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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2010 年第 6 期
鸡传染性支气管炎病毒 ZZ2004 分离株 3a、3b
及 E基因的序列测定与分析
姚四新1 王宪文1 周晓丽1 刘兴友1 刘金华2
(1河南科技学院动物科学学院，新乡 453003;2中国农业大学动物医学院，北京 100094)
摘 要: 采用随机引物 PCR技术从具有腹泻、呼吸道症状及肾脏病变的肉鸡及无明显症状但生长迟缓的鸭体内获得一
段长 1 171 bp的片段，将此片段克隆入 pMD18-T载体，测序后将序列用网上的 BLAST软件和 DNASTAR软件进行分析，结果
表明所测序列与 IBV 主要参考毒株的同源率为 82 0% － 94 4%，与国内主要毒株 CK/CH /LGD /04III、CK/CH /LGD /04II、
chicken /JS /YZ07 /2008、CK/CH /LSC /99I、SAIBK的同源率较高，达 92 4% － 94 4%，与国外毒株 M41、H120、Beaudette、IBV 4 /
91 的同源性较低达 85 2% － 87 9%，从而确定所分离毒株 ZZ2004 为肾型传染性支气管炎病毒。
关键词: 随机引物 鸡传染性支气管炎病毒 随机引物 PCR技术
Sequencing and Sequence Analysis of the 3a，3b and E Gene of
Infectious Bronchitis Virus ZZ2004 Strain
Yao Sixin1 Wang Xianwen1 Zhou Xiaoli1 Liu Xingyou1 Liu Jinhua2
(1The Animal Science College，Henan Institute of Science and Techrowgy，Xinxiang 453003;
2 College of Veterinary Medicine，China Agricultural University，Beijing 100094)
Abstract: The PCR product of length of 1 171 bp was derived from chickens which had，respiratory symptom and pathological
changes of the kidneys and ducks which had no obvious symptom by using random PCR，and was cloned into pMD18-T vector. and then
was analyzed using the software BLAST and DNASTAR. The result showed that the identity of the nucleotide sequence of obtained gene
between ZZ2004 isolate and other IBV reference strains were from 82 0% to 96 0%，and the identity of that and other domestic IBV
reference strains were from 92 4% to 94 4% . The identity of that and other overseas IBV reference strains were from 85 2% to
87 9% . The present study indicated that ZZ2004 isolate may be a member of avian nephrotic infectious bronchitis virus.
Key words: Random primer Avian nephrotic infectious bronchitis virus Random amplified polymorphic DNA(RAPD)
收稿日期:2010-01-23
基金项目:国家自然科学基金项目(30170707)
作者简介:姚四新，男，兽医博士，副教授，主要从事动物分子病毒学研究;E-mail:32147857@ sina. com
通讯作者:刘兴友，E-mail:lxy63@ hist. edu. cn
ZZ2004 病毒株是 2004 年 3 月从河南郑州地
区患有腹泻、呼吸道症状及肾脏病变的肉鸡及无
明显症状仅生长缓慢的鸭体内分离到的一株能
引起鸡胚蜷缩、出血的 RNA 病毒，尽管进行了大
量的血清学、病毒形态学、理化特性等研究，同时
按照鸡传染性支气管炎病毒的保守序列核蛋白 N
基因序列设计了 3 对引物，分别为 P1:5′-TAAGGATC-
CGTCATGGCAAGCGGTAAGGCA-3′，P2:5′-CGGGCTCG-
AGATTTTACTCAAAGTTCATTCTCTCC-3′;P3:5′-GAG-
GATCCATGGCAAGCGGTAAGG-3′，P4:5′-GCGCAAGCT-
TCAAAGTTCATTTTCAC-3′;P5:5′-GTCTTCTCCCGCGT-
GTA-3′，P6:5′-ACCCTTACCAGCAACCC-3′，RT-PCR 扩
增的结果均为阴性，以上研究均未能就其分类归属给
出明确的结论。因此，为了明确该病毒的分类地位，
采用随机 PCR方法对这株病毒的部分基因组进行了
扩增、克隆和序列分析［1］。
1 材料与方法
1 1 病毒的一般性质
用 SPF鸡胚从一起具有腹泻、呼吸道症状及肾脏
病变的肉鸡体内分离到的病毒，经 SPF鸡胚多次传代
2010年第 6期 姚四新等:鸡传染性支气管炎病毒 ZZ2004分离株 3a、3b及 E基因的序列测定与分析
后仍可导致鸡胚的蜷缩、出血。电镜观察，病毒颗粒
为球形或椭圆形，不能被 IBDV、ALV、MDV等抗体所
中和，理化特性试验证实为耐酸碱和耐热的 RNA 病
毒，暂命名 ZZ2004毒株。
1 2 菌株、载体及试剂
RNA 提取试剂盒(MiniBEST Viral RNA/DNA
Extraction Kit Ver. 3 0)、E. coli JM109、pMD18-T、RT-
PCR 试剂盒、dNTPs、RNase Free Water、RNA 酶抑制
剂 Rnasin(RNase inhibitor)、凝胶 DNA快速纯化回收
试剂盒(TaKaRa Agarose DNA Purification Kit Ver.
2 0)购自大连宝生物公司;随机引物 S1-S38 购自上
海生物工程公司;Trizol购自 Invitrogen 公司。
1 3 病毒尿囊液的处理［1］及 RNA的提取
(1)取病毒的鸡胚尿囊液 50 mL /管，4℃，
12 000 r /min，离心 30 min，取上清液。(2)将上述
上清液加入超速离心管中，50 mL /管，4℃，80 000 ×
g，离心4 h。(3)弃去上清液，沉淀用 1 mL生理盐水
悬浮，－ 20℃保存备用。(4)以 100 U /200 μL 加入
DNAaseⅠ，37℃，震荡作用 2 h。(5)取上述病毒处
理液 200 μL，加入 1 mL Trizol 混匀，用枪头反复吹
吸，再加入 1 μL 糖原(1 mg /mL) ，室温放置 5 min，
后加入氯仿 200 μL，密封后剧烈震荡 15 s，4℃，
12 000 r /min，离心 5 min。(6)取上层水相转移至
另一 1 5 mL EP管中，加入 500 μL 异丙醇沉淀，室
温放置 5 min，4℃，12 000 r /min，离心 5 min。(7)小
心移去上清液，否则会出现 DNA污染。(8)用 70%
乙醇(DEPC 处理水配制)悬浮，4℃，12 000 r /min，
离心2 min。(9)重复步骤(8)。(10)小心吸弃上清
液，室温下干燥 3 － 5 min，加入 30 μL DEPC 水
溶解。
1 4 cDNA合成及随机 PCR扩增
1 4 1 随机 PCR 引物设计 因为随机引物 PCR
不需要特异引物，选择引物时亦不能按已知 DNA 序
列进行设计合成，所以任何引物均可用 rPCR 方法
扩增出 rPCR 指纹图，关于引物的碱基数目，从理论
上讲，引物越短，造成与模板错配的机会越多，因而
显示的指纹图条带越多 ，依据这一原则选用长度为
10 bp的随机引物 140 条及 6 bp、9 bp的随机引物。
1 4 2 反转录反应 在 0 2 mL Microtube 管中配
制下列混合液，同时设空白对照，成分如下:由 1 3
提取的模板 RNA 8 μL，random 6 mers 1 μL，dNTP
Mixture(10 mmol /L each)1 μL，混匀，65℃，5 min，
4℃保存。在上述 Microtube 管内加入以下成分 5 ×
PrimeScriptTM Buffer 4 μL，RNase Inhibitor(40 U /
μL)0 5 μL，PrimeScriptTM RTase(for 2 step)0 5 μL，
RNase Free dH2O 5 μL。反转录程序为 30℃ 10 min，
42℃ 30 min，95℃ 5 min，4℃保存。
1 4 3 PCR 反应 在 0 2 mL Microtube 管中配制
下列混合液，同时设空白对照，成分如下:上述反转
录反应液 4 5 μL，10 × PCR Buffer Ⅱ 5 μL，dNTP
Mixture(10 mmol /L each)2 μL，随机引物 2 μL，
TaKaRa Ex TaqTM HS(5 U /μL)0 5 μL，RNase Free
dH2O 36 μL 共 50 μL。反应程序:94℃，5 min ;
94℃ 1 min，35℃ 2 min，72℃ 2 min，共 40 个循
环，最后于 72℃延伸 10 min。反应产物用 1%琼脂
糖凝胶电泳鉴定。
1 4 4 琼脂糖凝胶电泳 称取 2 0 g 琼脂糖，加入
200 mL 1 × TAE缓冲液，混匀后，用微波炉加热使琼
脂糖完全溶解，冷却至 50 － 60℃，然后加入 5%
Goldview，混匀后倒入电泳倒胶槽中，凝胶厚度在
3 － 5 mm。电泳时加入 1 × TAE缓冲液，用 6 × Load-
ing Buffer 稀释样品，每个样品点样 5 μL，同时加入
DNA Marker DL2000 为标准分子量对照。以 5 V /
cm用 100 V的恒压，电泳 30 － 40 min。用凝胶成像
系统观察结果并拍照保存。
1 5 随机 RT-PCR产物的克隆测序及序列分析
取 150 μL PCR 产物经琼脂糖电泳，切取目的
条带回收后，以适当比例与 pMD18-T 载体相连接，
转化感受态细菌 E. coli JM109，挑取经 PCR 和酶切
鉴定的阳性克隆，在 ABI377 型全自动测序仪上进
行序列测定。利用互联网上的 Blast 软件将所测序
列与 GenBank数据库进行比对，以确定其同源性。
1 6 序列分析结果的验证
依据所测序列结果设计合成特异性引物，对培
养病毒基因进行 PCR 扩增，以验证其序列的真实
性。引物序列如下:上游引物:5′-gtggtattacagcagcag-
gt-3′，下游引物:5′-ccaccatttcgacaactc -3′。扩增片段
大小 830 bp。在 0 2 mL Microtube 管中配制下列混
合液，同时设空白对照，成分如下:质粒提取液液1 μL，
10 × PCR Buffer Ⅱ 5 μL，dNTP Mixture(10 mmol /
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生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2010 年第 6 期
L each)2 μL，上下游引物各 1 μL，TaKaRa Ex TaqTM
HS(5 U/μL)0 5 μL，RNase Free dH2O 39 5 μL 共 50
μL。反应程序:95℃，5 min;94℃ 1 min，53℃，1 min，
72℃ 1 min，共 35个循环，最后于 72℃延伸5 min，4℃
保存。反应产物用 1%琼脂糖凝胶电泳鉴定。
2 结果
2 1 病毒基因组的随机 PCR扩增结果
50 mL的病毒尿囊液经上述方法处理后提取
RNA，以随机引物 N6 合成单链 cDNA，以随机引物
S1-S38 进行 PCR 扩增，其 PCR 产物在琼脂糖凝胶
上出现一条带约 1 2 kb左右，如图 1，作为阴性对照
的未感染鸡胚尿囊液则无扩增条带。
1 ZZ2004;2 Marker DL2000;3.对照
图 1 ZZ2004 病毒基因 随机 RT-PCR产物
2 2 随机 RT-PCR产物的克隆测序
将 1 2 kb的 PCR产物纯化后与 pMD18-T载体
连接，转化 E. coli JM109，挑取白色菌落，小提质粒
后经 PCR 鉴定及 EcoRⅠ酶切鉴定后，挑取阳性克
隆进行序列测定，所测序列如图 2 所示。
2 3 所测序列的同源性分析
在 GenBank数据库中进行检索，结果(表 1)发现
所测序列与鸡传染性支气管炎病毒(IBV)的不同毒
株具有高度的同源性，同源率达 82 0% － 96 0%，而
且未发现所获序列与鸡的基因有任何的同源性，表明
随机扩增的序列来源于培养的病毒而非鸡胚。
进一步的序列分析表明，所测序列包括了 3a 基
因、3b基因及 E基因 3个完整基因，3a基因与参考毒
株的同源性为 99% － 91%;3b 基因与参考毒株的同
源性为 96% － 81%，在 666 － 667 bp 和 673 － 675 bp
位置间分别缺失了 19 个碱基和 12 个碱基的核苷酸
片段;E基因与参考毒株的同源性为 97% －85%。
GACCGCTTGTCAAGCAAATTATGTTAATGTAAATAAAACCGTCATTA
CTACATTTGTAGAAGATGATGATTTTGATTTTGATGATGAGTTGTCG
AAATGGTGGAATGGCACTAAGCATGAGTTACCAGATTTTGACGACT
TCAATTATACAGTACCTATACTGAATATTAGCGGTGAAATTGATCGT
ATTCAAGGTGTTATACAGGGTCTTAATGACTCCATTATAGACCTTGA
AGAACTGTCAATAATCAAAACTTATATTAAATGGCCTTGGTATGTTT
GGCTTGCCATAGGCTTTGCCATTATTATTTTTATCCTTATCTTAGGATG
GGTGTTTTTCATGACAGGTTGTTGTGGTTGTTGTTGTGGATGCTTTGG
TATCATTCCTCTAATGAGTAAGTGTGGTAAGAAATCTTATTATTACA
CTACTTTTGATAATGATGTGGTAACTTAACAATACAGACCTAAAAA
GTCTGTTTAATGGTTCAAACTCCCGCATCTTTTGTAATACTATTAAT
TCTTCTTTGGTTTAAACTTGCTTTAAGTTGTTTTAGAGAGTGCGTTG
TAGCACTCCAACAACTAATACAAGTTCTGCTCCAAATTATTAATAA
TAATTTACGTTCTAGGATGCTCCTTTGGCACAGCCTAGACTAATGTT
AGATCTTGAGAAGATAATTGAAACTGGTGAAGTAGTAATACAACAAA
TCAGTTTCAATTTACAACATATATCAAGTGTTTTAAACACAGAAA
TATTTGACCCCTTTGAATTCTGTTATTACAGAGGAGGTAATTTTTG
GGAAATAGATTCAGCCGAAGAGGTTGACGATGAATATGTTGAATA
AGTCGCTAGAGGAGAATGGTAGTTTTCTAACAGCAGTTTATGTCTT
TTGTGGGTTTGTAGCACTCTACTTACTAGGTAGAGCGCTTCTAGCA
CTTGTACAAGCGGTTGATGCTTGTTGTTTATTTTGGTATACATGGGT
AGTAGTTCCAGGAGCTAAGGGTACAGCCTTTGTATACAAGCATACA
TACGGTAGAAAACTTAACAATCCGGAATTAGAACAAGTTATTGTTA
ACGAGTTCCCGAAGAACGGTTGGAATAATAAAAATCCTGCAAATT
TTCAAGATGTCGGACGGCACGGGAAATTGCACTCTTAGTACTCAA
CAAGCGGTC
注:带下划线的序列为随机引物序列及其反向互补的序列
图 2 测序结果
表1 随机RT-PCR克隆序列在GenBank 中同源性比较结果
序列长
度(bp)
同源病
毒株
GenBank
编号
同源性
(%)
对应
区段
1171 CK /CH /LGD /04III EF602447 1 94 4 1399-2596
CK /CH /LGD /04II EF602444 1 94 9 1399-2561
chicken /JS /YZ07 /2008 FJ807653 1 94 8 5615-6777
CK /CH /LSC /99I EF602450 1 94 6 1399-2561
SAIBK DQ288927 1 92 4 23388-24560
IBV M41 AY851295 85 6 23383-24551
IBV 120 FJ888351 85 2 23323-24491
IBV beaudette NC_001451 85 8 23377-24545
将 ZZ2004分离株的 3 个 ORF 与我国常用疫苗
毒株、分离毒株及国际上其他血清型的代表参考毒株
的基因的核苷酸序列进行遗传进化树的绘制与分析。
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2010年第 6期 姚四新等:鸡传染性支气管炎病毒 ZZ2004分离株 3a、3b及 E基因的序列测定与分析
结果表明分离株 ZZ2004 所测基因(图 3 －图 5)归属
不同的分支:与疫苗株 H120、4 /91 和国内分离株
SAIBK、CK/CH/LGD/04111 及标准株 M41、Beaudette
的亲缘关系较远，单独位于另一个独立的分支。
图 3 分离株 ZZ2004 3a基因与其它参考毒株
核苷酸序列的遗传进化树
图 4 分离株 ZZ2004 3b基因与其它参考毒株
核苷酸序列的遗传进化树
图 5 分离株 ZZ2004 E基因与其它参考毒株核
苷酸序列的遗传进化树
2 4 所测基因序列推导的氨基酸序列同源性分析
所测序列经 DNAStar 软件分析，共包含 3 个
ORF，其序列起始分别为 481 － 654、654 － 842、826 －
1 155，分别编码 3a、3b、E 蛋白，其在 GenBank 中的
同源性分别高达 98% － 66%、95% － 65%、94% －
81%。将 ZZ2004 分离株与我国常用疫苗毒株、分离
毒株及国际上其他血清型的代表参考毒株的基因的
氨基酸序列进行遗传进化树的绘制与分析，结果(图
6 －图 8)表明，分离株 ZZ2004 所测基因归属不同的
分支，与疫苗株 H120、4 /91 和国内分离株 SAIBK、
CK/CH/LGD/04111及标准株 M41、Beaudette 的亲缘
关系较远，单独位于另一个独立的分支。
图 6 分离株 ZZ2004 3a蛋白与其它参考毒株
氨基酸序列的遗传进化树
图 7 分离株 ZZ2004 3b蛋白与其它参考毒株
氨基酸序列的遗传进化树
图 8 分离株 ZZ2004 E蛋白与其它参考毒株
氨基酸序列的遗传进化树
2 5 测定序列特异性验证
依据序列测定结果合成一对特异性引物，跨越
长度为 830 bp，以该对引物对病毒尿囊液、接毒鸡肾
组织、肠道组织、粪便、病毒污染的饮水、空白对照分
别进行扩增，除阴性对照及空白对照外，均成功扩增
出符合预期大小的片段，说明获得序列是病毒本身
的序列，结果见图 9。
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图 9 ZZ2004 病毒基因的 PCR鉴定
3 讨论
目前，病毒的基因序列分析正成为病毒鉴定和
分类的重要内容之一。了解一株病毒的基因结构将
有助于对其进行鉴定、分类甚至分型，这对于那些用
传统方法鉴定存在困难或争议的病毒尤为重要。本
研究中的病毒就是一例。该病毒是从患有腹泻、呼
吸道症状及肾脏病变的肉鸡体内分离而来的 RNA
病毒，形态学、血清学、理化特性资料未能明确该病
毒是何种，因此测定病毒的基因序列可能有助于明
确病毒的分类。曾试图利用 IBV、IBDV 的特异性引
物对其进行扩增和测序，结果都不太理想，分析原因
可能是由于该毒株的基因变异所致，测序结果与设
计引物比对的结果证实了病毒变异的确存在。因此
有必要采用一种能够扩增未知序列的方法对该病毒
的基因进行扩增、克隆和分析。采用随机引物对未
知病毒基因进行扩增，不失为一种有效方法［2-4］，前
提条件是核酸必须很纯，不得混入宿主的染色体及
外来核酸，否则将可能导致非特异性条带的产生，有
效解决这一难题的方法是病毒及核酸的纯化。由
Reyes 和 Kim［5］于 1991 年建立的 SISPA(sequence
independent single primer amplification)技术，需要在
DNA模板钝末端连接一非对称引物，经过若干循环
的变性、退火和延伸后，模板的数量得到扩增，后经
克隆、测序、分析得到基因序列，也是一种很好的方
法，但由于复杂的操作环节，限制了其应用。Alland-
er、Zhang 等［1，6，7］采用改良的 SISPA 技术测定了未
知 DNA及 RNA病毒的序列，研究证实应用这一方
法对于不同类型和来源的病毒均有良好效果，所获
得的病毒全基因序列大小从 3 － 15 kb不等。
ZZ2004 毒株基因系统进化分析结果表明分离
株 ZZ2004 与 IBV 主要参考毒株的亲缘关系较远。
目前针对 IBV S1 基因、S2 基因及 N 基因的研究较
多［8-10］，多数认为 S1 基因是 IBV 变异的主要基因，
针对 3a基因、3b基因及 E基因的研究较少，其基因
的点突变、插入、缺失或 RNA 重组是否会产生新血
清型、亚型或变异株，是否是 IBV 血清分型的主要
原因还有待进一步研究。
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