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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2014年第7期
阿魏酸酯酶（EC 3.1.1.73，feruloyl esterase，FA-
E）又称肉桂酸酯酶或肉桂酰酯酶，可以水解阿魏酸、
二聚阿魏酸形成的酯键，将阿魏酸释放出来，属于
羧酸酯水解酶亚类［1］。该酶可以协同木聚糖酶、纤
维素酶和木质素酶最大程度降解植物细胞壁［2］。因
此，阿魏酸酯酶在食品、医药、造纸、饲料加工、
生物合成及能源开发等诸多领域都有着巨大的应用
潜能。
产生阿魏酸酯酶的来源极其广泛，在微生物、
植物和动物中均有发现，其中以细菌和丝状真菌的
收稿日期 ： 2013-12-30
基金项目 ：山东省高等学校科技计划项目（J10LC08）
作者简介 ：胡泓宇，女，硕士研究生，研究方向 ：丝状真菌发酵和分子生物学 ；E-mail ：929112837@qq.com
通讯作者 ：侯运华，E-mail ：houyunhua@ qlu.edu.cn
一株产阿魏酸酯酶丝状真菌的分离鉴定及其
粗酶性质研究
胡泓宇  周燕燕  陈静  侯运华
（齐鲁工业大学食品与生物工程学院，济南 250353）
摘 要 ： 利用平板透明圈法，筛选分离到 37 株具有阿魏酸酯酶活性的丝状真菌，其中 1 株编号为 HA4087 的菌株具有较强
的产阿魏酸酯酶能力。经形态学观察、18S rDNA 和 ITS 序列鉴定为互隔交链格孢霉。对该菌株所产阿魏酸酯酶的粗酶性质进行了
初步研究，结果表明，在发酵培养基中发酵粗酶活力为 86 mU/mL，最适作用温度为 55℃，最适 pH 值为 5.5 ；在 55℃保温 30 min
后酶活力仍为 90% 以上 ；在 pH4.5-6.5 范围内稳定性较好，酶活仍为 85% 以上。试验获得了产高酶活阿魏酸酯酶的菌株，为阿魏
酸酯酶的工业化应用提供前提。
关键词 ： 阿魏酸酯酶 菌种鉴定 互隔交链格孢霉 酶学性质
Isolation，Identification and Enzyme Properties of a Strain Producing
Feruloyl Esterases
Hu Hongyu Zhou Yanyan Chen Jing Hou Yunhua
（Collage of Food and bioengineering，Qilu University of Technology，Jinan 250353）
Abstract:  Using the method of transparent zone, 37 filamentous fungi producing feruloyl esterase（FAE）were selected from rot soil
samples containing wood fibers. The strain HA4087 was isolated by its high FAE activities. It was identified as Alternaria alternata by conidia
morphology, 18S rDNA sequence and ITS sequence analysis. The characteristics of crude feruloyl esterase from A. alternate HA4087 were
preliminarily studied. FAE activity of the crude enzyme was 86 mU/mL. The optimal temperature and pH for crude FAE was 55℃ and pH5.5,
respectively. Crude FAE from A. alternate HA4087 remained nearly 90% of its maximal activity at 70℃ and was active in the pH range of 3.0-7.0.
The strain producing thermostable and high active FAE provided a prerequisite for the industrialization of feruloyl esterase.
Key words:  Feruloyl esterase Identification Alternaria alternata Enzyme properties
来源为主。产阿魏酸酯酶的细菌多为厌氧营养型，
不利于大规模工业化生产，因此关于丝状真菌产阿
魏酸酯酶的研究就显得十分重要［2，3］。丝状真菌产
阿魏酸酯酶的研究主要集中在曲霉属，以黑曲霉研
究得最为清楚。通常丝状真菌产阿魏酸酯酶活力较
低，如 de Vries 等［4］报道重组黑曲霉和塔宾曲霉产
阿魏酸酯酶活力分别为 7.71 U/mL 和 3.16 U/mL。关
于侧孢霉和黑曲霉生产阿魏酸酯酶研究比较多。侧
孢霉液态发酵酶活达到 2.0 mU/mL，固态发酵酶活
达到 156 mU/g［5］。阿魏酸酯酶活力低下限制了其在
2014年第7期 163胡泓宇等 ：一株产阿魏酸酯酶丝状真菌的分离鉴定及其粗酶性质研究
工业中的实际应用。
链隔孢属真菌是引起农作物病害的重要致病真
菌之一，属于丝孢纲丝孢目。对该类真菌的研究主
要集中在致病机理和生物防治方面［6］，该菌产生阿
魏酸酯酶的报道较少［7］。多数丝状真菌产阿魏酸酯
酶已经被国外酶制剂公司申请专利，要进行工业化
应用就需要筛选新的产酶菌株。基于此，本试验通
过对腐烂木质纤维的土壤样品中分离的产阿魏酸酯
酶丝状真菌进行筛选，得到 1 株产阿魏酸酯酶活性
高的菌株，对该菌株进行了菌种形态和分子生物学
鉴定，并对其所产阿魏酸酯酶的粗酶性质进行了初
步研究。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 样品材料 土样采集自山东济南长清周边含
有腐烂木质纤维（5-15 cm）的土壤。
1.1.2 化学试剂 对硝基苯酚、阿魏酸乙酯购自
Sigma 公司。凝胶回收试剂盒、pUM-T 载体购自百
泰克生物技术公司。T4 DNA 连接酶购自 TaKaRa 公
司，Taq DNA 聚合酶、pfuDNA 聚合酶为 Bioteke 公
司的产品，DNA 凝胶回收试剂盒购自 Sangon 公司 ；
阿魏酸对硝基苯酚酯根据文献一步法合成［8］；其他
常规试剂为国产分析纯。
1.1.3 培养基 富集培养基 ：马铃薯蔗糖琼脂培养
基（PDA）［9］，0.1% 阿魏酸乙酯（溶于 N，N-二甲
基甲酰胺溶液，过滤除菌）。
筛选培养基 ：（NH4）2SO4 2.5%，KH2PO4 0.2%，
MgSO4 0.6%，CaC12 0.07%， 酵 母 粉 0.5%，0.02%
TritonX-100，琼脂 1.5%。每个平板倒 20 mL 筛选培
养基，立即加 300 μL 的 10%（W/V）阿魏酸乙酯中，
立即摇匀，直至呈现云雾状。28℃培养 4 d，观察菌
落周围有无透明圈。
发 酵 培 养 基 ：麦 麸 汁 10%，NH4NO3 0.28%，
KH2PO4 0.2%，MgSO4.7H2O 0.08%，NaNO3 0.31%，
pH 5.5。
1.2 方法
1.2.1 产阿魏酸酯酶菌株的筛选 准确称取 1 g 土
样，加入 100 mL 含有无菌玻璃珠的生理盐水中，振
荡培养 2 h，即为土壤浸提液。取 1 mL 浸提液液接
种于富集培养基中进行培养，置于 28℃下 200 r/min
摇床培养 2 d。梯度稀释（10-1-10-6）培养物，各稀
释度取 100 μL 涂布于 PDA 平板上，28℃培养 4 d，
观察平板，菌落周围出现透明圈的即为具有产阿魏
酸酯酶能力的菌株。挑取有透明圈的菌落于 5 mL 生
理盐水试管中，制备孢子悬浮液，梯度稀释后涂布
在 PDA 平板培养基上培养至出现单菌落。重复 3 次
后的单菌落认为是纯化的菌株。根据透明圈直径大
小进行初筛，通过初筛的菌株液体培养后测上清阿
魏酸酯酶活进行复筛。
1.2.2 菌株的形态观察 按照《真菌鉴定手册》，将
纯化的菌株在 PDA 培养基上培养 7 d，观察菌落外
观形态和菌丝生长情况 ；显微镜高倍镜下观察菌丝
体和分生孢子的形态。
1.2.3 菌株的 18S rDNA 和 ITS 分子鉴定 将菌株斜
面孢子接种于 PDA 液体培养基中，30℃培养 72 h，
过滤收集菌丝体，采用液氮研磨法［10］提取其染色
体 DNA。
待测菌株的 18S rDNA 基因是以染色体 DNA 为
模板，在 18S rDNA 通用引物（EF3 和 EF4）的介导下，
采用 PCR 进行扩增。通用引物的序列如下 ：
EF3 ：5-TCCTCTAAATGGT-GACCAAGTTTG-3，
EF4 ：5-GGAAGGG［G/A］TG-TATTTATTAG-3。
PCR 扩增程序：94℃ 5 min；94℃ 30 s，47℃ 30 s，
72℃ 1 min 40 s，28 个循环 ；72℃ 10 min。
待 测 菌 株 的 ITS 序 列 是 在 通 用 引 物（ITS4 和
ITS86）的介导下，采用 PCR 进行扩增。通用引物
的序列如下 ：
ITS4 ：5-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3，
ITS86 ：5-GTGAATCATCGAATCTTTGAAC-3。
PCR 扩增程序除了退火温度为 50℃外，其余步
骤与 18S rDNA 的相同。
将 18S rDNA 和 ITS PCR 产物于 0.8% 琼脂糖凝
胶中电泳检查扩增结果。按照 DNA 凝胶回收试剂盒
说明书回收 PCR 产物，然后委托济南力戈生物公司
直接进行测序。
1.2.4 序列同源性分析及系统发育树的构建 测序
后将序列提交 NCBI GenBank 进行序列同源性分析，
并利用 Mega5.2 软件［11］进行 18S rDNA 基因的系统
发育树的构建。
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第7期164
1.2.5 阿魏酸酯酶粗酶液的制备及酶活测定 取 1
mL 发酵液于 4℃，10 000 r/min 离心 10 min，上清液
即为粗酶液。阿魏酸酯酶的酶活测定方法采用分光
光度法［12］测定，将反应条件下，每分钟降解阿魏
酸对硝基苯酚酯生成 1 μmol 对硝基苯酚所需的酶量
定义为一个酶活力单位 U。
1.2.6 温度和 pH 对阿魏酸酯酶粗酶液活性的影响
1.2.6.1 粗酶液最适温度及温度稳定性 分别在不
同温度下（30-70℃）测定阿魏酸酯酶活性。以最高
酶活为 100%，计算其他温度下的相对酶活，绘制
温度—相对酶活曲线。将粗酶液分别置于 45、55 和
65℃保温 60 min，测定残余酶活性，绘制不同温度
下相对酶活—温育时间曲线。
1.2.6.2 粗酶液最适 pH 及 pH 稳定性 将粗酶液在
不同 pH（pH3.0-7.5）条件下测阿魏酸酯酶的活性。
与温度类似，绘制相对酶活随 pH 变化的曲线。将
粗酶液用不同 pH 值缓冲液（pH3.5-7.5 的 0.1 mol/L
磷酸钠缓冲液）稀释，于 35℃下保温 1 h，测定残
余酶活。以其中酶活性最高者为 100%，其他 pH 值
下与该酶活的比值为该 pH 值下的相对酶活，绘制
相对酶活—pH 曲线。
2 结果
2.1 产阿魏酸酯酶丝状真菌的筛选
利用平板透明圈法，从含有腐烂木质纤维的土
壤中筛选分离到 37 株丝状真菌，其中 1 株透明圈直
径较大，将其编号为 HA4087，如图 1。该菌株在发
酵培养基中培养 5 d 后收集上清，测得发酵液上清
中阿魏酸酯酶活性为 86 mU/mL。
菌丝蔓延速度快，在 PDA 培养基上 28℃ 培养 4 d 后，
即可铺满整个平板。生长初期菌丝为白色绒毛状，
后期菌丝为灰黑色，菌落高耸突起，呈棉绒状。该
菌在生长过程中向培养基中分泌色素，因此平板背
面呈蓝黑色（图 1）。对 HA4087 的菌丝体和分生孢
子结构进行了显微观察，结果如图 2 所示。该菌株
的菌丝透明，有隔膜。菌丝顶端形成分生孢子。分
生孢子卵形，具有典型横隔膜，呈砖格状分隔（图
2-B），根据分生孢子的形态特征初步认为该菌属于
链格孢菌。
图 1 菌株 HA4087 在筛选平板上形成的透明圈（背面）
2.2 产阿魏酸酯酶丝状真菌的鉴定
2.2.1 菌株形态结构观察 菌株 HA4087 生长迅速，
A B
A ：Hyphae morphology ；B ：Conidia morphology
图 2 菌株 HA4087 的菌丝和分生孢子形态（16×40）
2.2.2 菌株分子鉴定 对菌株 HA4087 分别进行 18S
rDNA 和 ITS 序列的克隆，结果如图 3 所示。从图 3
中可以看出 PCR 产物扩增条带单一且明亮，产物大
小与预期吻合，初步表明 18S rDNA 和 ITS 序列已经
克隆得到。PCR 产物回收后，进行序列测定，测序
（结果省略）显示 18S rDNA 基因和 ITS 序列的 PCR
产物长度分别为 1 561 bp 和 783 bp。两个基因序列
已经提交 NCBI GenBank，编号分别为 KF962959 和
KF962960。
11.5
kb
M 1
2.8
1.7
1.1
0.5
5.0
kb
M 2
2.8
1.1
0.5
0.3
A B
M ：λDNA /Pst I ；1 ：18S rDNA ；2 ：ITS sequence
图 3 菌株 HA4087 18S rDNA（A）和 ITS PCR（B）扩增
电泳图
2014年第7期 165胡泓宇等 ：一株产阿魏酸酯酶丝状真菌的分离鉴定及其粗酶性质研究
将克隆的 18S rDNA 基因序列输入 GenBank 进
行 BLAST 分析，结果显示其与 Alternaria sp. 的相似
性最高，达 100%，初步鉴定其为链格孢属。并与
其他同源性高的菌株进行系统发育树的构建，结果
如图 4 所示。HA4087 与 Alternaria alternata 的相似
性达 99%，结合该菌的形态特征确定该菌属于链格
孢属。
将克隆的 ITS 序列进行 BLAST 分析，结果显示
其与 A. alternata 的相似性为 100%。结合该菌的形
态特征及 18S rDNA 序列，确定所分离的菌株为互隔
93
47
100
98
91
75
0.001
Setosphaeria monocerasAY016352.1
Bipolaris sp. JF2FJ666899.1
Cochliobolus lunatus strain NBRC 100164JN941609.1
Pyrenophora phaeocomes strain DAOM 222769JN940960.1
Lewia eureka isolateAFTOL-ID 267DQ677994.1
Alternaria japonica strain HDJZ-ZWM-06GQ354822.1
Setosphaeria sp. enrichment culture clone NJ-F2GU190183.1
Alternaria alternata strain FC007JN088533.1
HA4087KF962959
括号中的序号代表序列 GenBank 中登录号 ；分支点数字代表步长值 ；标尺代表序列间分歧度
图 4 菌株 HA4087 的 18S rDNA 基因序列系统发育树
交链格孢霉。
2.3 粗酶的酶学性质
2.3.1 温度对酶活力和稳定性的影响 分别在 30-
70℃测定粗酶液的活力，结果见图 5。结果显示，
菌株 HA4087 阿魏酸酯酶最适反应温度为 55℃，在
50-60℃的范围内催化活性较高。将酶液在 45-65℃
之间保存一定时间，测定残余酶活，结果（图 6）表明，
温度为 45℃时，该酶稳定，处理 60 min 后，剩余酶
活仍能达到 93.7% ；当温度为 55℃时，处理 30 min
后剩余酶活为 90.1%，随着温育时间的延长，剩余
酶活力下降较快 ；当温度达 65℃时，保温 10 min，
剩余酶活力仅为 16.8%。
图 5 温度对酶活力的影响
2.3.2 pH 值对酶活力和稳定性的影响 粗酶液在不
同 pH 下测定酶活力，以 pH 作出相对酶活力曲线，
图 6 温度对粗酶液稳定性的影响
0
20
40
60
80
100
120
0 10 20 30 40 50 60ᰦ䰤min⴨ሩ䞦⍫% 45ć 55ć 65ć
0
20
40
60
80
100
120
30 35 40 45 50 55 60 65 70⑙ᓖć⴨ሩ䞦⍫% 结果（图 7）表明，菌株 HA4087 阿魏酸酯酶的最适反应 pH 值为 5.5。在 pH5.0-7.0 的范围内，酶活力保持较高水平（80% 以上）。将酶液于 pH3.5-7.5中温育 60 min 后测定剩余酶活力，结果（图 8）表明，该酶在 pH4.5-6.5 的范围内稳定，残余酶活接
0
20
40
60
80
100
120
3.5 4 4.5 5 5.5 6 6.5 7 7.5
pH
⴨ሩ䞦⍫%
图 7 pH 值对酶活力的影响
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第7期166
近 85%。
2.4 互隔交链格孢霉阿魏酸酯酶与其他丝状真菌
产酶性质的比较
本研究将互隔交链格孢霉的阿魏酸酯酶性质和
黑曲霉、米曲霉、土曲霉和腐质霉所产生的酶进行
了酶学性质的比较（表 1）。表 1 显示，酶活高低次
序是黑曲霉＞腐质霉＞互隔交链格孢霉＞米曲霉和
土曲霉。互隔交链格孢霉的活力为 86 mU/mL，比土
曲霉和米曲霉的活力稍高，具有较强的酶活力。测
定的酶活和 Xiao 等［7］报道的酶活一致。后续通过
对培养基组成和发酵条件的优化及对出发菌株诱变
还能较大幅度提高酶的产量。酶的热稳定试验显示
HA4087 菌株产生的酶具有良好的热稳定性，当在
55℃温育 30 min 仍能保留 90% 以上的酶活，该特性
有助于在饲料工业中的应用开发。pH 稳定性和其他
来源的酶相比显得稍弱，后续可以通过定向进化来
提高 pH 稳定性。
0
20
40
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100
120
3.5 4 4.5 5 5.5 6 6.5 7 7.5
pH
⴨ሩ䞦⍫%
图 8 pH 值对酶稳定性的影响
表 1 不同菌株产生的阿魏酸酯酶 A 的性质比较
Feruloyl esterase A resource Activity（mU/mL） Optimum temperature and pH thermo-stabilitya pH-stabilityb
HA4087 86 55℃ and 5.5 90.1% 3.0-7.0
A. alternata FC007［7］ 89 ± 7 55℃ ND ND
A. niger［13］ 1250 55℃ and 5.0 16.4% 4.0-9.0
A. terrtus VTT-D-82209［14］ 60 55℃ and 5.0 17.8% 4.0-9.0
A. oryzae VTT-D-85248［14］ 72 55℃ and 4.5-6.0 ND 4.0-9.0
Humicola sp［15］ 470 65℃ and 4.0-6.0 70% 3.0-11.0
a ：incubated for 30 min under indicated temperature of 55℃，the relative residue activity was measured
b ：under indicated pH circumstances，the half-life times of relevant feruloyl estserase should sustain for more than 20 hours ；ND ：not determined
3 讨论
阿魏酸酯酶是半纤维水解酶系中关键的一员，
属于辅助酶，能够协同木聚糖酶和纤维素酶更好水
解相应的基质［16，17］。本研究分离得到 1 株高产阿魏
酸酯酶的互隔交链孢霉 HA4087，对该菌株所产阿魏
酸酯酶的粗酶性质进行了初步研究。结果表明该菌
株产生的阿魏酸酯酶活性较强，并具有良好的热稳
定性。这些特征表明互隔交链格孢菌所产的阿魏酸
酯酶具有重要的应用价值。对其阿魏酸酯酶酶学性
质的测定将有助于该酶实际应用参数的确定和优化，
尤其是对后续开展该菌阿魏酸酯酶的定向进化和高
效分泌表达的研究提供了前提和参考。
对互隔交链格孢霉 HA4087 的阿魏酸酯酶和其
他丝状真菌来源的酶进行了性质比较显示该酶具有
较好的应用前景。不同丝状真菌产生的阿魏酸酯酶
产量和酶学性质的不同可能是由目的基因转录强度、
mRNA 稳定性、分泌强弱、蛋白一级结构和翻译后
糖基化修饰等造成［16，17］。令人疑惑的是，黑曲霉、
黄曲霉和米曲霉的基因和蛋白序列的相似性达 90%，
但是酶活差异较大。此外，暗色孢属真菌产阿魏酸
酯酶的产生与其在植物组织中的强烈的蔓延性具有
一定的相关性，这可能也是该菌株产阿魏酸酯酶活
高于其他常规丝状真菌的活性。因此对其阿魏酸酯
酶的研究不仅能为阿魏酸酯酶家族增加新的试验材
料，还能加深暗色真菌侵染植物机制的理解。
4 结论
本试验从含有腐烂木质纤维的土壤中筛选分离
得到 1 株高产阿魏酸酯酶的丝状真菌 HA4087，经传
统形态学和分子生物学鉴定为互隔交链孢霉。该菌
株所产阿魏酸酯酶活力为 86 mU/mL，最适反应温度
为 55℃，最适 pH 值为 5.5 ；在 55℃保温 30 min 后
酶活力仍为 90% 以上 ；在 pH4.5-6.5 范围内稳定性
较好，酶活仍为 85% 以上。
2014年第7期 167胡泓宇等 ：一株产阿魏酸酯酶丝状真菌的分离鉴定及其粗酶性质研究
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（责任编辑 李楠）