全 文 ：生物杖术通报
· 研究报告 · 丑了口百付脚口乙 年增刊
三倍体九孔鲍生物学特性的初步探讨
李文静 严正凛
集美大学 水产学院 省高校水产科学技术与食品安全重点实验室 , 厦门 !
摘 要 采用 细胞松弛素 抑制九孔鲍受精卵第二极体的释放获得三倍体材料 , 进行三倍
体与普通二倍体的生长对比试验 , 试验分为仔鲍和成鲍两个养殖阶段 。 观察了三倍体性比和性腺发育情况 。 结果
表明 , 三倍体九孔鲍比普通二倍体九孔鲍具有显著的生长优势。 投放的担轮幼 虫经 个月培育 , 三倍体平均壳长
可达 , 壳长绝对生长量是普通二倍体的 倍 平均壳长 的个体经 个月培育后壳长为 ,
绝对增长量是普通二倍体的 倍 。 三倍体成鲍性比和二倍体没有显著差异 , 接近 三倍体性腺发育程度较
低 , 雌 、雄性腺大小和体积比例 均明显小于 同期培育的二倍体成鲍 。
关键词 九孔鲍 三倍体 生长速度 性比 性腺发育
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K ey w o rd s : H aliotis divers ieolor a卿atilis Tri ploid G ro wt h speed Sex 一r a t i o Go n a d d e v o l o p m e n t
九孔鲍(Ha lioris dive rs ico lor a叮u a tilis ) 自然分布
主要在台湾地区 , 由于其经济性状好 , 养殖效益高 ,
现已经成为东南沿海鲍养殖的主要经济种类 。 由于
一直缺乏系统的品种选育和改良工作 , 经过累代养
殖 , 逐渐出现了遗传杂合度低 、抗逆性差 、性状退化
等问题 , 导致生长周期延长 , 增加养殖成本 ;商品鲍
个体偏小 (一般为 5.0 一 6 . oc m ) , 商品价值低 , 直接
阻碍了九孔鲍打进国际市场 。 而且 , 养殖过程中病
害频发也大大增加了养殖风险 , 往往造成重大损失 。
种质退化的问题已经成为了九孔鲍养殖业的制约因
素 。 为了解决上述问题 , 促使九孔鲍养殖业健康发
展 , 种质改良工作势在必行 。
多倍体育种是贝类遗传育种中最活跃的领域 。
多倍体育种在提高生长速度 , 增强养殖生物抗性 , 改
基金项目:本项目获集美大学科研基金及福建省科技计划重大项目(20 2N 00 3 )资助
作者简介 :李文静(19 73一 ) , 男 , 讲师 ,博士 。 主要从事水产增养殖和鱼类种群生态学研究
通讯作者 :严正凛 , E 一 m ai l : y a n z l @ J m u · e d u c n
生物杖术通报 B to te ch n oto gy 2008 年增刊
善养殖贝类经济性状等方面具有显著效果[‘] 。 本
研究在同等养殖条件下 , 通过三倍体九孔鲍与普通
二倍体鲍在仔鲍和成鲍两个不同阶段的生长 、成鲍
性比和性腺发育等方面的观测和对比 , 初步研究了
三倍体九孔鲍的部分生物学特性 。
1 材料与方法
1.1 实验材料
1.1.1 实验用亲鲍及精卵获得 实验用亲鲍通过
人工养成和优化培育获得 。 从培养的后备亲鲍中挑
选生长快 、规格整齐 , 壳长 6c m 以上的 2 一 3 龄亲
鲍 。 要求个体完整 、活力强 、无损伤 、无附着物 、软体
部肥满 。 成熟度以生殖腺饱满程度来判断。 精卵巢
饱满度愈大者愈成熟 。 雌 、雄分别取自不同海区 , 以
避免近亲繁殖 。 雌 、雄比例为 10 一 巧: 1 。
采用阴干和紫外线照射的措施对亲鲍催产 。 具
体方法是把亲鲍雌雄分开 , 分别阴干 2h 后 , 投放在
预先经紫外线照射过的过滤海水的塑料桶中浸浴
Zh 。 紫外线照射剂量为 SO0m w · 丫l 。 其后 , 改换
为普通的新鲜过滤海水 , 等待精卵排放 。
1
.
1
.
2 诱导剂 采用化学诱导的方法 , 诱导剂为细
胞松弛素 B 即 Cytoehal asin B (简称 C B ) , 美国 Sigm a
公司产品 。 分子 式:C29 H 37 N O , , 药品纯 度高于
98% 。
1
.
2 实验方法
1 .2 .1 三倍体诱导 当50 % 受精卵出现第一极体
后 , 用浓度为 0.巧m扩l的 CB 溶液浸泡处理 gm in
(水温 25 ℃左右) , 以抑制九孔鲍第二极体的释放诱
导三倍体。 受精卵极体排放时间受到温度等环境条
件的影响 , 根据预试验的结果确定第一极体出现和
CB 处理的开始时间 。
1
.
2
.
2 洗卵 普通受精卵洗卵:授精 20 m in 后 , 受
精卵沉于受精容器的底部 , 这时就可以进行洗卵:轻
柔迅速地倒弃盆内 3巧 的上层水 , 然后加人新鲜过
滤海水 , 每次浸洗约 15m in , 2 次即可 。
三倍体受精卵洗卵 :用含 0. 1% D M SO (V/V )
的过滤海水浸浴受精卵 , 每次浸洗约 巧 m in , 2 次即
可 。 目的是为了稀释和去除 CB , 以及多余的精液 、
粘液和悬浮卵等 。
1
.
2
.
3 胚胎倍性检查 采用观察极体个数的简易
方法 , 即在第一次卵裂的 2 细胞期 , 镜检受精卵 , 观
察释放极体一个和极体两个的细胞数 , 从而推算出
三倍体率:
三倍体率(% ) 二 [极体一个的细胞数/ (极体一
个的细胞数 +极体两个的细胞数)〕x 10 〔’〕。
以三倍体率为 ro o% 和畸形率为 O 作为试验指
标 , 来修改和调整其诱导浓度和诱导持续时间 。
1
.
2
.
4 幼体及仔鲍培育 选取倍性检查三倍体率
为90 % 以上的受精卵作为三倍体实验样品进行孵
化 。
将浮游的二倍体及三倍体担轮幼虫 , 分别投放
于 4 个规格相同的池子 (规格 :L * B * H = 6m x 3m
x lm )中 , 池中已预先培养硅藻 。 各设 2 组 , 每池担
轮幼虫数 10 0 0个 。
随着幼体的摄食 , 采苗片上的底栖硅藻将逐渐
减少 , 外观发白 , 这时可在培苗池中添加营养盐促进
硅藻生长 , 以保障苗种的摄食需要 。 添加营养盐使
培育池含氮量达 5 x ro 一 6 即可(N :P :si :Fe = ro .o :
1.0 : 1.0 : 0 .1 ) 。 试验苗种采用常规方法培育 , 4 个
培育池均采用同样的培育条件和管理 , 二倍体苗种
作为同期培育的对照组 。
1
.
2
.
5 成鲍培养 选用平均壳长为 3.25 cm 的三
倍体和二倍体九孔鲍 , 分别采用深水式立体养殖 , 1
串为 5 箱 , 每箱鲍 30 个 , 各 3 串 , 置于同一水池饲
养。 实验组和对照组饲养密度 、充气量 、换水量 、饵
料和投喂方法均相同 。
以江篱 、海带为饵料 , 每3d 清理残饵 1次;整日
不停断充气;每 d 流水量程约 30 % , 每 3d 彻底换
水 1 次 。
1
.
2
.
6 养成鲍的倍性检测 随机抽取三倍体试验
鲍 50 只和二倍体鲍 5 只 (个体大小 4 .0 一 5 . oc m ) ,
分别活体取其足部触手 , 用倍体分析仪一一进行
DN A 的相对含量分析 。
1
.
2
.
7 生物学观测 以壳长为衡量生长的指标 , 每
个月定期测定一次 , 每组随机抽取 30 个样品测量壳
长 。 试验结束时 , 每组随机抽取 30 个样品 , 比较成
体三倍体和二倍体的性腺发育和性比等情况 。
2 结果
2.1 仔鲍阶段的生长比较
经过一个月的培养后 , 三倍体九孔鲍的生长优势
就开始表现出来 , 见表 1。 从 2以万年 ro 月 16 日育苗至
洲) 8 年增刊 李文静等:三倍体九孔鲍生物学特性的初步探讨 333
2(X刀 年4 月16 日, 经 5 个月的培育 , 三倍体九孔鲍苗 75 cm ,前者平均壳长绝对生长量是后者的 120 % 。
种平均壳长为 2.25 cm , 而二倍体苗种平均壳长为 1.
表 1 三倍体九孔鲍苗种阶段与普通二倍体的生长比较
试验组(三倍体) 对照组 (二倍体)
日期 平均壳长(cm ) 生长率(% ) 平均壳长(cm ) 生长率(% )
2《X拓 . 1 1 . 16 0 . 15 / 0 . 15 /
o2 (X] 6 . 12 16
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13 3 .3 3
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7 6 .6 7
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2 7 .5 2
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2
.
2 成体阶段的生长比较
三倍体九孔鲍成体与普通二倍体 , 于 20 6 年
ro 月 16 日开始试验培育时 , 它的平均壳长差异不
大 , 均为 3.25c m 。 经 6 个月培育至 20 7 年 4 月 16
日 , 三倍体九孔鲍成体为 5.35cm , 普通二倍体为 4.
87 cm ,前者的平均壳长绝对生长量是后者的 180 % ,
成体阶段三倍体生长速度表现出了更大的优势 (表
2 ) 。
表 2 三倍体九孔鲍成体阶段与普通二倍体生长的比较
试验组(三倍体) 对照组(二倍体)日期
平均壳长(cm ) 生长率(% ) 平均壳长(cm ) 生长率(% )
10.16
11.16 14.15
3.95
4.21
4.38
4.56
4.74
12.22
6.58
4.04
4.11
3.95
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2067
2 .3 三倍体九孔鲍与普通二倍体的性 比比较
三倍体九孔鲍性比与普通二倍体相似 , 基本接
近 1:1 。 试验组中有些性别表现不明显 , 计数时视
为雌鲍 , 见表 3 。
表 3 三倍体九孔鲍与二倍体的性比比较
日期 试验组 (三倍体) 对照组(二倍体)
20 7.04 .16 雌鲍(只 ) 雄鲍(只 ) 雌鲍(只) 雄鲍(只 )
2 .4 三倍体九孔鲍与普通二倍体的性腺发育比较
九孔鲍为雌 、雄异体 , 生殖腺包被在庞大内脏团
的大部分表层 , 尤其在内脏团伸出的呈牛角状器官
外围 ,位于身体右后方 。 繁殖盛期的二倍体九孔鲍
性腺极其饱满 , 几乎包裹了整个胃和肝脏 , 雌性性腺
咖啡色 , 雄性性腺乳白色 。 三倍体九孔鲍性腺的发
育较差 , 雌性性腺呈咖啡色 , 不饱满 , 为雌性二倍体
九孔鲍的五分之二左右 ;雄性性腺呈土灰色 , 为普通
雄性二倍体九孔鲍的四分之一左右 。
2
.
5 养成后的三倍体率
一般选用胚胎倍性检查三倍体率达 90 % 以上
的实验样品进行孵化 、苗种培育和养成 。 本实验经
养成 的三倍体试验群体中 (个体大小 4.0 一 5 .
生物孩术通报 刀勿阳‘hn o leg 护 2 0 0 8 年增刊
ocm ) , 随机抽取 50 个进行倍性分析 , 结果 43 个为
三倍体 , 三倍体率达 86 % 。 二倍体和三倍体的 D NA
相对含量分别见附图 1 和图 2 。
图 1 二倍体九孔鲍 D N A 相对含.
图2 三倍体九孔鲍 D N A 相对含t
3 讨论
3.1 多倍体育种在贝类中的应用
鲍具有食物链短 , 定居性强 , 育苗和养殖基础
好 , 成本相对较低等特点 , 其养殖已经成为海水养殖
的主要支柱产业之一 。 贝类多倍体技术主要是通过
化学 、物理 、生物等方法诱导产生三倍体 , 对现有的
养殖种类进行种质改良 , 以提高养殖群体生长速度 ,
改善贝类经济性状 , 增强抗逆性 。 自19 81 年Stan ley
等最早诱导出美洲牡砺 (Cras sos tre a “rg in ic a) 三倍
体后 , 贝类的多倍体诱导技术受到普遍关注 。 [s] 。
目前已经有犯 种以上的贝类开展了多倍体诱导研
究 。 其中包括 7 种牡砺 , 9 种扇贝 , 2 种珠母贝 , 3 种
贻贝和蛤仔 , 4 种鲍等一些经济双壳类和腹足类 。
美国自 1984 年开始开展太平洋牡砺的多倍体商业
化生产 , 目前三倍体太平洋牡砺在美国占养殖产量
的 30% 一 5 0 % 。 我国的贝类多倍体育种也逐渐得
到了重视 。 太平洋牡砺 、近江牡蜘 、栉孔扇贝 、合浦
珠母贝 、皱纹盘鲍等多种贝类的多倍体育种研究已
经列为国家科委海洋生物 863 重大项 目 , 在诱导方
法 、苗种培育 、规模化生产等方面开展了大量研究并
有显著进展〔4〕。 尤其是三倍体太平洋牡砺的育苗
和养殖研究进展迅速 。 1 9 9 8 年 , 利用低温休克 、
6D
M A P 处理等方法诱导太平洋牡砺三倍体 , 获得牡
砺苗5 亿粒 ,养殖 4 00 余亩 , 成体牡砺三倍体率达
60% 以上〔’] 。
在鲍育种技术中 , 目前仅杂色鲍 (H. d俪rs ico lor
d动ers ic o lo r )和皱纹盘鲍(Ha litis diseo hannailn 。 ) 和
九孔鲍开展了多倍体育种研究川 。 九孔鲍是我国
东南沿海广泛养殖的贝类种类 , 但其遗传结构基本
属于野生品系 。 试验初步证实了三倍体九孔鲍具有
生长优势 ,说明在九孔鲍育种过程中采取多倍体育
种方式是可行的。 今后还需要在三倍体抗病性 、对
环境因子的耐受能力 、各阶段的成活率 、成鲍育性等
方面开展进一步研究 , 为三倍体九孔鲍推广奠定基
础 。
关于多倍体在生长中的优势表现 , 除了在贻贝
幼虫中发现三倍体和二倍体存在差异外「6 」, 多数
研究认为 , 贝类在达成熟期后 , 三倍体才显示出生长
方面的优势【’〕。 我们的研究结果表明 , 九孔鲍三倍
体在幼贝和成鲍阶段均表现出生长优势 , 说明九孔
鲍三倍体育种具有良好的应用前景和推广价值 。
3
.
2 关于诱导方法
贝类多倍体育种的方法可以分为化学法 、物理
法 、生物法 。 化学法主要是利用化学物质(诱导剂)
抑制和干预细胞的正常分裂过程 , 达到改变倍性的
目的 。 在贝类多倍体育种中 , 采用化学诱导方法比
较普遍 。 目前主要采用的化学诱导剂有 :细胞松弛
素 B(eyt oehatgin B ) 、 6 一二甲基氮基嗓吟(6 一 d im e th -
y la m in o p u ri n e )
、 咖啡因 (Caffe ine ) 、 秋水仙素(Col-
chi cin e)等 。 采用 cB 作为诱导剂效果显著 , 三倍体
率较高 , 但是由于其强烈的药物作用 , 可能对操作者
和环境有潜在影响 , 使用需要特别谨慎 。
在直接诱导三倍体的方法中没有一种可 以保证
三倍体率可 以达到 10 % , 而且三倍体不能 自我延
年增刊 李文静等:三倍体九孔鲍生物学特性的初步探讨 335
伸种群 ,需要每年进行诱导 , 操作繁琐 , 生长稳定性
也差 。 同时 ,诱导剂的安全性需要进一步的验证 , 诱
导处理带来的胁迫也大大降低了幼虫的成活率和产
量 。
四倍体的成功诱导可使以上问题迎刃而解 。 四
倍体的诱导和培育是最终获得 10 % 三倍体的根本
出路。 我们已成功地获得四倍体九孔鲍成鲍 , 并用
四倍体鲍与二倍体鲍杂交繁育出三倍体九孔鲍 。 获
得四倍体后无论和二倍体进行正交还是反交 , 其后
代均表现明显的生长优势[8], 这一点已经在太平洋
牡砺中得到证实。 通过四倍体和二倍体杂交产生的
三倍体比抑制极体产生的三倍体更适合于生产性养
殖 , 这也是控制种群 、保护生物多样性的最为理想的
方法[9]。 此外 , 利用四倍体与异种二倍体杂交可产
生异源三倍体。 目前太平洋牡砺四倍体和近江牡砺
二倍体杂交已经成功培育出异源三倍体后代 。
3
.
3 三倍体的育性
传统认为 , 贝类三倍体是不育的 , 并认为此特点
对于生产是有利的 。 在繁殖季节 , 只消耗极少能量
于性腺发育 , 从而使能量支出主要用于营养生长 。
因此 , 三倍体贝类生长快 、个体达 、产量高 ,繁殖期死
亡率低 , 缩短了养殖周期 。 三倍体的不育性还能有
效提高贝类品质。 研究表明 , 三倍体牡砺由于性腺
发育差 , 不会由于性腺发育造成体内糖原含量下降 ,
周年保持较高的糖原含量 , 具有鲜美的口味 。 此外 ,
三倍体贝类育性差对于防止遗传污染 , 保护海洋生
物多样性是有正面意义的 。 三倍体九孔鲍性腺发育
明显受到抑制 ,性腺大小和饱满程度均远低于同期
发育的二倍体个体 。 尽管九孔鲍三倍体性腺发育的
机制还不是很清楚 , 但是育性降低对于延长生长期 ,
降低性产物的能量支出 , 改善商品鲍品质显然是有
正面意义的。
目前 , 关于三倍体贝类繁殖力比较研究的文献
很少 , 对三倍体动物不育研究大多局限于性腺发育
的组织学观察 。 但某些三倍体贝类能产生配子的事
实向三倍体不育性提出了挑战 , 今后需要对多倍体
的繁殖生物学做进一步深人细致的研究。 一般情况
下 , 同源四倍体是高度不育的 ,但在贝类中四倍体能
够产生成熟的生殖细胞 , 这已在九孔鲍得到证实 。
实现贝类 自群繁殖 , 建立稳定的四倍体品系 , 是今后
贝类育种的重要课题之一[9] 。
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