS 进化与植物的进化史相似, 每一类植物(低等植
物、单子叶植物和双子叶植物)都有其特有的 GS 类
型。由于 GS1中也存在一个由单双子叶组成的混合
类型(I), 说明单、双子叶 GS1 进化过程中也发生了
趋同进化。2个低等植物(江南卷柏、小立碗藓)基因
组中只有 GS1没有 GS2, 暗示 GS2可能是从 GS1演
化而来。
大豆基因组中共有 8个 GS, 包含 6个 GS1和 2
个 GS2, 每个 GS 都有 2 个拷贝, 说明大豆 GS 基因
在进化过程中经历了基因组复制事件。从聚类结果
看, 大豆第 2、第 11、第 14 和第 18 染色体上的 4
个GS1距离较近, 与第 7和第 9染色体上的 2个GS1
距离较远, 并与豆科植物特有 GS1 同聚为一类(II),
暗示这 4个基因可能与大豆共生固氮有关。
2.2 大豆 GS多序列比对及进化的选择效应
由图 2 可以看出大豆 GS 氨基酸序列的相似性
(similarity)很高, 2个GmGS2的氨基酸序列相似性高
达 99.1%, 仅有 4个氨基酸差异: 3个位于 N端的信
号肽内(23位 T变成 S, 52位 L变为 M, 60位 T变成
I), 1 个位于 GS 的酶功能区内(beta-Grasp domain,
106位氨基酸 D变为 H)。这种序列高度相似性也存
在于 GmGS1s 之间, GmGS1s 氨基酸序列的平均相
似性高达 95.04%, 重复基因间的相似性均超过
97%, 其中 GmGSα1 与 GmGSα2 氨基酸序列的相似
性最高为 98.9%, GmGS1β1与GmGS1β2的相似性为
97.5%, GmGS1γ1 与 GmGS1γ2 的相似性为 98.3%,
序列上的高度相似性暗示进化产生的重复基因在
功能上可能是重叠的。此外, 在氨基酸长度上, GS1
和 GS2 存在明显差异, GS2 的 N 端和 C 端分别比
GS1多 60个和 16个氨基酸, N端 60个氨基酸是GS2
在质体等亚细胞器内定位所必须的信号肽, C 端的
16个氨基酸是否也与GS2在质体中的功能有关还不
清楚。
碱基替换速率分析表明, GmGS1 家族成员的同
义替换速率 (dS)大于非同义替换速率 (dN)(dS–dN=
12.46, P<0.01), 说明GmGS1s基因在进化过程中受到
了纯化选择作用, 不利变异在进化时逐渐被淘汰。
2.3 大豆 GmGS1s基因的组织表达特异性
由于 GS2 主要在叶绿体等质体中表达, GS1 主
要负责对土壤或根瘤共生固氮中氮素的同化利用[4],
本研究对 6个大豆 GS1基因的组织表达特异性进行
分析, 目的是发掘出在大豆根瘤氮素同化代谢中起
关键作用的 GS基因。由图 3可以看出, 4个豆科植
物特有 GS1 基因(GmGS1β1/2 和 GmGS1γ1/2)在大豆
根瘤中的相对表达量较高。6个 GmGS1基因的组织
表达特点与基因的分类相似, 大体上也可以分为 3 类,
2个 GmGS1αs基因在各个组织中的表达量均较低; 2
个 GmGS1γs 基因特异地在大豆根瘤中表达; 2 个
GmGS1βs 基因在大豆各个组织中均高量表达, 表达
丰度显著高于 GmGS1α和 GmGS1γ (图 3), 但二者的
组织表达特异性存在一定差异, GmGS1β1 基因主要
在叶片中表达, GmGS1β2基因在根瘤中大量表达。
组织表达特异性的差别预示二者在功能上可能
存在分化, GmGS1β2 基因可能在大豆根瘤氮素同化
代谢中有更重要作用。
2.4 GmGS1β2蛋白的结构和理化特性
利用 RT-PCR 从大豆品种中品 661 发育的根瘤
cDNA中克隆出 GmGS1β2基因, 测序结果表明该基
因 CDS全长 1071 bp, 编码 356个氨基酸, 基因编码
蛋白具有 2个功能域(GS beta-Grasp和 GS catalytic),
其中 Beta-Grasp 功能域由 79个氨基酸组成(19~97
氨基酸 ), Catalytic 功能域由 235 个氨基酸组成
(104~348 氨基酸), 其中 catalytic 功能域内存在一
个潜在的 ATP 结合位点(237~255 氨基酸)。利用
E x PA S y 数据库的在线分析程序 Protparam 和
Scanprosit 分析 GmGS1β2 蛋白的理化性质表明,
第 12期 王晓波等: 大豆谷氨酰胺合成酶基因的分类及根瘤特异表达 GmGS1β2基因功能的初步分析 2149



图 1 植物 GS的系统进化
Fig. 1 Phylogenetic analysis of plant GS proteins
Glyma: 大豆; Medtr: 苜蓿; Phvul: 菜豆; At: 拟南芥; Potri: 杨树; LOC_Os: 水稻; GRMZM: 玉米; Sb: 高粱; Bradi: 二穗短柄草;
Cucsa: 黄瓜; Pp: 小立碗藓; Smoellendorffii: 江南卷柏。
Glyma: Glycine max; Medtr: Medicago truncatula; Phvul: Phaseolus vulgaris; At: Arabidopsis thaliania; Potri: Populus trichocarpa;
LOC_Os: Oryza sativa; GRMZM: Zea mays; Sb: Sorghum bicolor; Bradi: Brachypodium distachyon; Cucsa: Cucumis sativus; Pp: Physcomi-
trella patens; Smoellendorffii: Selaginella moellendorffii.

2150 作 物 学 报 第 39卷



图 2 大豆 GmGS蛋白氨基酸的多序列比对
Fig. 2 Multiple sequence alignment of soybean GS proteins
下画线表示 GS蛋白上的 ATP结合位点, 同样的氨基酸用黑色方框表示, 相似氨基酸用灰色方框表示。
Underline shows the ATP-bing site of GS proteins, Black boxes indicate identical residues; gray boxes indicate similar residues.


图 3 大豆 GS1基因的组织表达特异性分析
Fig. 3 Tissue-specific expression of GmGS1 genes from
soybean plants during flowering stage

GmGS1β2 预测分子量为 39.09 kD, 理论等电点为
5.48, 原子组成为 C1743H2679N479O526S10, C、H、N、
O、S所占比例分别为 32.06%、49.27%、8.81%、9.67%
和 0.18%。该蛋白稳定系数(instability index)为 39.66,
是一个稳定蛋白(稳定系数>40为不稳定蛋白); 脂肪
系数(aliphatic index)为 75.90, 总平均亲水性(grand
average of hydropathicity, GRAVY)为–0.414, 表明该
蛋白是 1 个疏水蛋白。糖基化和磷酸化位点分析表
明, 该蛋白具有 3 个潜在的 O-糖基化位点(O-glyco
sylation), 磷酸化位点多达 21个, 其中丝氨酸磷酸化
位点 11 个, 苏氨酸磷酸化位点 4 个, 络氨酸磷酸化
位点 6个, 推测翻译后修饰可能是 GmGS1β2的重要
调控方式之一。
2.5 体外表达的GmGS1β2蛋白具有GS催化活性
将重组质粒pGEX4T-1-GmGS1β2转化大肠杆菌
BL21 (DE3)感受态细胞 , 加入不同浓度的 IPTG
(0.2、0.5、1.0和1.5 mmol L–1), 在16℃、30℃和37℃
下分别以不同时间诱导后, 提取大肠杆菌总蛋白经
SDS-PAGE分析 , 表明插入有外源片段的重组质粒
经0.5 mmol L–1 IPTG 30℃诱导5 h后重组蛋白表达效
果较好。
将诱导表达的菌体经超声波破碎后 , 利用
Glutathione sepharose 4B纯化目的蛋白。由图4-A可
以看出, 纯化后的蛋白条带单一, 在蛋白分子量67
kD左右有1条蛋白条带, 而空载体转化子未出现这
条蛋白带。除去GST-tag标签蛋白28 kD, 目的蛋白的
分子量约为39 kD, 这与外源大豆谷氨酰胺合成酶
基因GmGS1β2编码区蛋白的分子量理论值相符, 表
明重组质粒pGEX4T-1-GmGS1β2在大肠杆菌中诱导
表达出了GmGS1β2蛋白。
第 12期 王晓波等: 大豆谷氨酰胺合成酶基因的分类及根瘤特异表达 GmGS1β2基因功能的初步分析 2151



图 4 GmGS1β2重组蛋白纯化与谷氨酰胺合成酶活性分析
Fig. 4 Purification and Glutamine synthetase activity analysis
of GmGS1β2 recombinant protein
A: pGEX4T-1-GmGS1β2纯化后表达产物 SDS-PAGE分析; M: 蛋
白质分子质量标准; 1: 纯化后 pGEX4T-1空载体诱导表达产物
(GST); 2: 纯化后 pGEX4T-1-GmGS1β2重组质粒诱导表达产物;
箭头示目标条带; B: GmGS1β2重组蛋白可以催化底物生成红褐
色产物; 1: GST标签蛋白 GS催化反应; 2: GST:GmGS1β2重组蛋
白 GS催化反应; C: GmGS1β2重组蛋白的 GS活性。
A: SDS–PAGE analysis of the purified expressed product of
pGEX4T-1-GmGS1β2; M: protein molecular weight standard; 1:
purified proteins of strains harboring pGEX4T-1(GST); 2: purified
proteins of engineering bacteria strains pGEX4T-1-GmGS1β2;
Arrow indicates the target protein band; B: catalyzing reaction of
GmGS1β2 recombinant protein to its substrate by producing
red–brown product(catalytic reaction of 1 for GST peptide tag and 2
for GST:GmGS1β2 recombinant protein); C: GS activity analysis
for GST peptide tag and GST:GmGS1β2 recombinant protein.

对纯化后的GmGS1β2重组蛋白的GS活性进行
分析, 由图 4 可以看出, 重组蛋白可以与底物发生
催化反应生成红褐色产物(图 4-B2), 而 GST 标签蛋
白不能与底物发生反应(图 4-B1), 说明重组蛋白具
有 GS 催化活性。利用试剂盒进一步对重组蛋白的
GS活性定量分析表明, GmGS1β2蛋白的 GS活性为
3028.27 U mg–1, 而标签蛋白GST未检测出GS活性,
说明 GmGS1β2 蛋白是一个有活性的功能蛋白, 在
大豆根瘤谷氨酰胺的合成中具有重要作用。
3 讨论
在距今 5900 万年和 1300 万年前, 大豆基因组
发生 2次大规模复制, 大量的染色体重排, 产生了一
个高度重复的基因组, 约 75%的基因以多拷贝形式
存在[19]。大豆 GS基因也是一个多拷贝基因家族, 从
大豆 GS 基因的进化和分类的结果可以看出, 8个
GS1 基因可以分为 4 类, 每一类基因都有 2 个拷贝,
表明大豆 GS 基因由于基因组的大规模复制产生了
重复基因。从氨基酸多序列比对结果可以看出, 大
豆 GS 重复基因间的序列具有很高的相似性(图 2),
暗示 GS重复基因之间的功能可能是冗余的。从进化
关系来看, 大豆 GS 基因与同属豆科植物的苜蓿 GS
基因亲缘关系最近, 苜蓿 GS 基因也可以分为相同
的 4类, 但每类 GS基因只有 1个拷贝, 说明苜蓿基
因组可能没有经历过类似的大规模复制, 可以利用
苜蓿 GS基因是单拷贝的这一特性对豆科植物 GS基
因家族功能进行研究。
大豆盛花期根瘤菌活动和繁殖最旺盛, 也是大
豆固氮能力最强的时候, 我们在大豆盛花期对大豆
GS基因的组织表达特异性进行了分析, 目的是筛选
出大豆根瘤氮素同化代谢关键 GS 基因, 对重复基
因之间的功能分化进行分析。从基因的表达丰度上
看, 2个 GmGSαs基因在大豆各个组织中的表达量较
低 , 而 4 个豆科植物特有 GS1 基因(subgroup II,
GmGSβs 和 GmGSγs)在大豆根瘤中的高量表达, 表
明 GmGSβs 和 GmGSγs 基因在大豆根瘤氮素同化代
谢中具有重要的作用。虽然 GmGS1β1 和 GmGS1β2
在大豆各个组织中的表达丰度都很高, 但基因主要
表达部位不同, GmGS1β2 基因在大豆根瘤中的表达
量最高 , 体外表达试验证明了该基因是有功能的 ,
暗示 GmGS1β2 基因在大豆根瘤固氮方面可能发挥
主要作用。
基因重复是生物遗传系统分化的重要推动力量[20],
基因复制后其中一个拷贝会保持原来的功能, 而另
外一个拷贝可以不再受遗传选择的约束, 随机积累
突变, 为产生新基因或新功能的产生提供了可能[21]。
基因重复后 2 个拷贝在表达水平上的分化是重复基
因功能分化的重要一步[20]。GmGSαs 和 GmGSγs 的
重复基因间有相似的组织表达部位和丰度, 说明这
2 类重复基因在进化过程中发生了趋同进化, 功能
上可能是重叠的; 2 个 GmGS1βs 重复基因的在茎和
根中的表达丰度相近, 但在叶片和根瘤中存在明显
差异, GmGS1β2 基因主要在根瘤中表达, GmGS1β1
基因主要在大豆叶片中高量表达, 说明在进化过程
中 GmGS1βs 重复基因的功能发生了一定分化 ,
GmGS1β1 基因可能也同时参与了大豆叶绿体组织中
光合产物的氮素同化代谢, 这与我们传统上认为GS1
主要负责同化土壤中的氮素的观点有所不同[2,5]。从
蛋白结构上看, GmGS1β1 蛋白的 N 端没有类似于
GmGS2 的信号肽, 因此 GmGS1β1 可能是通过一种
新的途径参与大豆叶片中氮素的同化代谢。
大豆 GS1 基因表达存在多种调控方式[22], 其中
非翻译区(UTR)对基因的表达有较大影响。Ortega
2152 作 物 学 报 第 39卷


等[23]研究发现大豆GS1基因 3′UTR可以通过影响转
录本的稳定性, 抑制目的基因的表达; GmGS1β1 基
因 5′UTR 可以显著增强目的基因的表达, 在转基因
瞬时表达的烟草叶片中带有 GmGS1β1 基因 5′UTR
的报告基因的表达量是对照的 20倍[24], 说明GS1基
因 3′UTR可能是基因表达的抑制子, 而 5′UTR则扮
演着基因表达增强子的角色。对 GmGS1β1 和
GmGS1β2 两个基因启动子的序列比对发现, 二者的
相似性超过 45%, 暗示它们可能存在相似的调控原
件。Morey 等[6]和 Miao 等[25]研究表明 GmGS1β1 和
GmGS1β2基因可以受外源 NH3诱导表达。Marsolier
等[26]通过启动子删除试验发现 GmGS1β1 基因启动
子–1.3 ~ –3.5 kb处存在受 NH3诱导的作用区域, 但
没能从 GmGS1β1 基因启动子中鉴定出受 NH3调控
的顺式作用原件。
目前, 本项目组正在对GmGS1β2基因启动子上
组织特异表达及对外界环境氮素的响应的关键位
点、基因的遗传多样性和生物学功能进行研究, 以
阐明 GS 参与大豆根瘤氮素同化代谢的机制, 为大
豆氮素同化代谢水平的遗传改良提供依据。
4 结论
大豆 GmGS1s重复基因间具有相似的表达模式,
大豆根瘤中存在 4 个豆科植物特有 GS1 基因; 这 4
个基因中, 2 个 GmGS1βs 基因主要在大豆根瘤中表
达, 且以 GmGS1β2 基因表达丰度最高, 该基因编码
蛋白具有谷氨酰胺合成酶活性, 参与大豆根瘤的氮
素同化代谢, 可能在固氮中发挥主要作用, 是大豆
氮素代谢遗传改良的关键调控位点。
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