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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2011 年第 4 期
农杆菌介导的紫花苜蓿高效遗传转化体系的研究
徐春波1 王勇2 赵海霞1 李兴酉1
(1中国农业科学院草原研究所，呼和浩特 010010;2内蒙古农业大学生态环境学院，呼和浩特 010018)
摘 要: 为建立高效的农杆菌介导的紫花苜蓿的遗传转化体系，对影响转化体系的若干因素进行了研究。结果表明，
最适宜的条件分别为抗菌素为 350 mg /L的羧苄青霉素(Carb) ;卡那霉素(Kan)筛选的浓度为 60 mg /L;基因型为 WL-323;外
植体为下胚轴;农杆菌菌液浓度 OD600值为 0． 4 － 0． 6;侵染时间 10 min;乙酰丁香酮(AS)的浓度为 10 mg /L。
关键词: 紫花苜蓿 遗传转化 农杆菌介导
Study on Agrobacterium-mediated Transformation System in Alfalfa
Xu Chunbo1 Wang Yong2 Zhao Haixia1 Li Xingyou1
(1Grassland Research Institute of Chinese Academy of Agricultural Sciences，Huhhot 010010;
2College of Ecology and Environment，Inner Mongolia Agricultural University，Huhhot 010018)
Abstract: In order to establish high-efficiency alfalfa genetic transformation system，the influence factors of Agrobacterium-media-
ted transformation system were studied． The results showed that the most suitable conditions for Carbenicillin(Carb)was 35 mg /L;Ka-
namycin(Kan)was 60 mg /L;the genotypes was WL-323;the explantwas hypocotyl;OD600 of bacterial concentration value for 0. 4 － 0. 6;
the infection time was 10 min;Acetosyringone(AS)concentration was 10 mg /L．
Key words: Alfalfa Genetic transformation Agrobacterium-mediated
收稿日期:2010-10-29
基金项目:中央级公益性科研院所基本科研业务费专项资金项目(2006-1-01)
作者简介:徐春波，女，硕士，助理研究员，研究方向:牧草种质资源、遗传育种与生物技术;E-mail:xcb972002@ 163． com
紫花苜蓿(Medicago sativa L．)被誉为“牧草之
王”，它不仅营养价值高、适口性好、适应性强，而且
对生态环境治理、固土护坡和防止水土流失也起到
重要的作用，是全世界广为种植的优良牧草。近年
来，随着生物技术的发展，转基因技术已成为改良饲
用牧草和作物遗传的有效途径［1，2］。迄今，通过农
杆菌介导途径进行的作物转基因研究已取得了重大
进展［3 － 10］，该技术方法也是苜蓿基因转化最成熟的
途径［11］。早在 1986 年，Deak 和 Webb 等［12，13］就分
别通过农杆菌转化法成功地将 nptⅡ基因导入苜蓿，
并获得了可育抗性植株，但是转化效率较低一直是
困扰苜蓿基因改良的一个重要因素。因此，为建立
高效的农杆菌介导的紫花苜蓿的遗传转化体系，本
试验拟对影响农杆菌转化的各种因素进行系统地研
究，以期建立高效的遗传转化体系，为紫花苜蓿的基
因工程育种奠定基础。
1 材料与方法
1． 1 材料
1． 1． 1 植物材料 紫花苜蓿的 4 个品种“中苜 1 号
(M． sativa L． CV． Zhongmu No． 1)”，“公农 1 号(M．
sativa L． CV． Gongnong No． 1)”，“猎人河(M． sativa
L． CV． Hunter Rive)”和“WL-323(M． sativa L． CV．
WL-323)”。
1． 1． 2 菌株和质粒 农杆菌菌株为 C58。质粒为
PBI121-CBF1(含有 CBF1 基因和 Kan抗性基因)。
1． 1． 3 培养基 预培养、共培养和愈伤诱导培养基:
改良 SH +2，4-D(4． 0 mg /L)+6-BA(0． 5 mg /L);继代
培养基:MSO + NAA(0． 5 mg /L)+6-BA(0． 5 mg /L)+
AgNO3(1． 0 mg /L);分化培养基:MS;生根培养基:1 /
2MS;农杆菌培养基:YEB培养基。
1． 2 方法
1． 2． 1 抗菌素及其浓度的确定 在分别含有浓度
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2011 年第 4 期
为 100、150、200、250、300、350、400、450、500、550 和
600 mg /L的 Carb和头孢霉素(Cef)的 YEB 液体培
养基中加入菌液培养后，以未加抗生素的液体 YEB
为对照，在波长 600 nm下用分光光度计测定其 OD600
值，每个处理重复 3次，计算出 3 个重复样品的 OD600
值的算术平均值。
将紫花苜蓿外植体接在含有 0、100、200、300、
400、500 和 600 mg /L 已确定出的抗菌素共培养基
上，30 d后分别统计胚性愈伤组织的诱导率。
1． 2． 2 Kan 筛选压的确定 将外植体和生长 30 d
的愈伤组织分别接种于含有 0、10、30、50、60、70、90
和 110 mg /L Kan的愈伤诱导培养基和分化培养基
上，30 d统计外植体的出愈率和分化率。
1． 2． 3 不同基因型对转化的影响 对 4 个紫花苜
蓿品种的相同外植体分别进行农杆菌侵染，共培养
3 d后进行 GUS组织化学染色分析。
1． 2． 4 不同外植体类型对转化效率的影响 分别
侵染同一苜蓿品种的叶片、叶柄、茎段、子叶和下胚
轴 5 种外植体，共培养 3 d 后进行 GUS 组织化学染
色分析。
1． 2． 5 农杆菌不同菌液浓度对转化效率的影响
分别用 OD600值为 0． 2、0． 4、0． 6、0． 8 和 1． 0 的农杆
菌菌液侵染苜蓿外植体，共培养 3 d 后进行 GUS 组
织化学染色分析。
1． 2． 6 侵染时间对转化效率的影响 对苜蓿外植
体进行农杆菌侵染，侵染时间分别为 1、5、10、15 和
20 min，共培养 3 d后进行 GUS组织化学染色分析。
1． 2． 7 AS浓度对转化效率的影响 将农杆菌侵染
后的苜蓿外植体接种在分别加入 0、10、15、20 和 25
mg /L乙酰丁香酮的共培养基中，共培养 3 d 后进行
GUS组织化学染色分析。
2 结果与分析
2． 1 抗菌素及其浓度的确定
对 Carb 和 Cef两种抗菌素抑制农杆菌的生长
进行了试验，结果见图 1。由图 1 可知，两种抗菌
素虽然对农杆菌都有抑制作用，但效果不同。当
Carb达到 350 mg /L时基本能抑制农杆菌的生长，
Cef浓度达到 600 mg /L 也不能彻底抑制住农杆菌
的生长，故选择 Carb来去除农杆菌。在此基础上，
对抗菌素 Carb 的不同浓度进行了筛选，结果见图
2。随着 Carb浓度增加，胚性愈伤组织诱导率逐渐
降低，当 Carb 浓度为 400 mg /L 以下时，胚性愈伤
组织诱导率降低的幅度不大，Carb 浓度为 400 mg /L
以上时，胚性愈伤组织诱导率开始大幅降低。基于
对农杆菌的生长能有效抑制和对胚性愈伤组织诱导
率的影响两方面考虑，Carb 浓度为 350 mg /L 是最
适宜的。
图 1 抗菌素 Cef和 Carb对农杆菌的抑制作用
图 2 羧苄青霉对胚性愈伤组织诱导率的影响
2. 2 选择培养中选择压的确定
以外植体和生长 30 d 的愈伤组织为材料，测试
不同浓度 Kan 对其影响，结果见表 1。从表 1 中可
以看出，不同浓度的 Kan 对外植体愈伤的生成和分
化有明显影响。在无 Kan 的培养基上，出愈率和分
化率分别为 97． 8%和 69%。随着 Kan浓度的加大，
出愈率和分化率都逐渐下降。当 Kan 浓度小于
50 mg /L时，Kan对愈伤组织的抑制作用不明显，当
浓度达到 60 mg /L时 Kan对愈伤组织出愈率和分化
率的抑制作用较明显，而且在以后的继代培养中，这
些胚性愈伤组织变黄，逐渐转变成褐色，最后成黑色
死亡，这时的 Kan 浓度已经可以完全抑制芽的形
成。所以确定60 mg /L是筛选紫花苜蓿转化植株的
最佳 Kan浓度。
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2011 年第 4 期 徐春波等:农杆菌介导的紫花苜蓿高效遗传转化体系的研究
表 1 Kan对外植体愈伤诱导率和分化率的影响
Kan浓度(mg /L) 出愈率(%) 分化率(%)
0 97． 8 69
10 85 45
30 66 30
50 29 10
60 18 2
70 14 0
90 5． 6 0
110 0 0
2． 3 基因型对转化率的影响
对 4个紫花苜蓿品种的相同外植体分别进行农
杆菌侵染，共培养 3 d 后进行 GUS 组织化学染色分
析，结果见图 3。从图 3可以看出，这 4个苜蓿基因型
在转化率上存在一定的差别，其中WL-323 的 GUS阳
性率最高，达到 60． 3%，中苜一号的最低为49． 2%。
因此WL-323是进行苜蓿遗传转化的最佳基因型。
图 3 基因型对转化率的影响
2． 4 外植体对转化率的影响
将 WL-323 子叶、叶片、茎段、叶柄和下胚轴 5
种外植体分别进行农杆菌侵染，共培养 3 d 后进行
GUS组织化学染色分析，结果见图 4。从图 4 看出，
5 种外植体的转化率差异显著，GUS 阳性率从高到
低的顺序为下胚轴 ＞茎段 ＞叶柄 ＞子叶 ＞叶片，下
胚轴的转化率最高，是进行苜蓿遗传转化的最佳外
植体。
2． 5 农杆菌菌液浓度对转化率的影响
用 OD600值为 0． 2、0． 4、0． 6、0． 8、1． 0 的农杆菌
菌液侵染苜蓿外植体，共培养 3 d 后进行 GUS 组
织化学染色分析，结果见表 2。由表 2 可知，OD600
值为 0． 6 时 GUS阳性发生率最高，OD600值大于或
图 4 外植体对转化率的影响
小于 0． 6 时 GUS阳性发生率都有所下降，但当菌液
浓度 OD600为 0． 4 和 0． 6 时，GUS阳性发生率分别为
50． 8%和 57． 6%，高于其它处理，两者相差不大。
因此侵染外植体的最适宜菌液 OD600应为 0． 4 － 0． 6
之间。
表 2 菌液浓度对转化率的影响
菌液浓度(OD600) GUS阳性发生率(%)
0． 2 26． 4
0． 4 50． 8
0． 6 57． 6
0． 8 43． 5
1． 0 25． 2
2． 6 侵染时间对转化率的影响
设置不同侵染时间 1、5、10、15 和 20 min，以确
定农杆菌侵染紫花苜蓿外植体的合适侵染时间，结
果(图 5)显示，侵染时间对转化率有很大的影响，当
侵染时间在 10 min时，GUS阳性率明显高于其它的
处理，故侵染紫花苜蓿外植体最适宜的时间应为
10 min。
图 5 侵染时间对转化率的影响
2． 7 AS浓度对转化率的影响
将农杆菌侵染后的苜蓿外植体接种在分别加入
0、10、15、20 和 25 mg /L AS的共培养基中，共培养 3
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生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2011 年第 4 期
d后进行 GUS 组织化学染色分析。结果(图 6)显
示，不同浓度的 AS对转化效率的影响很明显，其中
加入 AS浓度为 10 mg /L时得到的 GUS阳性率比其
它处理要高，加入 20 mg /L 时的结果最低。因此在
共培养基中添加 10 mg /L的 AS最为适宜。
图 6 AS浓度对转化率的影响
3 讨论
3． 1 农杆菌菌株对转化的影响
农杆菌菌株的侵染能力是转化中关键的因素之
一，菌株对材料的转化能力体现在两个方面:一是农
杆菌能否吸附在植物细胞表面，Vir 区能否诱导表
达，T-DNA能否转至植物细胞并整合到植物基因组
中;二是菌株对植物材料细胞的伤害程度。农杆菌
有效地附着于植物细胞上是保证其 T-DNA 进入寄
主植物细胞的前提，因此选择合适的菌株是转化成
功的必要前提。本试验使用的农杆菌菌株 C58，载
体 PBI121-CBF1 含有 CaMV35S 启动子、GUS 基因、
CBF1 基因和 Kan 基因，这为基因的成功转化提供
了良好的条件。
3． 2 Kan对转化效率的影响
在选择压力下，不含标记基因及其产物的非转
化细胞和组织死亡，而转化细胞由于有抗性，可以继
续存活，因而有利于从大量的非转化细胞和组织中
选择出转化克隆［14，15］。不同植物的外植体对卡那
霉素具有不同的敏感性，因此在转化之前确定合适
浓度的 Kan，以便在这个合适浓度的选择压力下，非
转化细胞的生长能有效地被抑制，缓慢死亡，转化细
胞正常生长和发育［16］。本试验中，苜蓿的外植体在
愈伤阶段对卡那霉素不太敏感，需要 60 mg /L 来进
行筛选，过高的选择压可能会降低转化体细胞的分
裂活性，致使再生芽出现很少，而再生芽对 Kan 的
敏感性较高。试验中采用了延迟筛选的方式来筛选
转化体，结果表明，延迟 20 d 筛选有利于转化效率
的提高。
3． 3 侵染时间对转化效率的影响
外植体在菌液中的侵染时间对转化效率有直接
的影响，时间过短，农杆菌不能充分接种到伤口，在
其共培养时无农杆菌生长，不能转化或农杆菌生长
很少，转化率极低;侵染时间过长，外植体会因农杆
菌毒害缺氧而软腐。因此，适宜的侵染时间有助于
减少共培养可能造成的污染，还可减轻农杆菌对外
植体的毒害作用。陈廷速等［17］报道用农杆菌菌株
EHA105 侵染香蕉横切薄层切片以 5 － 8 min 为宜，
GUS 基因瞬时的表达率比较高。于景华等［18］报道
用根癌农杆菌 LBA4404 侵染白桦叶片以 10 － 20
min 最好，时间超过 20 min 后，抑菌比较困难，外植
体的致死率也大大增高。本试验结果表明，对紫花
苜蓿外植体进行农杆菌侵染最适宜的时间应为
10 min。
3． 4 AS对转化效率的影响
AS是基因转化中常用的诱导能力最强的酚类
化合物，适宜浓度的 AS 可以促进 Vir 活化及表达，
因此在共培养时添加一定浓度的 AS 可以提高转化
效率。刘庆法等［19］在农杆菌介导的小麦遗传转化
中对不同浓度 AS 的转化效率作了研究，证明当 AS
的浓度达到 50 μmol /L 时可有效诱导 T-DNA 的转
移，浓度过高过低转化效率都比较低。本试验在共
培养基中添加不同浓度的 AS 得到的 GUS阳性率不
同，加入 AS 浓度为 10 mg /L 时得到的 GUS 阳性率
最高。
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(责任编辑 李楠
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