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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2011 年第 10 期
新疆双峰驼天然单域抗体库的构建及初步鉴定
张清华 夏雪琴 克力比努尔·热合曼 李江伟
(新疆大学生命科学与技术学院 新疆生物资源基因工程重点实验室，乌鲁木齐 830046)
摘 要: 旨在构建新疆双峰驼天然单域抗体库，及从中快速筛选 VHH 抗体。采用两种不同的抗原(溶菌酶和 cAb-
HEWL23)用天然文库进行筛选，成功筛选到了相应的抗体，并以溶菌酶筛选的 VHH抗体(A3-1，A4-1 和 A10-1)进行表达和初
步的 ELISA检测。结果显示，A3-1 和 A10-1 具有结合溶菌酶的能力。该方法简单方便、省时省力，可以快速从天然单域抗体
库中筛选 VHH抗体。
关键词: 溶菌酶 噬菌体展示 单域抗体 VHH
Construction and Identification of a Naive Single-domain Recombinant
Antibodies Library Derived from Xinjiang Camelus bactrianus
Zhang Qinghua Xia Xueqin Kelibinuer Reheman Li Jiangwei
(Xinjiang Key Laboratory of Biological Resources and Genetic Engineering，
College of Life Science and Technology，Xinjiang University，Urumqi 830046)
Abstract: In order to construct a naive single-domain recombinant antibodies library derived from Xinjiang Camelus bactrianus，
and rapid screening of VHH antibodies from the library，we used two antigens (lysozyme and cAb-HEWL23)for panning in parallel and
detected binding specificity of VHH antibodies (A3-1，A4-1 and A10-1)by ELISA assay，which showed that A3-1 and A10-1 have
combined capacity with lysozyme． It is not only simple and convenient，but also time-saving and efficacious，which can rapidly isolate
VHH antibodies in naive single-domain recombinant library．
Key words: Lysozyme Phage display Single-domain antibody VHH
收稿日期:2011-03-31
基金项目:国家自然科学基金项目(31060132) ，新疆自治区科技厅科技支疆项目(201091251)
作者简介:张清华，男，硕士研究生，研究方向:基因工程抗体;E-mail:zqhy3k@ 163． com
通讯作者:李江伟，男，副教授，研究方向:肿瘤免疫学;E-mail:lijiangwei67@ gmail． com
噬菌体展示技术是将外源蛋白或多肽的 DNA序
列插入到噬菌体外壳蛋白结构基因的适当位置，使外
源蛋白随外壳蛋白的表达而表达，同时，外源蛋白随
噬菌体的重新组装而展示到噬菌体表面的生物技术。
利用噬菌体展示技术构建的抗体库为筛选抗体提供
了一个方便的平台。由于它的简单性和实用性，噬菌
体抗体库已经成功应用于抗体的基因改造，如筛选高
亲和力的抗体，人源化抗体和肿瘤靶向性的抗体。
早期构建的 scFv或 Fab抗体库，需要大量抗体
基因克隆于噬菌体或噬菌粒载体，所需库容量很大。
如 Biolnvent 构建 1. 5 × 1010的 n-CoDeRTM-Fab 抗体
库，Cambridge Antibody Technology和 Crucell构建的
scFv抗体库容量分别 ＞ 1011和 ＞ 1010［1］，如需构建天
然文库难度还会增加，而且此技术在分离具有可溶性
和功能的单域抗体很少成功。直到 1993 年，Hamers-
Casterman偶然发现，在骆驼的免疫系统中存在自然缺
失轻链的重链抗体(heavy-chain antibody，HCAb)［2］，使
得纯化高可溶性和高亲和力的单域抗体成为可能。另
外，在一些软骨鱼(如鲨鱼、鳐鱼等)中也发现了类似于
骆驼重链抗体的新抗原受体(new antigen receptor，
NAR)［3］。
骆驼的重链抗体，虽然缺失轻链，但是作为抗
体，其功能是完整的，这说明重链抗体的重链可变区
(VHH)可单独形成完整的抗原结合位点。与常规
抗体衍生而来的基因工程抗体相比，VHH 具有一些
独有的特性。除了容易制备和所需库容量小之外，
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2011 年第 10 期
如 Liu［5］构建的鲨鱼天然文库(107) ，重组的 VHH
抗体在功能和物理化学方面还具有一些优点:表达
率高，易纯化;VHH 区域的疏水性氨基酸被亲水性
氨基酸所代替，使得 VHH可溶性增加;VHH与人和
鼠的 VH相比具有长的 CDR3，其中的二硫键使得结
构更加稳定，CDR3 颈环结构的凸起能够识别一些
酶类特有的凹陷口袋结构［4］，并且与人类的 VH 片
段有较高的同源性［6］。
至今大部分的 VHH抗体是从免疫的单峰驼或美
洲驼中分离得到的［7 － 9］，但是这种制备过程也有许多
不足之处:免疫所需的抗原需要是可溶的，并且需要
确定抗原的抗原表位，这在许多免疫当中是不可行的
(如缺少抗原，抗原具有毒性或者不具有免疫原性) ;
动物免疫过程需要很长的时间;所构建的免疫抗体库
不能分离到针对机体自身的抗体。所以，有人构建了
美洲驼［10］和鲨鱼天然文库［5］，并且从中成功筛选到
了目的抗体。对于新疆双峰驼单域抗体库的构建至
今还未有报道，由于溶菌酶的 VHH抗体研究较为清
楚，并且本实验室已构建了新疆双峰驼溶菌酶免疫抗
体库，所以构建新疆双峰驼天然单域抗体库，以溶菌
酶为抗原进行检测，为制备所需 VHHs提供平台。从
本试验可以看出，构建天然单域抗体库，相对于免疫
单域抗体库、Fab、scFv 抗体库和杂交瘤细胞技术，不
仅方法简单、方便，而且省时、省力。
1 材料与方法
1. 1 材料
1. 1. 1 菌种与质粒 pCANTAB 5E噬菌粒载体和大
肠杆菌 TG1由中国科学院生物物理所阎锡韵教授惠
赠，其中 pCANTAB 5E中的 NotⅠ酶切位点被删除，换
成 SfiⅠ异裂酶识别序列 GGCCTCGGGGGCC，M13KO7
辅助噬菌体购自 Amersham Biosciences 公司，大肠杆
菌 BL21(DE3) ，原核表达载体 pET-30a为本实验室保
存。
1. 1. 2 酶和试剂 淋巴细胞分离液、Trizol 试剂、
M-MLV反转录酶、Oligo(dt)15、购自 Invitrogen 公司，
Ex Taq 酶，T4 DNA 连接酶及 SfiⅠ限制性内切酶为
TaKaRa公司产品。
1. 1. 3 PCR引物 参考文献中美洲驼和单峰驼两
种亚型 IgG2a 和 IgG3 的铰链特异氨基酸序列［11］，
设计双峰驼 HCAb可变区 VHH的扩增引物，以骆驼
HCAb可变区 VHH 的前导肽保守序列为共同上游
引物并引入 SfiⅠ酶切位点，序列如下 VHH-P1:5-
CATGCCATGACTCGCGGCCCAGCCGGCCGTCCTGG-
CTGCTCTTCTACAAGG-3;而两种亚型 HCAb 特异
的铰链区序列作为下游引物并引入 SfiⅠ 异裂酶的
另一个酶切位点，序列分别为 VHH-P2-IgG2a:5-
CATGCCATGACTCGCGGCCTCGGGGGCCCGTGCAT-
TCTGGTTCAGGTTTTGGTTGTGG-3;VHH-P2-IgG2c:
5-CATGCCATGACTCGCGGCCTCGGGGGCCACTTG-
GAGCTGGGGTCTTCGCTGTGGTGCGC-3;VHH-P2-
IgG3:5-CATGCCATGACTCGCGGCCTCGGGGGCCC-
TTGCATACTTCATTCGTTCC-3。
1. 1. 4 新疆双峰驼外周血的采集 新疆双峰驼外
周抗凝血采集于新疆天鹰实业有限公司。
1. 2 方法
1. 2. 1 新疆双峰驼外周血淋巴细胞的分离及总
RNA的提取 在新疆天鹰实业有限公司，取得三峰
成年双峰驼外周抗凝血各 500 mL，用淋巴细胞分离
液进行梯度离心，分离外周血淋巴细胞。PBS 洗涤
分离后镜检计数为 109，按 108细胞加入 1 mL Trizol
的比例，提取新疆双峰驼外周血淋巴细胞总 RNA。
1. 2. 2 VHH 基因的扩增 以总 RNA 为模板，Oligo
(dT)18为引物，反转录合成 cDNA第一链，再以此模板，
分别用两套引物进行 PCR 扩增两种亚型重链抗体
VHH基因片段。反应程序:95℃预变性 5 min;95℃ 35
s，63℃ 35 s，72℃ 35 s，共 32个循环;72℃延伸 10 min。
反应产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定后，回收目的片段。
1. 2. 3 噬菌体单域抗体库的构建 分别对 VHH基因
和 pCANTAB 5E 噬菌粒载体，进行 SfiⅠ酶切后，将
VHH基因与 pCANTAB 5E载体在 T4 DNA连接酶的作
用下进行连接，连接产物转化新鲜制备的大肠杆菌
TG1感受态细胞，取出 20 μL涂布于 2 × YT/Amp/Glu
琼脂板上，30℃过夜培养。次日，计算菌落形成单位
(CFU)，即为噬菌体抗体库的滴度，并从平板上随机挑
选 12个单菌落，进行 PCR鉴定，以确定抗体库的重组
率。剩余菌液加入适量的 2 × YT/Amp 液体培养基与
M13K07，37℃过夜培养。次日，用 20%的 PEG8000 /
NaCl从菌液上清中分离噬菌体，并悬浮于 PBS中。
1. 2. 4 噬菌体单域抗体库的富集筛选 富集筛选采
用梯度方法进行，具体如下:将筛选的抗原用
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2011 年第 10 期 张清华等:新疆双峰驼天然单域抗体库的构建及初步鉴定
0. 05 mol /L pH9. 6碳酸盐缓冲液做一定稀释后，包被
于 96孔板，其抗原浓度为1 000 －50 μg /mL，每孔100
μL，4℃过夜。次日弃去板中未吸附的抗原，PBS洗涤
3次，用 3% － 5% BSA/PBS 或 4% － 5%脱脂奶粉 /
PBS，37℃封闭 1 h，弃封闭液，PBS洗涤 3次。在每孔
加入 1013噬菌体库，37℃孵育 2 h，弃孔中未结合噬菌
体，用 TBS /Tween20 pH7. 5 洗涤每孔，充分洗去非特
异性吸附噬菌体。每孔加入 50 μL pH2. 2 的甘氨酸
―盐酸洗脱缓冲液，室温孵育 10 min，期间用移液器
反复吹打几次，但注意勿吹出过多气泡，然后加入适
量 2 mol /L Tris，使溶液的 pH在 7 左右，以中和洗脱
下来的噬菌体溶液。立即加入 10 mL 新鲜配制的
OD600 =0. 5左右的 TG1 细菌，室温孵育 15 － 30 min，
然后取 60 －70 μL培养液涂布于 2 × YT /Amp /Glu平
板，以测定洗脱噬菌体的滴度，剩余菌液，3 500 r /
min，离心 5 min，收集菌体，重悬于 100 mL 2 × YT /
Amp培养基，37℃继续培养使 OD600 = 0. 5，加入 200
μL M13K07辅助噬菌体，轻轻混匀后，37℃静止放置 15
－20 min，37℃培养过夜。如此反复筛选 3次。
1. 2. 5 VHH抗体的诱导表达及 ELISA 鉴定 用引
物 PCR扩增VHH基因(上游引物VHH-P1:5-CGCG-
GATCCGTCCTGGCTGCTCTTCTAC-3，下游引物 VHH-
P2-IgG2a:5-CCGCTCGAGCGTGCATTCTGGTTCAGG-
TTTTGGTTGTTG-3和 VHH-P2-IgG3:5-CCGCTCGA-
GCTTGCATACTTCATTCGTTTC-3) ，扩增产物回收后
BamH I /Xho I酶切，然后与经过相同酶切的 pET-30a
载体 16℃过夜连接，转化大肠杆菌 BL21(DE3)。挑取
阳性克隆，用 2 mmol /L的 IPTG 37℃诱导。然后，收集
菌体超声破碎，8 000 r /min离心10 min收集上清，抗原
包被量为 10 μg /mL，进行 ELISA 鉴定。
2 结果
2. 1 VHH基因的扩增
经 1%琼脂糖凝胶电泳检测，PCR 扩增 IgG2a
和 IgG3 两个亚型的 VHH 基因片段约为 500 bp(图
1) ，而 IgG2c无目的条带。
M． DNA 标准分子量 DL5000;1. IgG2a VHH 基因
扩增片段;2. IgG3 VHH基因扩增片段
图 1 VHH基因的扩增
2. 2 噬菌体单域抗体库的构建及鉴定
将纯化的 IgG2a 和 IgG3 VHH 基因进行酶切，
并以 1∶ 1 的比例与 pET-30a载体混合连接、转化，以
构建噬菌体单域抗体库。对噬菌体单域抗体库进行
菌液 PCR，结果显示有 IgG2a 和 IgG3 的插入(图 2-
A) ，随机挑取文库中的 12 个单克隆进行 PCR鉴定，
结果 9 个单克隆为阳性(图 2-B) ，说明天然抗体库
重组率大约为 75%。并计数噬菌体抗体库滴度为
6. 5 × 108 CFU /mL。
A:M． DNA标准分子量 DL1000;1，3． IgG2a VHH基因扩增片段;2，4． IgG3 VHH基因扩增片段
B:M． DNA标准分子量 DL5000;1 － 12．随机单菌落;13．阴性对照
图 2 天然抗体库的 PCR鉴定
2. 3 噬菌体单域抗体库的筛选富集情况
经过 3 轮梯度筛选富集后，随机挑选 lysozyme
和 cAb-HEWL23 抗原的 20 个单菌落，进行 PCR 验
证。结果显示，天然文库的筛选得到的阳性率各为
55%和 60%。筛选结果见表 1。
2. 4 VHH抗体的表达及 ELISA鉴定
从第 3 轮筛选得到的单克隆中，发现了 3 株为
阳性结果。为了证明所获得的 VHH抗体分泌表达
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生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2011 年第 10 期
表 1 三轮筛选的富集情况
筛选轮数
(抗原浓度)
抗原
噬菌体的加
入量(pfu)
噬菌体的输
出量(pfu)
第 1 轮
(1 000 μg/mL)
溶菌酶 / lysozyme 1013 4. 3 × 107
cAb-HEWL23 1013 3. 7 × 107
第 2 轮
(200 μg /mL)
溶菌酶 1013 1. 5 × 104
cAb-HEWL23 1013 5. 6 × 105
第 3 轮
(50 μg /mL)
溶菌酶 106 1. 3 × 103
cAb-HEWL23 106 4. 9 × 103
后对溶菌酶的特异性结合，进一步将 VHH 抗体基
因克隆到大肠杆菌 BL21(DE3)中分泌表达，通过对
分泌到细菌上清中的蛋白进行 SDS-PAGE，并以
ELISA方法对其进行检测，结果(图 3)表明，3 株
VHH抗体在大肠杆菌 BL21(DE3)均能够分泌表
达。通过 ELISA鉴定抗体的功能活性，结果(图 4)
表明有两株抗体(A3-1 和 A10-1)与溶菌酶有结合，
而 A4-1 与溶菌酶结合较弱。
1，4，7． A3-1，A4-1，A10-1 诱导前全菌体;2，5，8． A3-1，
A4-1，A10-1 诱导后菌体超声破碎上清;3，6，9． A3-1，A4-
1，A10-1 诱导后菌体超声破碎沉淀;M． 蛋白标准分子
量:14. 3 － 97. 2 kD
图 3 VHH抗体的 SDS-PAGE凝胶电泳
3 讨论
噬菌体抗体表面展示文库技术是近年来发展较
快制备单克隆抗体的有效手段，尤其可直接克隆抗
cAb-HEWL23 为溶菌酶 VHH抗体(由本试验纯化)
图 4 ELISA检测 VHH抗体对溶菌酶的结合特异性
体可变区基因，以利于进一步构建具有广阔应用前
景的各种基因工程抗体。利用这种技术从 HCAbs
得到的 VHHs和 IgNAR单域抗体与早期构建的 Fab
或 scFv抗体相比，可以识别其所不能识别的抗原表
位，如一些酶的活性中心［4，5，8］。
噬菌体抗体库能否筛选到目的抗体与抗体库的
多样性有很大关系，所以构建噬菌体抗体库取决于
常规抗体和 VHH重组抗体 CDRs 的高可变区［8，11］。
在构建的免疫噬菌体抗体库中，随机高突变可以弥
补体细胞的高突变率低的不足。虽然动物体内的体
细胞高突变产生的抗体，针对不同的动物，可以使亲
和力增加 10 － 300 倍，但是构建各种抗原的免疫抗
体库是相当昂贵和费时的。本实验室在构建免疫抗
体库时，所需抗原量不但很大，而且免疫构建时间长
达 5 个月。有文献报道有人用 107个美洲驼淋巴细
胞［12］构建的天然抗体库成功筛选到了目的抗体，以
此证明在动物的外周血中，就包含有高亲和力的抗
体。本研究用 109个新疆双峰驼外周血淋巴细胞构
建天然文库，并成功的得到了溶菌酶的 VHH 抗体
(A3-1 和 A10-1)。
传统的 Fab和 scFv抗体库的构建，操作过程复
杂，所需库容量较大［1］，如果构建天然抗体库，难度
还会增加，而且 Fab和 scFv抗体与 VHH抗体相比，
在结构和物理化学特点上，有许多不足之处。至今
已成功筛选到了许多 VHH 抗体，如病毒和毒素的
抗体［13］、肿瘤坏死因子的抗体［14］和内毒素的抗
体［15］等。因此构建双峰驼天然单域抗体库来筛选
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有用的 VHH 具有重要的应用价值，并且不需要免
疫动物就可以为筛选和制备所需的 VHH 提供技术
平台。
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(责任编辑 马鑫)
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