全 文 ：中国农学通报 2012,28(31):137-140
Chinese Agricultural Science Bulletin
0 引言
烟草青枯病是一种由茄科雷尔氏菌 (Ralstonia
solanacearum)引起的细菌性病害 [1]，典型的维管束病
害，是烟草上一大毁灭性病害。雷尔氏菌引起的植物
细菌性青枯病害(bacterial wilt)，简称青枯病，是一种世
界范围的细菌性土传病害。该菌寄主广泛，能够侵染
基金项目：中国烟草总公司安徽省公司项目“烟草优质抗青枯病聚合育种及其抗性基因分析”(20100551003)；安徽省自然科学基金项目“烟草青枯病
抗性的分子生物学研究”(090411017)。
第一作者简介：刘磊，男，1986年出生，硕士，主要从事烟草青枯病育种研究。通信地址：230036安徽省合肥市长江西路130号安徽农业大学生命科
学学院，Tel：0551-5148971，E-mail：tobaccoqian@126.com。
通讯作者：王荣富，男，1957年出生，安徽人，教授，博士，主要从事植物抗逆的分子机制。通信地址：230036安徽省合肥市长江西路130号安徽农业
大学生命科学学院。Tel：0551-5148970，E-mail：tobaccoqian@126.com。孙学永，男，1973年出生，安徽人，副研究员，博士，主要从事烟草抗病育种。
通信地址：230031安徽省合肥市农科南路40号烟草所，Tel：0551-5148998，E-mail：sxyyxscn@sohu.com。
收稿日期：2012-04-23，修回日期：2012-09-17。
拟南芥青枯病抗性基因RRS1的烟草同源性检测
刘 磊 1，阮 龙 2，钱益亮 2,3，吴志超 3，韩 漾 3，孙学永 2，王荣富 1
（1安徽农业大学生命科学学院，合肥 230036；2安徽省农科院烟草所，合肥 230031；
3安徽农业大学农学院，合肥 230036）
摘 要：旨在进行烟草种质抗青枯病基因RRS1的筛选研究，于2008年、2009年及2011年选取国内外80
个烟草品种，开展大田青枯病病害指数调查及RRS1基因9对特异引物的筛选工作，通过9对引物及80
个 烟 草 种 质 的 筛 选 ，目 前 已 经 鉴 定 出 引 物 6F-6R (5-ATGAGAAAGAGGCTCGTCAA-3 和
5-ACCACAACCCTCAAGCAGTT-3)能够有效地筛选种质，共筛选出 3个烟草种质 (G28、K346、
LMAFC34)含有RRS1特异性扩增序列；针对引物(6R-6F)扩增的3个烟草种质材料的特异性序列进行测
序，开展与RRS1基因的 cDNA序列的同源性比对，为烟草种质资源的RRS1基因同源性评价奠定工作
基础。
关键词：烟草；青枯病；RRS1基因；同源性检测
中图分类号：S511 文献标志码：A 论文编号：2012-1570
Detection on RRS1 Gene of Bacterial Wilt Resistance from Arabidopsis in Tobacco for Homolog
Liu Lei1, Ruan Long2, Qian Yiliang2,3, Wu Zhichao3, Han Yang3, Sun Xueyong2, Wang Rongfu1
(1College of Life Sciences, Anhui Agricultural University, Hefei 230036;
2Tobacco Research Institute of Anhui Academy of Agricultural Science, Hefei 230031;
3Agricultural College, Anhui Agricultural University, Hefei 230036)
Abstract: It is aimed to study and help for selecting the germplasm of the resistance gene of the tobacco
ralstonia solanacearum in RRS1 gene. The investigation and selection was carried out in 2008, 2009 and 2011.
80 tobacco germplasm resources were chosen in the world. The investigation to the index of Ralstonia
solanacearum in tobacco was carried out in the field. 9 pairs of specific primers were selected to screen for the
RRS1 gene. Through the selection, the primer 6F-6R (5-ATGAGAAAGAGGCTCGTCAA-3 and
5-ACCACAACCCTCAAGCAGTT-3) was sure to pick out the available germplasm. Three germplasm of
tobacco was selected for containing the specific amplified sequence of RRS1 for G28, K346 and LMAFC34.
The specific sequences amplified by 6R-6F, were sequenced in 3 tobacco germplasm resources, and the
homology of RRS1 cDNA was compared, these works established the base for assessing the homology of RRS1
gene.
Key words: tobacco; bacterial wilt; RRS1 gene; homology detection
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热带和温带地区多达 450种以上的植物种类，比如烟
草、番茄、马铃薯、香蕉等的产量[2]。自然条件下，植物
的受伤部位侵入的雷尔氏菌，直接进入导管繁殖，产生
大量胞外多糖(EPS)[3]。EPS影响和阻碍植物体内的水
分运输，从而引起植株萎蔫。雷尔氏菌还向细胞外分
泌多种细胞壁降解酶，这些细胞壁降解酶可能在破坏
导管组织引起植株枯萎死亡[4]。烟草青枯病在中国安
徽、福建、江苏、云南、广西、河北、湖南、广东等地普遍
发生 [5]。在中国，据 1989—1991年 16个产烟省（自治
区）的调查结果，发病面积较大、为害较重的有广西、广
东、福建、湖南、浙江等省（自治区）及安徽省的皖南烟
区、四川省的宜宾和泸州烟区。近年来，随着分子生物
学技术的发展，已经成功完成了雷尔氏菌基因组序列
的测定，同时对其分子机理的研究也日趋深入，寻找抗
性基因已成为当下研究的热点[6-11]。
烟草种质中至今没有报道过可直接利用的抗青枯
病基因，拟南芥中克隆的RRS1基因是被发现的第1个
青枯病抗性基因，目前只限在拟南芥中研究没有在其
他作物中筛选同类基因，本研究旨在进行烟草种质抗
青枯病基因RRS1的筛选研究，期望在烟草种质中寻
找出具有类似抗性基因的品种，最终实现品种改良提
高品种抗性。为了定位 RRS1(resistant to Ralstonia
solanacearum 1)基因，Holub和Beynon曾在 1997年以
遗传模式植物拟南芥(A. thaliana)为研究材料，利用其
生态型Col-5（感）×Nd-1（抗）的杂交获得169株重组体
品系，分析得到第 5号染色体的一个分子标记 nga129
与 RRS1关联。通过遗传连锁分析将 RRS1定位于
nga76 和 nga1292 个遗传标记之间，遗传距离为
49.1 cM[12-14]。 RRS1 基 因 能 介 导 多 个 Ralstonia
solanacearum小种的广谱抗性反应，也是至今第一例
依赖NDR1蛋白的TIR-NBS-LRR类R基因，也是目前
分子机制层面研究最为详尽的抗青枯病基因，它的发
现和克隆，以及对其功能和作用模式的研究，无疑会对
其他作物青枯病抗性的遗传机理研究提供科学有效的
实验思路[15]，促使植物青枯病的研究走上一个新的台
阶，筛选并鉴定烟草种质中的RRS1类基因以及明确
其在寄主细胞中的作用模式，对于了解雷尔氏菌的致
病机制及设计更有效的烟草抗青枯病策略显得特别重
要，对于抗青枯病的研究具有很重大的现实意义。
1 材料与方法
1.1 试验时间、地点
本研究抗性鉴定于2008年、2009年在安徽省宣州
区寒亭镇安徽省农科院烟草所青枯病病圃进行，室内
试验于 2011年在安徽省农科院烟草所分子生物中心
实验室（合肥）进行。
1.2 试验材料
以选取来自国内外烟草种质80个，名称列于表1。
1.3 试验设计及方法
抗性鉴定采用2年数据联合鉴定，每个小区32株，
行株距0.3 m×0.5 m[16]。常规种每穴1颗烟苗，其它试验
方案均按照试验地区的具体情况因地制宜。室内试验
DNA的提取参照本实验室改进后的CTAB提取法操作[17]，
针对拟南芥青枯病抗性基因RRS1的6.4KbcDNA序列
在美国国家生物技术信息中心NCBI上进行拟南芥
gDNA 的 BLAST 比对后找到 4 段内含子，利用
PRIMERKEY5.0软件针对拟南芥青枯病抗性基因
RRS1的外显子碱基序列进行引物设计，引物合成由上
海生工生物工程有限公司进行，引物信息列于表2。
烟草种质
云烟85
岩烟97
歙园四号
反帝三号丙
长脖黄
白色种
TI448A
RG11
NC86
LMAFC34
K399
K346
K326
G80
安选四号
Virginia770
Hingory
F136
安选六号
Jamaica
CV58
Sumatra Deli
白花NG-89
MC NC 373
Connecticut Shade
Speight G-13
Clemson PD4
Speight G-58
LAMFC34
Coker176
烟变子
小白筋
歙园六号
吴城烟
莴苣烟
土烟
桃柳子
宿松杀猪刀
柳叶尖
红花大金元
固镇小黄金
峨眉俏
G28
Enshu
DB101
Coker86
Coker176
C17(6517)
NC567
安流晒烟
K358
SC71
SC72
RG17
小黄苗
大柳条
大宽柳
大红星
卜城柳
白秸黄
普太35
云烟87
Coker298
Ky151
MC101
N.affinis
Silk Leaf
黑柳子
歪把子
宿松晒烟
尖叶柳
窝心柳
绩溪黄烟
黄毛柳
歙园一号
遵义泡秆烟
歙县大叶
峨山木本
尖叶美种子
小黄烟二号
表1 筛选青枯病抗性的80个烟草种质
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刘 磊等：拟南芥青枯病抗性基因RRS1的烟草同源性检测
表2 RRS1基因外显子碱基9对特异引物碱基序列
正向引物5-3
1F
1R
2F
2R
3F
3R
4F
4R
5F
ACAAAAATTCCGGCGAAATCAAAGG
TGTGGGTGGGAGAGAAGTTCTATAA
ATCAATCAGCAGACAAAGTG
TAACATCCAAGTCAATACCG
ATGAGAAAGAGGCTCGTCAA
GAAGAAACAAGCTATGTCCG
CGGTGACAGTCTATTACGGG
TTCGTCCAACATAAAAGTGC
TCAGTGCGCCCTCACATACA
反向引物5-3
5R
6F
6R
7F
7R
8F
8R
9F
9R
CCACCAGCATACCAAATCCC
ATGAGAAAGAGGCTCGTCAA
ACCACAACCCTCAAGCAGTT
CGGTGACAGTCTATTACGGG
GTCCAACATAAAAGTGCGTC
GGGGTTTCTGTGATGGTTTT
CATTCCTTCCTGGATTGGTG
TTGTTCAATGACGAGGATGT
GCAACTTGGAAAAGGTAGCA
烟草DNA提取：CTAB法取新鲜叶片，放入预先
冷冻好的研钵内，加入 800 μL CTAB 裂解液 (2%
CTAB，100 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0；50 mmol/L
EDTA，pH 8.0；3%PVP，1.4 mol/L NaCl)迅速研磨充分
并转入 2 mL离心管中。65℃水浴 1 h，室温下加入等
体积的 24:1氯仿/异戊醇，12000 r/min离心 15 min；取
上清液，加入等体积的 1%CTAB沉淀缓冲液；轻轻摇
晃至形成絮状沉淀，5000 r/min离心 8 min沉淀DNA；
加入 2 mL 1mol/L NaCl及 1 μg/mL的RNAase 37℃水
浴中过夜。24:1氯仿/异戊醇再抽提 1次，加入异丙醇
沉淀DNA，预冷 70%酒精洗沉淀 2次并干燥处理。加
入50 μL的TE溶液，-20℃储藏备用。
2 结果分析
2.1 烟草特异引物筛选
利用9对引物在阳性对照材料哥伦比亚生态型拟
南芥及80个烟草种质中进行序列特异性扩增，筛选出
材料中的特异性扩增条带，进而对烟草种质进行分组
分类，通过9对引物及81个烟草种质的筛选，目前已经
鉴定出引物 6F-6R(5-ATGAGAAAGAGGCTCGTCA
A-3和 5-ACCACAACCCTCAAGCAGTT-3)能够有效
地筛选种质，共筛选出 3个烟草种质 (G28，K346，
LMAFC34)含有RRS1特异性扩增序列，见图 1。初步
鉴定出的3个种质和RRS1的特异扩增具有协同性，预
期进展针对引物(6R-6F)扩增的3个烟草种质材料的特
异性序列进行测序并和RRS1基因的序列进行同源性
比对，使用DNAMan6.0比对同源性，针对预期同源性
>80%烟草种质进行同源性评价。
2.2 特异引物筛选的烟草种质抗性鉴定
针对特异引物6F-6R筛选鉴定的特异带型3个烟
草种质G28、K346、LMAFC34进行烟草青枯病病害指
数鉴定，病级调查采用始病期后的7月2日调查发病状
况，其方法参照烟草病虫害分级及调查方法 (YC/
T 39—1996)执行，并计算病情指数。抗性评价：按烟
草行业标准YC/T 41—1996，以感病对照长脖黄病情
指数接近 100时的抗性划分 4级：病情指数 25以下为
高抗，25.1~50为中抗，50.1~75为中感，75以上为高感，
鉴定结果见表3。品种G28在2008年表现为中感青枯
病，而在2009年表现为中抗青枯病；品种K346在2008
1：拟南芥；10：G28；12：K346；14：LMAFC34
图1 RRS1基因特异带型筛选部分烟草种质
2008年7月2日
编号
40
45
48
品种
G28
K346
LMAFC34
抗性
MS
HR
MS
2009年7月2日
编号
40
45
48
品种
G28
K346
LMAFC34
抗性
MR
MS
HR
表3 烟草种质G28、K346及LMAFC34的病害指数鉴定
注：抗性水平标注HR：高抗；MR：中抗；MS：中感；HS：高感。
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年表现为高抗青枯病，而在 2009年表现为中感青枯
病；品种LMAFC34在2008年表现为中感青枯病，而在
2009年表现为高抗青枯病，不同种质在不同年份间表
现出一定程度的差异。
3 结论与讨论
本研究采用的 9对特异引物中只有引物 6F-6R
(5-ATGAGAAAGAGGCTCGTCAA-3和 5-ACCACA
ACCCTCAAGCAGTT-3)在扩增 80个烟草种质后差
异筛选出 3份烟草种质(G28、K346、LMAFC34)，PCR
扩增具有与阳性对照拟南芥同等分子量大小的特异带
型，能够有效地筛选抗青枯病种质。青枯病抗性基因
的研究前人在拟南芥中有过报道，但是在烟草中利用
特异引物筛选鉴别烟草抗青枯病基因种质没有报道
过，本研究尚属首例，且前人大多集中在大田抗性鉴
定，本试验的创新点在于利用PCR特异扩增鉴别种质
不受大田环境和时间的限制，可以多重复验证结果的
可靠性。
引物的特异性在本研究中具有关键性的鉴别作
用 ，PCR 特 异 性 扩 增 的 第 1 对 引 物 1F-1R
(5-ACAAAAATTCCGGCGAAATCAAAGG-3，5-TG
TGGGTGGGAGAGAAGTTCTATAA-3)是针对 RRS1
基因 cDNA序列全长设计的，PCR扩增时没有清晰带
型，估计是由于RRS1基因 cDNA序列过长且有4个内
含子，一次性扩增拉出全长序列有一定的难度；其余7
对引物PCR扩增全部具有清晰带型，且分子量大小和
阳性对照拟南芥一样，分析原因可能是因为这 7对引
物是针对RRS1基因 cDNA序列的小片段设计的，带
型不具有筛选特异性，无法有效鉴别含有RRS1基因
的烟草种质。可见，为了克服内含子特异引物的设计
难题，本研究进行了RRS1基因 cDNA序列的分段设
计，通过加密引物的区段来完成特异引物的筛选。
针对筛选出3个烟草种质(G28、K346、LMAFC34)
含有RRS1特异性扩增序列片段进行多重复的特异扩
增纯化，增强结果的可靠性和完整性。将通过深圳华
大基因研究院测序，测得的序列用DNAstar软件将其
接成一个完整的基因序列。利用相应软件对所有测序
序列进行了比较，依据碱基是否能配对，从而粗略判
断，烟草种质中所含的RRS1类基因是否是一个完整
的序列，进而判断烟草种质中的RRS1类基因探讨其
基因家族数量，进而作证含有RRS1基因烟草种质抗
青枯病的分子遗传机制，进而在转录组水平分析其基
因功能。
参考文献
[1] Bernoux M, Timmers T, Jauneau A, et al. RD19, an Arabidopsis
cysteine protease required for RRS1-R-mediated resistance,is
relocalized to the nucleus by the Ralstonia solanacearum PopP2
effector[J]. Plant Cell,2008,20(8):2252-64.
[2] Tans-Kersten J, Guan Y F, Allen C. Ralstonia solanacearum pectin
methylesterase is required for growth on methylated pectin but not
for bacterial wilt virulence[J].Appl Environ Microbiol,1998,64(12):
4918-23.
[3] 赵义龙,黄金凤,李云华.氨基多糖纳米微粒对RAW264.7细胞株
TNF-a基因mRNA表达量的影响[J].中国饲料,2009(5):8-10.
[4] 李林章,谢从华,柳俊,等.茄科分子生物学基础及其致病机制[J].
中国马铃薯,2005,19(5):290-294.
[5] 佟道儒.烟草育种学[M].北京:中国农业出版社,1997:446-453.
[6] 顾钢,纪成灿,方树民,等.烟草主栽品种对青枯病抗性反应[J].云
南农业大学学报,2002,17(2) :130-136.
[7] 匡传富,罗宽.烟草品种对青枯病抗病性及抗性机制的研究[J].湖
南农业大学学报,2002,28(5):395-399.
[8] 巫升鑫,方树民,潘建菁,等.烟草种质资源抗青枯病筛选鉴定[J].
中国烟草学报,2004,10(1):22-24 ,40.
[9] 潘建菁,巫升金,谢小丹,等.烟草种质资源及烤烟杂交组合对青枯
病的抗性评价[J].种子,2004,23(7):13-16.
[10] 杨友才,周清明,朱列书.烟草品种青枯病抗病性及抗性遗传研究
[J].湖南农业大学学报:自然科学版,2005,31(4):381-381.
[11] 杨友才,周清明,朱列书. 烟草青枯病抗性基因的遗传分析及
RAPD标记[J].中国烟草学报,2006,12(2):38-42.
[12] Deslandes L, Pileur F, Liaubet L, et al. Genetic characterization of
RRS1, a recessive locus in A rabidopsis thaliana that confers
resistance to the bacterial soilborne pathogen Ralstonia
solanacearum[J]. Mol Plant-Microbe Intera,1998,11(7):659-67.
[13] Deslandes L, Olivier J, Theulieres F, et al. Resistance to Ralstonia
solanacearum in A rabidopsis thaliana is conferred by the recessive
RRS1-R gene, a member of a novel family of resistance genes[J].
PNAS,2002,99(4):2404-09.
[14] Han D J, Cao L, Chen Y F, et al. Molecular basic of interaction
between disease resistance gene and avirulence gene[J].Acta Gene
Sin,2005,32(12):1319-26.
[15] Salanoubat M, Genin S, Artiguenave F, et al. Genome sequence of
the plant pathogen Ralstonia solanacearum[J].Nature,2002,415
(6871): 497-502.
[16] Sun X Y, Zu C L, Gao Z L, et al. Influence of high plant density on
morphology characters and efficacy of resistant identification to
bacterial wilt in tobacco[J]. Journal of China Tobacco,2011,17(1):
1004-5708.
[17] Saghai Maroof M A, Biyashev R M, Yang G P, et al. Extraordinarily
olymorphic microsatillate DNA in barely species diversity,
choromosomal location, and population dynamics[J].Procceding of
the National Academy of Sceinces,1994,91:5466-5570.
·· 140