全 文 ：
综述与专论

生物技术通报
BIOTECHNOLOGY
BULLETIN 2009年第 4期
黑曲霉脂肪酶分子结构预测
舒正玉1, 2
段漠杰 2
闫云君 2
黄建忠 1
( 1 福建师范大学工业微生物教育部工程中心,福州 350108; 2 华中科技大学生命科学技术学院,武汉 430074)


摘
要:
根据克隆到的黑曲霉脂肪酶基因序列, 概念性翻译出其编码的氨基酸序列。利用 B ioEd it、PSIPRED和 Sw iss

M odel等软件及服务器对黑曲霉脂肪酶的一级结构、二级结构和三级结构进行分子结构模型的预测与模拟。预测结果显示,
黑曲霉脂肪酶分子的一级结构、二级结构及三级结构的结构特点与丝氨酸水解酶高度吻合。预测的黑曲霉脂肪酶各种二级
结构成分含量与实际测定的重组黑曲霉脂肪酶二级结构成分相符。在三级结构水平上, 黑曲霉脂肪酶
盖子
结构域所在的
位置与已解析的黑曲霉阿魏酸酯酶对应结构域所在的位置存在显著差异。盖子结构域位置的差异预示一种开盖型脂肪酶分
子设计和构建的可能。
关键词:
黑曲霉
脂肪酶
阿魏酸酯酶
分子结构
结构预测
Molecular Structure Prediction of Lipase from Asperg illus niger
Shu Zhengyu
1, 2
Duan M ojie2
Yan Yunjun2
Huang J ianzhong1
(
1
Engineering Research Center of IndustrialM icrobiology, M inistry of Education, Fujian N ormal University, Fuzhou 350108;
2
College of L ife Science& T echno logy, H uazhong Science& T echnology University, W uhan 430074)


Abstrac:t
The prim a ry structure, secondary structure and th ree
d im ens ional structure o fA sperg illus niger lipase w as anno tated
through hom o logous lipases w ith known 3D structure in B ioEd it so ftw are, PSIPRED server and Sw issM ode l srever, re spec tive ly
The
predicted structure o fA
n iger lipasew as consisten tw ith tha t o f the ser ine hydro lase in the prim ary, seconda ry and three
dim ensiona l
structure leve l
The com position o f

he lix and

sheet in the pred icted seconda ry structure o f lipase from A
niger was consistent
w ith exper im enta l da ta
The pred icted m ode l o f 3D m o lecular struc ture of the lipasew as super imposed on tha t o f the feruloy l esterase
o fA
nig er
These find ings suggested the m a in difference in 3D struc ture betw een lipase and esterase produced by A
niger lied in
the lid structu re cove ring the ac tive s ite

Key words:
A sperg illus niger
L ipase
Feru loy l esterase
M olecu lar structure
Structure pred iction
收稿日期: 2008
10
14
基金项目:国家高技术研究计划资助项目 ( 2007AA100703 ),国家自然科学基金资助项目 ( 30870545 )
作者简介:舒正玉 ( 1971
) ,男,博士,研究方向:微生物脂肪酶; E
m ai:l shu zhengyu@ gm a il
com


黑曲霉 (A sp ergillus niger )脂肪酶已被广泛应用
于食品加工、油脂深加工、洗涤剂添加剂、手性化合
物的拆分、有机合成及有毒物质降解等诸多领域,具
有很好的工业应用前景 [ 1, 2]。有关黑曲霉脂肪酶的
研究主要集中于发酵生产、分离纯化、酶学性质及应
用 [ 3, 4] ,其分子结构到目前为止还没有任何文献报
道。作者在先前的实验中, 首次克隆并报道的黑曲
霉脂肪酶基因序列 ( G enB ank登录号: DQ647700) ,
与其他真菌脂肪酶的基因序列没有任何同源性 [ 5 ] ;
该基因编码的氨基酸序列与 Thermomyces lanug ino

sus脂肪酶, P enicillium camemberti单 (二 )酰甘油脂
肪酶, Rhizomucorm iehei脂肪酶, Rhizopus niveus脂肪
酶, Rhizopus oryzae脂肪酶的氨基酸序列分别有
50%、42%、34%、28%和 28%的同源性。利用上述
脂肪酶的 3D分子结构信息和生物信息学手段, 完
全可以模拟出可信度较高的黑曲霉脂肪酶的 3D分
子结构。在此基础上,再利用蛋白质工程技术改造
黑曲霉脂肪酶分子,有助于扩大黑曲霉脂肪酶的应
用范围。
脂肪酶与酯酶同为
/
水解酶类, 二者在组成
氧阴离子洞的第一个氨基酸残基区、
G
X
S
X
G

区、以及构成活性中心的氨基酸残基等部位具有高
2009年第 4期 舒正玉等:黑曲霉脂肪酶分子结构预测
度的保守性。在功能上,脂肪酶与酯酶均能催化酯键
的水解,但脂肪酶具有界面激活的催化特性而酯酶却
没有这一催化特性。黑曲霉脂肪酶与黑曲霉阿魏酸
酯酶在氨基酸序列水平上有 36%的同源性, 黑曲霉
阿魏酸酯酶 X
衍射的 3D结构图已经解析 ( PDB登录
号: 1uw c),比较脂肪酶与酯酶分子结构上的异同, 有
助于更好地理解脂肪酶和酯酶结构与功能之间的对
应关系。
1
材料及方法
1
1
黑曲霉脂肪酶氨基酸序列同源性比较
用 B ioEd it软件对 A
niger脂肪酶, T
lanuginosus
脂肪酶, P
camemberti单 (二 )酰甘油脂肪酶,
R
miehei脂肪酶和 A
niger阿魏酸酯酶进行同源性分
析。结合脂肪酶工程数据库 ( http: / /www
led
un i

stuttgart
de / )及上述已经解析的脂肪酶的结构信息,
对构成黑曲霉脂肪酶活性中心的氨基酸残基、组成氧
阴离子洞的氨基酸残基和二硫键位置等进行定位。
1
2
黑曲霉脂肪酶二级结构预测
将成熟黑曲霉脂肪酶的氨基酸序列输入到蛋白
质结构预测服务器中 ( PSIPRED v2
5) ,对其进行二
级结构的预测 [ 6]。
1
3
黑曲霉脂肪酶二级结构的圆二色谱测定
黑曲霉脂肪酶成熟肽的编码基因在毕赤酵母中
的异源表达及重组黑曲霉脂肪酶的分离纯化参照文
献 [ 7]。重组黑曲霉脂肪酶的二级结构成分用圆二
色光谱仪进行测定 ( JASCOJ
810型, 日本 )。样品
池光程 0
01 cm,带宽 0
5 nm, 响应时间 0
25 s,扫
描速度 200 nm /m in,扫描波长范围 260~ 170 nm,重
组脂肪酶的浓度为 0
18 mg /m ,l取 6次扫描数据的
平均值,得到 CD波谱图。以仪器提供的 Y ang蛋白
作为参考蛋白,计算出重组黑曲霉脂肪酶的各种二
级结构成分的含量。
1
4
黑曲霉脂肪酶 3D结构的模拟及优化
以与黑曲霉脂肪酶同源性最高的 T
lanuginosus脂
肪酶的 3D分子结构 ( PDB登录号: 1DT3)作为模板,运
用 Sw issM odel同源建模 [ 8]。模拟的分子模型先用 DIS

COVER M odule进行能量最低化优化, 再用 PRO

CHECK评价其立体化学参数 [ 9]。将得到的优化后的
合理黑曲霉脂肪酶分子模型再用 VMD软件实现可
视化 [ 10]。
1
5
黑曲霉脂肪酶与黑曲霉阿魏酸酯酶 3D结构
的比较
运用组合扩展方法 ( comb inatorial ex tension )比
对计算黑曲霉脂肪酶与黑曲霉阿魏酸酯酶的结构相
似性 [ 11]。生成的 PDB文件通过 RASMOL软件实现
可视化。
2
结果与分析
2
1
黑曲霉脂肪酶氨基酸序列与其他同源蛋白氨
基酸序列的比较
B ioEd it同源性比对分析结果如图 1。从图 1中
可以看出 A
niger脂肪酶 (ANL)、T
lanuginosus脂肪
酶 ( TLL)、P
cam em betri单 (二 )酰甘油脂肪酶 ( PC

MDL)、R
m iehei脂肪酶 ( RML)和 A
niger阿魏酸酯
酶 (ANE )在
G
X
S
X
G
区和组成氧阴离子洞的第
一个氨基酸残基区具有高度的保守性。结合脂肪酶
工程数据库对丝状真菌脂肪酶的注释, 可以推测:
( 1)黑曲霉脂肪酶分子肽链中含有 3对二硫键, 分
别定位于 Cys22 /Cys268、Cys35 /Cys40和 Cys104 /Cys107;
( 2) Ser
146
, Asp
201和 H is258构成黑曲霉脂肪酶活性中
心的催化三联体; ( 3) Ser83和 Leu147为黑曲霉脂肪酶
组成氧阴离子洞 ( oxyanion hole)的氨基酸残基。
D1, D2, D3分别代表 3对二硫键; 小圆圈代表组成氧阴离子洞的氨
基酸残基;三角符号代表组成活性中心的催化三联体; 粗横线指示
的氨基酸残基序列为
G
X
S
X
G
保守区; 细横线指示的氨基酸残基
序列为组成氧阴离子洞的第一个氨基酸残基区
图 1
黑曲霉脂肪酶氨基酸序列与
同源脂肪酶氨基酸序列比较
此外,根据 PROSITE模体预测法预测黑曲霉脂
肪酶蛋白中含有 3个潜在的糖基化位点, 分别为:
N
32
VTC、N123 LTS和 N 242 STA, 这与黑曲霉脂肪酶基
因在 P ich ia pastoris中表达分泌两种分子量大小不
37
生物技术通报 B iotechnology
Bulletin 2009年第 4期
同的重组脂肪酶相对应 [ 7]。
2
2
PSIPRED预测黑曲霉脂肪酶二级结构
PSIPRED蛋白质结构预测服务器对黑曲霉脂
肪酶二级结构的预测结果表明,黑曲霉脂肪酶蛋白
中, 含 32
59% 的

螺旋, 21
85% 的

折叠和
45
56%的其他成分, 这一比例符合
/
折叠蛋白
的二级结构比例 (

螺旋所占比例 > 30%且

折叠
所占比例 > 20% )。圆二色谱测定的重组黑曲霉脂
肪酶二级结构表明,

螺旋含量为 36
1%,

折叠
含量为 25
9%, 其他成分含量为 38% , 与预测的二
级结构含量相近。不同氨基酸残基序列在二级结构
中的分布如图 2。
圆柱代表

螺旋;箭头代表

折叠
图 2
黑曲霉脂肪酶氨基酸序列二级结构预测示意图
圆柱代表

螺旋;箭头代表

折叠
图 3
黑曲霉脂肪酶 3D分子结构模拟图
2
3
黑曲霉脂肪酶 3D分子结构模拟
黑曲霉脂肪酶 3D分子结构模拟图如图 3。在模
拟的脂肪酶 3D分子结构中,
折叠位于脂肪酶分子
的中央,

螺旋包围在

折叠的外面, 形成近似球形
的蛋白质分子, 该结构符合
/
水解酶的结构特
点 [ 12]。Leu86至 Asp92之间的氨基酸残基形成的

螺
旋 (盖子结构 )覆盖在活性中心的上方。 Ser146, Asp201
和 H is258 3个氨基酸残基组成的催化三联体,在空间
结构上充分靠近 (图 4),构成酶的催化活性中心。
图 4
催化三联体结构模拟图
2
4
A
niger脂肪酶与 A
niger阿魏酸酯酶分子 3D
结构比较
A
niger脂肪酶与 A
niger阿魏酸酯酶均属于丝
氨酸水解酶, 均具有
/
水解酶的折叠方式, 两种
酶的单分子在空间结构上具有高度的相似性, 3D分
子结构对应部分重叠性相当高。在活性中心的上
方, 脂肪酶分子有 1个

螺旋形成的盖子 ( lid )结
构, 而阿魏酸酯酶分子对应的

螺旋结构域远离活
性中心的上方 (图 5)。这一位置差异与脂肪酶具有
界面激活而酯酶却不具界面激活的催化性质相吻
合。这一结构位置的差异也预示: 利用蛋白质工程
技术互换脂肪酶与酯酶盖子结构及其两侧的对应结
构域,有可能获得一种开盖型的脂肪酶分子。
图 5
黑曲霉脂肪酶分子与阿魏酸酯
酶分子 3D结构重叠比较图
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2009年第 4期 舒正玉等:黑曲霉脂肪酶分子结构预测
3
讨论
根据氨基酸序列的同源性和 3D分子结构已知
的蛋白质分子提供的信息,利用生物信息学技术,模
拟出新蛋白质的 3D分子结构, 有助于从分子水平
上更好地认识新蛋白的功能,促进蛋白质工程的发
展。目前,已发展出多种理论方法和模型进行蛋白
质分子的同源建模。本研究利用 PSIPRED服务器
和 Sw issM odel服务器预测并模拟出的黑曲霉脂肪酶
二级结构和三级结构理论上均符合
/
水解酶折
叠的结构特征。
N eves Petersen等 [ 13, 14]比较了多种脂肪酶、酯酶
分子表面的静电荷、极性和非极性氨基酸残基在酶
分子表面的分布后, 认为上述因素是影响脂肪酶与
酯酶的底物特异性、活性或稳定性对 pH的依赖性
的重要因素。因此, 深入了解黑曲霉脂肪酶和黑曲
霉阿魏酸酯酶的结构与功能,除了比较二者的结构
差异之外,还有必要利用 GRASP软件对黑曲霉脂肪
酶和黑曲霉阿魏酸酯酶分子表面的结构特点进行
表征 [ 15]。
参 考 文 献
1
Fu X, ZhuX, Gao K, et al
JAm O ilCh em Soc, 1995, 72: 527~
530

2
Saisub ram an ian N, E dw inol iver NG, Nand akum ar N, et al
J Ind
M icrob iolB iotechno,l 2006, 33: 669~ 676

3
M ahad ikND, Bastaw de KB, Puntam bekar US, et al
Process B io

chem, 2004, 39: 2031~ 2034

4
Fern
ndez
Loren te G, O rt iz C, Segura RL, et al
B iotechnol B io

eng, 2005, 92: 773~ 779

5
Shu ZY, Yan YJ, Y ang JK, et al
B iotechnolLett, 2007, 29: 1875
~ 1879

6
M cGu ff in LJ, B ryson K, Jon es DT
B ioin form atics, 2000, 16: 404
~ 405

7
舒正玉,杨江科,徐莉,等
武汉大学学报 (自然科学版 ) , 2007,
53: 204~ 208.
8
S chw ede T, K opp J, GuexN, et al
NucleicA cidsRes, 2003, 31:
3381~ 3385

9
Laskow sk i RA, M acArthu r MW, Moss DS, et al
J App l Cryst,
1993, 26: 283~ 291

10
H umphreyW, Dalke A, Schu lten K
JMo lG raph icsM odel,l 1996,
14: 33~ 38

11
Sh indyalov IN, Bourn e PE
Protein E ng, 1998, 11: 739~ 747

12
O ll is DL, Cheah E, C yglerM, et al
Protein E ng, 1992, 5: 197~
211

13
Neves Petersen MT, Fojan P, Petersen SB
J B iotechn o,l 2001,
85: 115~ 147

14
Fojan P, Jon son PH, Petersen SB
B ioch im ie, 2000, 82: 1033
~ 1041

15
N icholls A, Sharp KA, H on ig B
Proteins: S truct Funct Gen et
1991, 11: 281~ 296

39