全 文 ：研究报告
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2010年第 9期
纳米金标记基因芯片技术的优化
郑志伟 1 常弘 1 党华 2 张国萍 1 肖白玉1 杨登亮1 钟惟德 3
( 1中山大学生命科学学院,广州 510275; 2中山大学附属第一医院黄埔院区,广州 510700; 3广州市第一人民医院,广州 510180)
摘 要: 为了建立稳定的纳米金标记基因芯片技术, 对点样液,预杂交,纳米金浓度, 银染时间等进行了优化, 并研究了
该芯片方法的灵敏度。结果表明,使用 50% DM SO作为点样液效果最好, 预杂交会导致杂交信号降低 70% ,银染时间控制在
15 m in时候显色清晰且背景较低。该检测方法的灵敏度可达到 80 fm o l/L,可望在芯片检测领域得到更多的应用。
关键词: 纳米金 生物素 链酶亲和素 寡核苷酸 银染显色
Optim ization of NanogoldlabeledM icroarray
Zheng Zhiw ei
1
ChangHong
1
DangHua
2
Zhang Guop ing
1
X iao Baiyu
1
YangDengliang
1 ZhongW e ide 3
(
1
L ife and Science School, Sun Yatsen University, Guangzhou 510275; 2Huangpu A rea of Affiliated FirstH osp ital,
Sun Yatsen University, Guangzhou 510700; 3F irstAff iliatedH osp ital of Guangzhou M ed ical College, Guangzhou 510180)
Abstrac:t To establish m ore stabilized nanogo ldlabe led m icroarray techno logy, w e optim ized the spotting bu ffer, the concentra tion
o f nanogo ld and the tim e of silver enhancem ent. M eanwh ile, w e studied the effect o f prehybr idiza tion on hyb rid ization signa,l as we ll as
the detection lim it o f the nanogo ldlabe led m icroarray. The resu lts show ed that the hybr id iza tion perform ed sa tisfactory spec ificity. A
m ong the three k inds of spotting buffer, 50% DM SO w as the best. P rehybrid ization led to 70% loss of hybr id ization signa.l The tim e of
silver enhancem ent w e chose w as 15 m inutes, a tw hich the ta rget signal was clear, wh ile the background was low. The detection lim it of
nanogo ldlabe led m icroarray reach to 80 fmo l/L, which w as hopeful fo r va riety of applications in the fie ld o f detection.
Key words: Nanogo ld B iotin Streptav idin O ligonuc leo tide S ilver enhancem ent
收稿日期: 20100127
基金项目:国家自然科学基金项目 ( 30872960) ,国家高技术研究发展计划项目 ( 863!计划 ) ( 2006AA02A245, 2007AA022001 ), 广州市卫生局
重点项目 ( 2007Zd i05)
作者简介:郑志伟,男,在读硕士,研究方向:生物芯片与临床诊断; Em ai:l zheew y@ yahoo. cn
通讯作者:常弘,教授, Em ai:l Changh@ m ai.l sysu. edu. cn
DNA检测技术已经在疾病诊断、预防以及其他
应用中引起越来越多的关注。由于高通量等显著特
性, DNA芯片技术尤其受到研究人员的青睐, 主要
分为寡核苷酸芯片 [ 1]和 cDNA芯片 [ 2] , 其基本原理
是应用已知核苷酸序列作为探针与标记上信号分子
的靶序列之间特异性互补结合,随后通过信号分子
进行定性或者定量反应。传统的基因芯片技术主要
采用荧光素或者同位素等信号标记系统, 但是均存
在着检测仪器昂贵,或者放射性污染等问题,大大限
制了 DNA芯片的应用。另外一些方法,如辣根过氧
化物酶和碱性磷酸酶比色法的灵敏度则相对较
低 [ 3]。近些年来, 一种新型的标记系统开始引起越
来越多人的关注,纳米金作为信号标记分子,利用其
与银反应可将信号放大 106的优势, 形成肉眼可见
的杂交信号。该方法灵敏度较传统的荧光素标记方
法高两个数量级 [ 4 ] , 同时也不需要特殊仪器, 普通
扫描仪即可完成图像读取, 可望成为新一代生物芯
片的检测方法。目前国内各研究机构以及科研单位
主要采用巯基修饰靶序列,随后与纳米金相结合,并
进行检测的方法 [ 5, 6] , 且很少有对该技术平台进行
优化的文献报道。
本试验基于生物素标记的靶序列与芯片上固定
的探针发生杂交,通过生物素链酶亲和素的亲和作
用, 使靶序列结合纳米金,随后通过纳米金催化的银
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染放大效应产生高灵敏的识别信号。本研究旨在通
过优化点样液、预杂交、纳米金浓度、银染时间及其
灵敏度等条件,从而使纳米金标基因芯片方法得到
更广泛的应用。
1 材料与方法
11 材料和试剂
3段寡核苷酸序列由 Inv itrogen公司合成。探
针序列 ( 30mer): 5∀NH2TTTTTTCAGCATGTGCTC
CTTGATTCTATG3∀, 靶序列 ( 30 mer): 5∀B iotinCA
TAGAATCAAGGAGCACATGCTGAAAAAA3∀, 阴性
对照 ( 25m er) : 5∀NH2TATCAACAGGACCGGATA
TTGGAAGACTGA3∀。 3段寡核苷酸序列均溶于超
纯水 ( pH70- 80)。
直径 10 nm的链酶亲和素–纳米金 ( streptav i
dinnanogo ld, S9059)购自 Sigma公司, 银染试剂 sil
ver enhancerA和 silver enhancer B以及硫代硫酸钠
均购自 S igma公司。 S ily lated S lides为博奥公司醛
基化芯片; 其他试剂 SDS, NaC,l DM SO等均为国产
分析纯。
12 方法
121 点样液的选取以及探针的固定 分别使用
50% DMSO, 3 # SSC,以及碳酸盐 ( 05 mol /L N a2CO3 /
N aHCO3, pH9 )缓冲液将探针稀释到 50 mo l/L并
点在芯片上, 随后通过水合, 紫外交联, 37∃ 过夜孵
育以固定探针。在进行杂交之前需要在 02% SDS
中清洗 10m in以除去未结合上的探针,随后超纯水
清洗甩干即可进行杂交。
122 预杂交 将点好探针的芯片分别用 005%
Tween,脱脂牛奶 ( 005 mo l/L PBS) , 1% BSA, 2%
BSA, 3% BSA 封闭 30 m in, 之后使用 1 # PBST
( 10mmo l /L PBS, 005% Tween)清洗 5m in,超纯水
清洗 5m in,此时芯片即可用于杂交。
123 杂交 将靶序列加上杂交液 ( 5 # SSC,
01% SDS), 放在湿盒内 40∃ 杂交 2 h, 之后使用
2 # SSC, 01% SDS以及 02% SDS各清洗 1次,每
次 4 m in。
124 纳米金稀释浓度的选择 链酶亲和素–纳米
金 (原 25 OD /mL)按照不同比例 1%40, 1%20, 1%10,
1%5分别稀释到 00625, 0125, 025, 05OD /mL。
125 纳米金与靶序列的结合 将稀释后的链酶
亲和素–纳米金分别加到清洗后的芯片上, 室温下
结合 60 m in, 之后使用 1 # PBST ( 10 mmo l/L PBS,
05% Tween)清洗 3次, 每次 3 m in, 随后超纯水中
清洗 5 m in。
126 银染显色以及图像处理 将芯片放入 25%
硫代硫酸钠中固定 2- 3m in,之后再次使用超纯水清
洗 5m in。现配置银染液,取 silver enhancer A和 sil
ver enhancer B各 1mL, 充分混合, 并点在芯片上,室
温下静置,至黑色杂交点显示,超纯水中终止反应,使
用普通扫描仪 ( ScanM aker 4850)进行扫描, 并用 Im
age J进行数据读取。
2 结果
21最佳点样液的选取
为了提高探针的固定效率, 以及得到较好的
杂交信号, 通常都需要使用点样液体对探针进行
溶解。从图 1可见, 以 50% DM SO为点样溶液的
杂交信号最强 [ 7] , 且分布均匀, 而以 3 # SSC, 碳
酸盐缓冲液作为点样液得到的杂交点比较模糊 ,
且出现油炸圈状 ( doughnutshaped spo t) [ 8, 9] , 阴
性对照无杂交信号, 说明特异性高。在点样时发
现, 经过水合, 紫外交联等步骤后, 以 3 # SSC, 碳
酸盐缓冲液作为点样液的探针点出现干涸现象 ,
而以 50% DMSO为点样溶液的探针点依然呈现
圆润液态分布在芯片上。
13.探针浓度分别为 50、25、125 m ol /L; 4阴性对照;
AC点样液分别为 3# SSC,碳酸盐缓冲液, 50% DM SO
图 1 不同点样液的比较
22 预杂交对杂交信号的影响
在荧光素标记芯片中,由于背景较高,所以通常
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需要对芯片表面进行封闭,在本试验中,在芯片上分
别用 005% Tween, 脱脂牛奶 ( 005 mo l /L PBS) ,
1% BSA, 2% BSA, 3% BSA进行封闭, 以没有进行封
闭的芯片作为对照,结果见图 2。从图 2A观察到,
未封闭的芯片杂交信号相对于封闭后的芯片杂交信
号要强很多, 但是背景并未很深。进行图像分析
(图 2B)发现预杂交之后信号值约降低 70% , 这与
之前报道经过预杂交后固定在芯片上的探针降低到
30%一致 [ 10, 11]。
预杂交过程可以封闭芯片上的非特异性位点,
以此提高芯片的信噪比,尤其是荧光素标记芯片,分
布在表面上丝毫的杂质可能都会导致随后激发光激
发的时候产生荧光背景, 从而影响杂交效果。而本
技术使用纳米金作为标记系统, 最后使用银染试剂
进行显色,不需要使用荧光激发, 在试验操作过程中
多加注意就可以有效控制芯片背景。本试验为是
否需要进行预杂交提供了一个依据, 在背景很高
的情况下不得以时可以使用预杂交, 但是必须明
确杂交信号肯定会降低许多, 这要视具体情况进
行取舍。
图 2 微阵列芯片 ( A)及信号图像 (B )用以比较不同封闭剂
23 纳米金浓度和银染时间的优化
为了检测不同纳米金浓度下, 不同靶序列浓度
杂交后银染显色的强度, 本试验在不同银染时间下
对结果 (图 3)进行观察。试验发现, 不同浓度纳米
金与芯片结合,在随后的银染过程中,随着银染时间
的延长 ( 4- 16 m in) ,信号强度也在不断加强, 当银
染时间长于 16m in后,检测点信号的强度并没有很
大, 而背景却不断加强, 从而导致检测结果不易发
现。所以综合考虑,在最后的银染显色过程中,采用
15m in的显色时间,随后即终止反应。
另外,在试验中发现,不同浓度的纳米金与不同
浓度的靶序列结合后,银染显色最初肉眼可见所需
的时间不同。当纳米金浓度较高时, 低浓度的靶序
列显色较快;当纳米金浓度较低时,高浓度的靶序列
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则显色较快 (图 4)。但是当靶序列浓度相当低时
(靶序列浓度为 0008 mo l/L ), 不论纳米金浓度高
或者低,形成肉眼可见显色点均需要较长时间,说明
在达到检测最低限之前,当靶序列浓度较低时,可以
通过延长银染时间来扩大检测范围 [ 12]。在芯片试
验中通常需要检测较低浓度的样本量,此时尽快使
较低浓度的靶序列显色通常更有实际意义, 所以本
试验采用 5%1的稀释浓度。
图 3 银染时间的优化 图 4 不同纳米金浓度下的银染时间比较
24 纳米金标记基因芯片灵敏度检测
在进行以上优化后,为了检测纳米金标记方法的
灵敏度,本试验将靶序列进行倍比稀释。结果 (图 5)
显示,随着靶序列浓度升高, 检测点的信号也在不断
上升。当靶序列浓度达到 0008 mo l/L时, 仍然可
见杂交信号,当靶序列浓度低于 0008 mo l/L时, 几
乎无杂交信号,杂交反应体系为 10L,说明该纳米金
标记芯片检测灵敏度达到 80 fmol /L,这比之前研究
中得到的纳米金检测灵敏度相对较低 [ 13]。从图 5B
发现,靶序列浓度在 0008- 1 mo l/L范围内, 检测
点的信号强度与靶序列浓度呈现一种线性关系,靶序
列浓度差异达到约 3个数量级,表明该纳米金标记方
法可以适用于检测足够大范围的靶序列浓度。
图 5 纳米金标记基因芯片的灵敏度检测 (A)以及动态检测范围 ( B)
3 讨论
本试验对纳米金标记标记基因芯片进行点样
液、预杂交、银染时间等条件的优化, 为进一步推广
该方法的应用提供了一些依据。该芯片技术基于利
用生物素与链酶亲和素高亲和力的特性, 生物素修
饰的靶序列与固定在玻片上的探针杂交后, 加入链
酶亲和素标记的纳米金从而形成生物素 链酶亲和
素纳米金生物放大系统,随后经过银染再次将信号
放大。
点样液通常的作用是能够增加核酸分子在基片
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上的固定效率,降低点制芯片时的漏点率,提高基因
芯片杂交信号的强度和均匀性。常见的点样液有
3 # SSC, 50% DMSO等, 3 # SSC具有较强的疏水性,
挥发性较强,点出来的点直径较小,故适合于有湿度
控制高密度芯片的点制;而 50% DMSO具有 DNA变
性的功能,挥发性较低,点的形状较为规则。本试验
发现,使用 50% DMSO作为点样液的探针点形状均
匀分布,信号强, 而以 3 # SSC,碳酸钠缓冲液作为点
样液的探针点却出现了油炸圈状 ( doughnutshaped
spot)
[ 8, 9]
, 原因是后两者挥发较快,产生液滴由中间
向四周的毛细流效应 ( capillary flow effect) [ 14] , 故而
产生四周比中间浓度要高的情况, 而四周较高浓度
的探针随后与靶序列结合的机会较中间区域的探针
也要高很多,从而最终产生油炸圈状的检测点。
在芯片的杂交过程中通常预杂交是较为关键的
一步, 其目的主要包括两部分: 首先使用封闭剂如短
链 DNA或者其他试剂对芯片表面进行封闭,以此将
与芯片发生非特异性结合的几率降低到最低; 其次
就是对未固定的探针进行洗脱。本试验中发现经过
预杂交后,检测点信号降低到 30%。如果原本杂交
信号很强,信号降低不会有太大影响,依然可以检测
得到, 但是若原本信号就比较低, 信号值再降低
30%将会直接导致杂交信号无法检测, 从而产生假
阴性。预杂交导致信号降低的原因: ( 1)某些固定
在芯片上的探针在预杂交过程中被洗脱; ( 2)探针
上所带电荷可能受到预杂交液的影响, 并导致靶序
列与部分探针互补结合出现异常。考虑到 DNA芯
片主要用于基因表达谱研究,病原体检测等较复杂
的应用情况下,此时可以尝试通过其他方法尽量降
低背景: ( 1)对待杂交产物进行纯化, 去除未掺入的
带标记的核苷酸 (如 b io tin16dUTP ), 减少标记物
中蛋白质,多糖和基因组 DNA等可能背景降低的杂
质; ( 2)在杂交之前对杂交液进行充分预热, 确保没
有未完全溶解的微球存在; ( 3)在整个芯片的操作
过程中,要使用无尘手套并最大限度的降低操作空
间的灰尘量等,经过以上手段通常可以有效控制背
景量, 若依然背景很深,此时可以考虑进行预杂交。
纳米金浓度的优化对最后银染显色极为重要,
研究中发现,在一定范围内, 纳米金浓度较高时,低
浓度的靶序列银染显色所需要的时间较短, 而高浓
度的靶序列相对于低浓度靶序列显色速度要慢; 当
纳米金浓度较低时,高浓度的靶序列则显色较快,原
因可能是高浓度的靶序列上所携带的生物素标记在
与高浓度的链酶亲和素–纳米金 ( streptav id innano
gold)相结合的时候存在空间位阻,反而抑制了相互
结合,并且导致随后参与银染扩增的生物素–链酶
亲和素–纳米金的有效结合物减少, 而此时低浓度
的生物素标记靶序列则有效结合, 银染相对较快。
另外,银染显色的时间需要根据试验要求进行优化,
随着银染时间的延长,检测点的信号也得到加强,而
且可以提高检测灵敏度,但是在显色 15 m in后背景
也在急剧加深,所以在试验中采用 15 m in作为银染
时间,此时检测点的信号凭肉眼已经完全可见,而背
景还在一个可控制的较好范围内,符合试验要求。
该纳米金标记基因芯片检测单链核酸的灵敏度
达到 80 fmo l/L, 方法快速简单, 灵敏度高, 特异性
高, 且不需要借助于特殊仪器,在普通实验室即可完
成。其最显著优势在于可以用肉眼直接进行观察,
并且进行半定量, 因此可用于病原体或遗传性疾病
进行快速检测,有望成为广泛应用于临床、野外检测
甚至其他更复杂环境下的新一代芯片检测系统。
参 考 文 献
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