全 文 ：生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2009年第 3期·研究报告·
收稿日期：2008-09-23
基金项目：国家自然科学基金（30771924）
作者简介：李毅（1983-），硕士在读，研究方向：乙肝的临床病毒学
通讯作者：汤华，研究员，Tel：023-68486820，E-mail：tanghua86162003@yahoo.com.cn
GAPDH 单体蛋白具有 330 个氨基酸， 其相对
分子质量约 37 kD， 广泛存在于众多生物体中，并
且具有高度保守序列 [1]。 由于自身的功能多样性，
有报道提出已形成了两种研究机制的重要模型：一
种是研究酶作用机制以及氨基酸序列与蛋白质结
构的相互关系的模型。 在各组织细胞浆的 GAPDH
以四聚体的形式催化 3-磷酸甘油醛成为 1，3-二磷
酸甘油， 是糖酵解反应的关键酶 ； 并且研究表明
GAPDH 有膜融合与膜转运活性 [2]，微管蛋白成束活
性 [3]，以及磷酸化活性 [4]；另一种是研究细胞组成和
人类 3-磷酸甘油醛脱氢酶的原核表达、纯化和鉴定
李毅 万涛 杨琴 蔡雪飞 张文露 汤华
（重庆医科大学感染性疾病分子生物学教育部重点实验室，重庆 400016）
摘 要： 为了研究 3-磷酸甘油醛脱氧酶（GAPDH）化生物学功能，以 pcDNA3.1-GAPDH 质粒为模板，PCR 方法扩
增 GAPDH 基因，经 BamHI 和 SalI 双酶切后插入相同酶切的 pET32a（+）载体，构建 His-GAPDH 融合蛋白表达质粒
pET32a（+）-GAPDH；转化 JM109感受态细胞，并进行阳性克隆筛选，扩增目的质粒；转化大肠杆菌 BL21菌株，经 IPTG
诱导产生融合蛋白，亲和层析柱纯化后，用 SDS-PAGE和Western blotting检测 GAPDH 蛋白表达情况。结果表明，构建的
人 GAPDH基因表达载体经序列测定证实，与 GenBank数据完全一致；双酶切鉴定证实，克隆基因正确插入 pET32a（+）载
体；表达质粒 pET32a（+）-GAPDH 在大肠杆菌 BL21中成功地诱导表达了可溶性 His-GAPDH 融合蛋白，纯化后 SDS-
PAGE和Western blotting检测证实融合蛋白表达成功。人 GAPDH 原核表达载体的成功构建，及 6His-GAPDH 融合蛋白
的正确表达，为进一步深入研究 GAPDH 的生物学功能奠定了基础。
关键词： 三磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH） 原核表达 SDS-PAGE 免疫印迹
Prokaryotic Expression，Purification and Identification of Human
Glyceraldehyde 3-phosphate Dehydrogenase
Li Yi Wan Tao Yang Qin Cai Xuefei Zhang Wenlu Tang Hua
（Key Laboratory of Molecular Infectious Diseases，Ministry of Education，Chongqing Medical University，Chongqing 400016）
Abstract： The prokaryotic expression vector pET32a（+）-GAPDH and the expression of human glyceraldehyde 3-
phosphate dehydrogenase（GAPDH）in E.coli were investigated. GAPDH gene was amplified by PCR from pcDNA3.1-
GAPDH plasmid and inserted into the plasmid pET32a（+）followed by digestion with BamHI and SalI. The recombinant
plasmid pET32a（+）-GAPDH was transformed into E.coli JM109 and selected with ampicillin. The positive clones
containing the recombinant plasmid pET32a（+）-GAPDH were verified. His-GAPDH fusion protein was expressed in E.
coli BL2l （ED3） by IPTG induction，and was identified by SDS-PAGE and Western bloting. Results showed that the
PCR product of human glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase（GAPDH） was identical to the sequence in GenBank
and was accurately inserted into the pET32a（+）. SDS-PAGE and Western blotting indicated that the dissoluble fusion
protein successfully expressed in E.coli BL2l（ED3）. Therefore，a prokaryotic vector for human GAPDH gene has been
successfully constructed and 6His-GAPDH has been correctly expressed，the stucly of which may facilitate subsequent
research of its biological functions.
Key words： Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase（GAPDH） Prokaryotic expression SDS-PAGE Immunoblot
2009年第 3期
遗传信息表达的基因分析模型。存在于细胞膜和细
胞核的 GAPDH 具有参与调节 mRNA 形成 ，tRNA
输出 [5]，DNA 复制，DAN 修复 [6]以及参与细胞凋亡 [7]，
维持端粒结构 [8]等多种功能。 为辅助 GAPDH 的生
物学活性以及作用机制的进一步研究 ， 本试验用
PCR 法扩增 GAPDH 基因，构建了 His-GAPDH 的原
核重组质粒 ，在 BL21（DE3）菌中进行蛋白诱导表
达，并对表达产物进行了亲和层析纯化和鉴定。
1 材料和方法
1.1 材料
原核表达载体 pET32a（+）购自 Novagen 公司 ；
HepG2 细胞、 宿主菌 E. coli JM109 和 BL21（DE3）、
PCR 模 板 质 粒 pcDNA3.1-GAPDH 为 本 室 保 存 ；
SalI、BamHI 限制性内切酶购自 NEB 公司 ；T4 DNA
连接酶购自 Promega 公司 ； 高保真 Taq 酶购自
Takara 公司 ； 质粒提取试剂盒购自 Omega 公司 ；
PCR 产物纯化试剂盒购自 Biofux 公司；所用引物由
上海生工生物工程公司合成；固化 Ni2+层析树脂购
自 Qiagen 公司；抗 His 蛋白抗体购自 Qiagen 公司；
GAPDH-HRP 单克隆抗体购自康成生物公司； 硝酸
纤维膜购自 Millpore 公司； 化学发光试剂购 Pierce
公司 ；蛋白预染 Marker 购自 Fermentas 公司 ；其余
试剂均为国产分析纯。
1.2 方法
1.2.1 His-GAPDH 融合蛋白表达载体 pET32a（+）-
GAPDH 的构建 根据 GenBank 中 GAPDH 基因
ORF 区碱基序列设计引物 （下划线部分为 BamHI，
SalI 的酶切位点），正义：5′-TCTGGATCCTGGGGAA
GGTGAAGGTC-3′，反义：5′- ATATGTCGACGAGGCC
ATGTGGGCCAT-3′。以 pcDNA3.1-GAPDH 为模板用
高保真 Taq 酶 PCR 扩增 GAPDH 基因， 反应条件：
94℃预变性 5 min，94℃ 1 min，58℃ 1 min，72℃ 2 min，
共 35 个循环。 PCR 产物进行琼脂糖凝胶电泳鉴定。
PCR 产物纯化后同表达载体 pET32a（+）用 BamHI，
SalI 酶切。 酶切产物纯化后于 16℃过夜链接，转化
入 E. coli JM109 菌、挑克隆、提取质粒。酶切鉴定大
小正确后测序（ABI 公司 3100 型）。
1.2.2 His-GAPDH 融合蛋白以及 pET32a（+）空质
粒对照蛋白的表达纯化 分别将工程菌菌种以及
BL21-pET32a（+）菌种接种于 2 ml 含 20 μl 100 mg/
ml 氨苄青霉素的 LB 液体培养基（LBA 培养基）中，
37 ℃培养 4~6 h；按 1∶20 比例接种于 10 ml LBA 培
养基中，37 ℃培养 2~3 h；将 10 ml 菌液接种于 250
ml LBA 培养基中 ，37℃培养 2~3 h （此时菌液的
OD600nm 在 0.4~0.6 之间）； 加入异丙基-β-D-硫代半
乳糖苷 （IPTG） 至终浓度 0.5 mmol/ L，30℃诱导过
夜。离心收集菌体，PBS 洗涤 1 次，菌体重新悬浮于
20 ml Bingding Buffer（10 mM 咪唑，0.05% Tween20，
pH8.0）中，加入 1 mol/ml 的蛋白酶抑制剂 PSMF 20
μl，冰浴超声波破菌，4℃离心收集上清。 上清装入
已填装好的 Ni2+亲和树脂柱中，流速调整为 10 BV/
h， 然后用 100 倍于填柱树脂体积的 Washing buffer
（20 mM 咪唑，0.05% Tween20，pH8.0）洗涤柱子，再
用 10 ml Elution buffer （250 mM 咪唑，0.05% Tween
20，pH8.0）洗脱结合的蛋白 ，每份 1 ml 分步收集 。
通过 15％SDS-PAGE 电泳，考马斯亮蓝染色来分析
聚组氨酸标签蛋白的分布。
1.2.3 His-GAPDH 融合蛋白的鉴定 按照 Wester-
n blot 方法以及 His-Western blot kit 和抗 GAPDH 蛋
白抗体试剂说明书进行。 蛋白经 12％SDS-PAGE 分
离后电转到硝酸纤维膜上， 室温下用含 5%脱脂奶
粉的 PBS（pH7.4）中封闭 1 h 后于摇床上用 PBS 漂
洗 3 次，10 min/次。 然后用抗 His 蛋白抗体孵育结
合， 再根据抗体试剂说明书配置相应的显色液，于
硝酸纤维膜上显示结果； 或者用抗 GAPDH 蛋白抗
体孵育结合后用化学发光法于 X 光片上显示结果。
2 结果
2.1 pET32a（+）-GAPDH 的构建及鉴定
以 pcDNA3.1-GAPDH 为模板 ， 经 PCR 扩增出
全长 GAPDH，长约 1 kb，与预期值相符。 经 BamHI，
SalI 双酶切 pET32a（+）和 PCR 产物（图 1A ）。 定向
链接后转化 BL21 菌，经酶切鉴定，筛选出含目的基
因片段的阳性克隆（图 1B）。 序列分析表明插入片
段方向和序列结果与 GenBank 数据完全一致（结果
未显示）。
2.2 His-GAPDH 融合蛋白高表达菌株以及 pET-
32a（+）质粒对照菌株的筛选
随机选取 4 种菌的阳性克隆， 经 IPTG 诱导后
均有不同程度的诱导蛋白表达。诱导空质粒对照蛋
白分子质量大小基本在 21 kD 左右 （图 2B），诱导
李毅等：人类 3-磷酸甘油醛脱氢酶的原核表达、纯化和鉴定 103
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2009年第 3期
的融合蛋白分子质量大小在 58 kD 左右 （GAPDH
单体分子质量约 37 kD，加上标签蛋白共约 58 kD）
（图 2A），与预期一致。图示可见各株克隆菌表达量
均较高，任挑一株菌来大量表达目的蛋白。
2.3 原核表达重组质粒蛋白和空载体蛋白的纯化
按照材料与方法中介绍蛋白的表达纯化方法，
根据初筛结果，选择相应的 BL21（DE3）细菌株进行
大量培养来表达目的及对照蛋白 。 分管收集得到
Ni2+亲和树脂柱纯化后的重组质粒蛋白 （图 3A）和
对照蛋白（图 3B）。
2.4 His-GAPDH 融合蛋白 Western blotting 鉴定
由于 pET32a（+）在多克隆位点上下游均带有
his-tag 标签蛋白编码序列 ， 目的蛋白可与对应的
his-tag 抗体结合，因此采用抗 his-tag 单克隆抗体进
行检测，显色后在大约 58 kD 位置有清晰的目的条
带（图 4A-2）。而空载体表达的 TRX 蛋白也带有 his
标签，因此在其对应的大约 21 kD 处也出现了清晰
条带（图 4A-1）。 再用抗 GAPDH 的单克隆抗体进行
检测， 运用化学发光试剂在 X 光片上曝光后同样
大约在 58 kD 位置可见目的蛋白（图 4B-1，2），但空
载体表达的蛋白则无显示（图 4B-3，4）。
3 讨论
GAPDH 作为一个多功能蛋白， 在机体的生理
和病理状态下的作用越来越引起有关学者的关注。
并且核酸与蛋白质之间的特异性结合是很多生物
学过程的基础 [9，10]，为进一步研究 GAPDH 与 DNA
修复、RNA 输出等作用机制，本实验进行了 GAPDH
的体外表达 ， 且选用含有 His-6 的蛋白标签的
A M.λ-EcoT14 I digest DNA Marker；1.原核表达载体 PET32a
(+ ) 用 BamHI,SalI 限制性内切酶双酶切结果 ；2.PCR 扩增
GAPDH 产物
B 1.PET32a (+)-GAPDH 重组质粒用 BamHI, SalI 限制性内切
酶双酶切结果
图 1 PET32a(+)-GAPDH 重组质粒的构建结果
A His-GAPDH 融合蛋白在 BL21 表达菌中的诱导与表达结果
（1~4.体外诱导 1~4 号克隆菌总蛋白 ；5.未诱导 1 号克隆菌总蛋
白；M.蛋白 Marker）
B 载体质粒在 BL21 表达菌中的诱导与表达 （M.蛋白 Marker；1~
5.体外诱导 1~5 号克隆菌总蛋白；6.未诱导 1 号克隆菌总蛋白 ）
图 2 His-GAPDH 融合蛋白在 BL21 表达菌中的
诱导与表达结果
A 诱导克隆 pET32a (+)-GAPDH 菌可溶性总蛋白用 Ni+亲和
层析柱纯化后结果 （M.蛋白 Marker；1.总蛋白与 Ni+亲和树脂
结合后剩余的蛋白 ；2~9:洗脱结合于 Ni+亲和层析柱并分管
收集的蛋白）
B 诱导 pET32a(+)克隆菌可溶性总蛋白用 Ni+亲和层析柱纯
化后结果 （1~5:洗脱结合于 Ni+亲和层析柱并分管收集的蛋
白；M.蛋白 Marker）
图 3 Ni2+亲和树脂柱纯化后结果
A 用抗 his-tag 单克隆抗体进行 Western blotting 鉴定结果
（1. 用 Ni+亲和层析柱纯化的空载体蛋白 ；2.Ni+亲和层析柱
纯化获得的 His-GAPDH 融合蛋白；M.蛋白 Marker）
B 用抗 GAPDH 单克隆抗体进行 Western blotting 鉴定结果
（M. 蛋白 Marker；1,2.Ni +亲和层析柱纯化获得 His-GAPDH
融合蛋白；3,4.用 Ni+亲和层析柱纯化的空载体蛋白 ）
图 4 Western blotting 结果
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2009年第 3期
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
（上接第 101页）
7 魏丽丽，李成华，袁成福，等 .西安交通大学学报（医学版），
2007，28(2)：130~133.
8 潘巍巍，赖国旗，等.中国现代医学杂志，2006，16(21)：105~108.
pET32a（+）为载体质粒。 重组蛋白可以通过暴露的
标签结合固化的 Ni+树脂， 用适当缓冲液洗除去未
结合蛋白包括大肠杆菌的 GAPDH， 再用可溶的竞
争性螯合剂洗脱回收 His-GAPDH，从而得到较纯的
人源性的 GAPDH。SDS-PAGE 电泳后考马斯亮蓝染
色结果显示存在少量杂蛋白，主要由于大肠杆菌中
存在相似 His-6 的蛋白，也能够部分结合 Ni+树脂。
但经冻融后的蛋白用抗 His 标签的抗体进行 Western
blotting 检测却没有杂带的出现， 说明本试验表达
的目的蛋白具有较好的稳定性。 而且 His-6 的蛋白
标签总分子质量仅约 1 kD，对表达的 GAPDH 蛋白
空间构象结构影响较小，从而确保了表达目的蛋白
的可靠性 。 用抗 GAPDH 的抗体进行 Western blot-
ting 显示 ，提取的目的蛋白不仅表达量高 ，而且具
有很好的抗原性， 可用于 GAPDH 作用机制的进一
步研究。
试验成功地构建了 pET32a（+）-GAPDH 原核表
达重组质粒，在体外得以表达和纯化，并且 Western
blotting 方法验证了靶蛋白 GAPDH 有较高的表达
量以及较好的抗原性， 为今后 GAPDH 的功能研究
提供了原料。
参考文献
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