全 文 ：·综述与专论·
生物技术通报
B IO TECHNOLOGY　BULL ETIN 2009年第 12期
阿魏酸酯酶基因克隆表达调控及其应用进展
胡雪松 李夏兰
(华侨大学化工学院 ,厦门 361021)
　　摘 　要 : 　阿魏酸酯酶作为微生物降解植物多糖的酶系的一部分 ,其从细胞壁中降解多糖获得芳香酸和单多糖的能力越
来越受到重视。主要介绍了阿魏酸酯酶研究进展 ,包括阿魏酸酯酶的研究现状 ,酶 2底物分子对接模型、阿魏酸酯酶基因克隆
表达、重组与调控以及应用。
关键词 : 　阿魏酸酯酶 分子对接模型 表达调控 应用
Review on Clon ing, Expression, Regulation and Applications
of Feruloyl Esterase Genes
Hu Xuesong L i Xialan
( Institute of Chem ical Technology, Huaqiao University, X iam en 361021)
　　Abs trac t: 　A s one part of the m icrobial enzym atic spectrum degrading p lant polysaccharides, feruloyl esterases have received
an increasing interest in industrial app lications because of its abilities, which can release arom atic acids, monosaccharide and po l2
ysaccharides from these po lym eric structures. This review p rovided an overview of the current know ledge on feruloyl esterases in2
cluding its research status, enzym e2substrate molecular docking model, exp ression, recom bination, regulation of Faes and its app li2
cations.
Key wo rds: 　Feruloyl esterases Molecular docking model Ep ression and regulation Ap lications
收稿日期 : 2009208212
作者简介 :胡雪松 (19852) ,男 ,在读研究生 ,研究方向 :阿魏酸酯酶克隆与表达研究 ; E2mail: almeida@ hqu. edu. cn, Tel: 05922616066
1　阿魏酸酯酶的研究现状
1. 1　阿魏酸酯酶
阿魏酸酯酶 [ E. C. 3. 1. 1. 73, ferulic acid ester2
ase, FAE ] ,是一种胞外酶 ,它是羧酸酯水解酶的一
个亚类 ,其主要生物功能是水解植物细胞壁中的多
糖与阿魏酸连结的酯键 ,释放出游离的单体阿魏酸
或阿魏酸二聚体。
自 1987年 Mackenzie等 [ 1 ]从橄榄色链霉菌发
现阿魏酸酯酶到 1991年被 Faulds和 W illiam son[ 2 ]
首次分离纯化 ,已从真菌和细菌中得到超过 30种
FAEs。目前产酶的主要真菌有黑曲霉 (A sperg illus
n iger)、米曲霉 (A sperg illus oryzae)、构巢曲霉 (A sper2
g illus n idu lans)、尖孢镰刀菌 ( Fusarium oxysporum )、
嗜热侧孢霉 ( S porotrichum therm ophile)、黄柄曲霉
(A sperg illus f lavipes)、泡盛曲霉 (A sperg illus aw am o2 ri)、塔宾曲霉 (Asperg illus tubingensis)、青霉类 ( Pen i2cillium )等。细菌主要有荧光假单胞菌 ( Pseu2dom o2nas fluorescens)、溶纤维丁酸弧菌 (B u tyrivibrio f ibri2solven t)、嗜酸乳酸杆菌 (L actobacillus acidoph illus)、粪堆梭菌 (C lostrid ium stercorarium )和热纤梭菌 ( C los2trid ium therm ocellum ) [ 3 ]。1. 2　阿魏酸种类目前阿魏酸酯酶的分类主要根据其催化底物的专一性以及蛋白质序列的特异性分为 A、B、C、D共4类 ,具体的参数见表 1。1. 3　部分产阿魏酸酯酶基因的菌种酶学特性产阿魏酸酯酶菌种类较多 ,不管是细菌还是真菌 ,它们的物理性质都差异巨大 ,包括分子量、等电点和最适水解反应条件等。一些已报道的阿魏酸酯酶的部分酶学性质详见表 2。
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表 1　阿魏酸酯酶类型 [ 4]
类型 A型 B型 C型 D型
示例 A. niger FaeA P. fun icu losum FaeB
N. crassa Fae21 A. nidulans FaeB ,T. stipita tus FaeC Pen. equi EstAC. japonicus XYLD
最适诱导培养基 麦麸 /燕麦木聚糖 甜菜渣 甜菜渣 /麦麸 麦麸
水解酯键类型 MFA, MSA, MpCA MFA, MpCA, MCA MFA, MSA, MpCA
MCA
MFA, MSA,
MpCA, MCA
是否释放二阿魏酸 是 (525′) 否 否 是 (525′)
序列相似性 脂肪酶 乙酰木聚糖酯酶 单宁酶 木聚糖酶
参考文献 [ 5, 6 ] [ 7, 8 ] [ 9～11 ] [ 12, 13 ]
　注 :MFA. 阿魏酸甲酯 ;MCA. 咖啡酸甲酯 ; MpCA. 香豆酸甲酯 ; MSA. 芥子酸甲酯 ; 525′. 525′阿魏酸二聚体
表 2　已报道部分阿魏酸酯酶的酶学特性菌种酶名称基因基因编号 FAE
菌种 酶名称 基因 基因编号 FAE类型
分子量
( kD) pHop t Top t
(℃) p I 参考文献
A. awam ori AwFAEA AwfaeA AB032760 A 37 5. 01 45 [ 14 ]
A. nidulans AnFaeB AN 1772. 2 XM654284 B 56 7. 0 45 [ 9 ]
A. niger FAE2III or AnFaeA faeA Y09330 A 36 5. 01 551 3. 3 [ 5 ]
CinnAE or AnFaeB faeB AJ309807 B 75. 8a 6. 02 502 4. 8 [ 15 ]
A. oryzae AoFaeB faeB XP_001818628 B 61 6. 0 55 [ 16 ]
AoFaeC faeC XP_001819091 C 75 6. 0 50 [ 16 ]
A spergillus tubingen2
sis
A tFaeA faeA CAA70511 A 36 5. 0 60 3. 4 [ 17 ]
C. therm ocellum XynZ XynZ M22624 - 45 4～75 50～605 5. 8 [ 18 ]
F. oxysporum FoFAE2I or FoFaeB B 31 7. 06 556 > 9. 5 [ 19 ]
FAE2II or FoFaeA A 27 7. 07 457 9. 9 [ 20 ]
FoFaeC212213 FoFaeC foxg212213. 2 C 62 6. 0 65 6. 8 [ 21 ]
Cellvibrio japonicus XLYD or CjXYLD xynD X58956 D 59 7. 5 55 [ 13 ]
S. therm ophile StFAE2A or StFaeB B 33 6. 01 55～601 3. 5 [ 22 ]
StFaeC C 23 6. 01 551 < 3. 5 [ 23 ]
P. funiculosum FAE2B or PfFaeB faeB AJ291496 B 53 6. 0 [ 7 ]
P. equi EstA estA AF164516 D 55 6. 7 50～60 [ 12 ]
N eurospora crassa Fae2I ( FaeB) fae21 CAE75726 B 29. 3 6. 0 55 8. 26 [ 24 ]
T. stipita tus TsFaeC faeC AJ505939 C 66 6～72 602 4. 6 [ 25 ]
　pHop t , Top t (℃)列中编号代表最适 pH 时的底物 : 1. 阿魏酸甲酯 (MFA ) ; 2. 咖啡酸甲酯 (MCA ) ; 3麦糟 (W S) ; 4. (NPh252Fe2A raf) ; 5.
( FAXXX) ; 6. 香豆酸甲酯 (MpCA) ; 7. 芥子酸甲酯 (MSA)
2　阿魏酸酯酶基因催化分子模型
Hermoso等 [ 26 ]研究了黑曲霉阿魏酸酯酶 An2
FaeA的晶体结构 (图 1)以及其催化机理 ,阿魏酸酯
酶催化活性都包括一个催化三联体 ( Ser133,
A sp194, H is247) ,催化 Ser残基是在保守序列 GX2
SXG的中心 ,且在连接蛋白质表面 2个裂缝间的大
腔中 ,完全暴露于外界溶剂。另外 2个催化残基在
α/β水解酶的典型位置。活性部位腔是由一个盖片
区 ( flap region残基 68～80, )和一个残基环 ( loop ,残
基 226～244)组成 ,残基环为底物结合提供了较好的
调整性 ,而阿魏酸酯酶序列中特有的 N2糖基化位点
使活性部位一直处于开放构象状态下 ,从而结合底
物 (图 22A) [ 26 ]。Hermoso等根据角菌 (C. therm ocel2
lum )木聚糖酶 Z中的阿魏酸酯酶部分 2阿魏酸复合
体 ( PDB code 1JT2) ,构建了 AnFaeA与底物阿魏酸
的分子对接 (图 22B )。
21
2009年第 12期 胡雪松等 :阿魏酸酯酶基因克隆表达调控及其应用进展
3　阿魏酸酯酶基因的克隆表达、重组与调控
3. 1　阿魏酸酯酶基因的克隆表达
到目前为止 ,已有多位学者进行了阿魏酸酯酶目
的基因的克隆表达 ,并取得了较好的结果 ,其中主要
有 Evangelos Topakas小组、Faulds C B 小组、Hyun2
DongShin研究小组和 Takuya Koseki研究小组等。
在 Shin[ 9 ]等研究中发现 4类阿魏酸酯酶都有其
特有的保守序列 , C 型阿魏酸酯酶有共同的基序
GCSTG,而 A型阿魏酸酯酶的典型基序是 GHSLG,
但 B型和 D型阿魏酸酯酶的相应基序不如 A型和
C型保守 ,并且 C型阿魏酸酯酶的基序存在于一个
由 13 个氨基酸构成的保守序列 ( SYYLGCSTG2
GRQG)中 ,在 A型阿魏酸酯酶中也找到相似的由 16
个氨基酸组成的保守序列 (ALTVTGHSLGASLAAL )
(黑曲霉中有一个氨基酸不同 ) ,表明酯酶基序所在
的保守序列在底物特异性上起了决定作用。在
Moukouli最新文章中 [ 21 ] ,他们克隆了尖孢镰刀菌
( Fusarium oxysporum )中的阿魏酸酯酶基因 FoFaeC2
12213,并测定了其序列。在 NCB I里面比对后 ,该
基因与已报道的 C型阿魏酸酯酶有较高的相似性
(图 3) ,与从构巢曲霉 (A. n idu lans) AN1772. 2 有
51%的相似性 ,与 T. stipita tus的 TsFaeC[ 11 ]有 50%
相似性 ,与黑曲霉 An FaeB有 42%的相似性。且具
有 C型阿魏酸酯酶特有基序 ( G2C2S2T2G) ,存在于
一个由 13个氨基酸构成的保守序列 ( SYYLGCST2
GGRQG)中 ,另外 FoFaeC212213其分子量也与上述
几种酶的分子量大小相当 ,由此推测其为 C型阿魏
酸酯酶。另外 ,在比对结果中发现 , C型阿魏酸酯酶
序列还有另外 2个高度保守区 ( TGRFLSTGNGG和
GFATVGANNGHNGTS) ,这可能对 C型阿魏酸酯酶
的催化性能有很多关系。
最近 Koseki[ 16 ]在米曲霉 (A sperg illus oryzae)里
面克隆出 2种不同类别的阿魏酸酯酶 AoFaeB 和
AoFaeC,通过对其序列分析以及底物特异性研究 ,
其分别属于 B型和 C型阿魏酸酯酶。另外在其氨
基酸序列中发现 10多个 N2糖基化识别位点 ,说明
其具有天冬氨酸相连的高甘露糖寡糖 ,研究发现了
A sn2Xaa2Thr是比 A sn2Xaa2Ser更好的寡糖受体 [ 28 ]。
另外 ,已经有研究表明 [ 26 ] , N2糖基化位点对阿魏酸
酯酶的耐热性和蛋白质的折叠都很关键 ,其位点连
接的多糖 ,在酶表明延伸 ,与酶蛋白构成的多糖 2酶
结构使得阿魏酸酯酶活性部位稳定在开放构
象下 [ 29, 30 ]。
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双向箭头表示的是 FoFaeC212213的 1～18氨基酸信号肽 ,星号区域代
表高度保守区 (13氨基酸保守区 )
图 3　部分 C型阿魏酸酯酶氨基酸序列比对结果 [ 21]
底物的分子对接模型
3. 2　阿魏酸酯酶基因的调控
在阿魏酸酯酶表达调控方面以黑曲霉主产的
FAEA和 FAEB为例 , faeA表达调控主要有 2个途
径 :木聚糖 /木糖 (XlnR)诱导途径 (受转录激活因子
XlnR调节 ) [ 31 ] ,芳香化合物 (主要是阿魏酸 )诱导途
径 (影响呈抛物线状趋势 ) ,且二者是协同作用 ,单
独作用时阿魏酸酯酶的表达会大大降低。 faeB 的
表达系统没有木聚糖 /木糖 (XlnR )诱导途径控制 ,
其表达过程受阿魏酸含量的调控 ,但其他芳香化合
物对 faeB表达的影响跟 faeA不同 [ 32 ] ,说明芳香化
合物对 fae表达的调控机制有不同种方式。另外 ,
也可能是芳香酸代谢物细胞内的含量影响阿魏酸酯
酶的表达 [ 33, 34 ]。Ronald等还发现 CreA介导的碳代
谢产物抑制途径。他们发现葡萄糖能抑制以木糖为
碳源的野生菌株的 faeA基因的表达 ,但对 CreA突
变株却几乎没有抑制作用 ,说明碳代谢产物对 faeA
的抑制主要是由于 CreA导致的。
3. 3　阿魏酸酯酶基因的重组
目前 ,在酯酶重组方面取得了一定的成果 ,表达
系统主要是 E. coli表达系统和 P. pastoris表达系统 ,
其中对于 C型阿魏酸酯酶 ,更适于 P. pastoris表达
系统 ,如上文中阿魏酸酯酶基因 FoFaeC212213[ 21 ] ,
在宿主细胞 P. pastoris中表达后 ,用甲醇诱导表达的
重组蛋白 ,酶活是原酶活的 8倍之多 ,已达 830U - 1 ,
其最适 pH和最适温度分别是 6和 65℃。但是该重
组蛋白能在 pH范围 4～11内仍保持稳定 ,这种在
酸碱范围内的稳定性有助于工业生产 ,尤其是当 pH
是一个重要影响因素时 ,如碱法制浆。由于在工业
上 pH调整的不精确性和不及时 ,使得这种高稳定
性也使其能在 pH的不断细微变化中重新达到其最
大活性。Koseki[ 16 ]克隆表达的基因 AoFaeB能在 pH
范围 3～11内保持稳定 ,且在 pH < 3的酸性环境下
仍保持很稳定 ,酸稳定性的优势使其对于食品工业
尤其是酿造行业显得尤为重要。
在温控方面 ,前文中的 AoFaeB重组蛋白能在
30～62℃范围内保持高效稳定 ,酶活减少程度低于
10%。耐高温方面 , Record等以黑曲霉做受体菌 ,
对重组 FAEB进行同源高效表达 ,并根据其耐高温
性质在制浆应用上做了研究。纸浆处理的一般温度
是 50℃,试验发现 FAEB在经过 2 h的高温处理后
其酶活力减少程度低于 10% [ 15 ] ,使得重组 FAEB完
全能满足造纸工业应用的要求 ,这说明重组阿魏酸
酯酶性能上的改变 ,能满足某些工业的要求。为在
其他领域的工业应用提供了好的思路。
4　阿魏酸酯酶的应用
4. 1　在制浆制造方面
工业上要获得高品质的制浆 ,必须除去造成制
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2009年第 12期 胡雪松等 :阿魏酸酯酶基因克隆表达调控及其应用进展
浆呈黑色的木质素 ,牛皮制浆制造法用氯化合物除
木质素 ,但产生了过多的毒素 ,严重污染环境。而用
阿魏酸酯酶、木聚糖酶 ,漆酶等一起作用时 ,能使麦
秆浆粕、油籽亚麻浆粕有效脱木质化 [ 35 ]。三酶协同
作用优势在于无需使用氯化合物减少污染、降低制
浆的重要指标 KAPPA值 (3. 9) [ 36 ]、纸浆更为明亮 ,
也同时获取阿魏酸这一有经济效益的芳香酸 [ 37 ]。
4. 2　燃料乙醇生产
利用阿魏酸酯酶从可再生纤维素材料中转化得
到燃料乙醇。 Tabka等 [ 38 ]研究发现 ,黑曲霉 FaeA
连同木聚糖酶和漆酶联合转化生物质变成可产 bio2 ethanol的发酵性糖 ,他们用重组 FaeA 和木聚糖酶作用 ,通过测量糖得率 ,得到最佳催化条件。4. 3　释放芳香化合物从植物细胞壁中释放芳香化合物 ,如阿魏酸 ,香豆酸 ,芥子酸、咖啡酸等。这些芳香化合物被广泛应用于食品 ,化妆品 ,健康产业以及制药产业中 ,越来越受到社会的关注 ,尤其是阿魏酸 ,它有抗紫外 ,抗氧化 [ 39 ] ,以及消炎作用. 因能作用于过氧化氢和羟基自由基 ,阿魏酸对神经退化性疾病 ,如阿尔茨海默病 ( alzheimer’s disease, AD ) [ 40 ]有一定的治疗效果。另外 ,阿魏酸还是制造香料的前体 (图 4)。
FA. 阿魏酸 ; CA. 咖啡酸 ; pCA. 芥子算酸 ; SA. 香豆酸
图 4　阿魏酸酯酶的工业应用图标概括 [ 41]
5　展望
分子技术的成熟为阿魏酸酯酶在受体菌株中大
量表达以及阿魏酸酯酶的定向改造提供了有效方
法 ,这为降低阿魏酸酯酶生产成本、扩大生产量进而
工业化提供了可能性。但有关阿魏酸酯酶的种类 ,
不同阿魏酸酯酶最适 pH 和最适温度的显著差异
性 ,反应添加量等都有待继续研究。另外 ,如何对阿
魏酸酯酶进行定向进化 ,如何结合生物信息学研究
阿魏酸酯酶基因与酶学性质的关系 ,以及阿魏酸酯
酶的应用行业还有待不断开发 ,这些问题都有待深
入研究。
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