全 文 ：第 18卷　第 4 期 　　　　　　　　　　　　　　云南农业大学学报　　　　　　　 Vol.18　No.4
2003年　12 月 　　　　　　　　　　Journal of Yunnan Agricultural University　　　　　 Dec.2003
离体培养条件下三色堇多倍体诱导研究
郑思乡1 , 2 , 3 , 胡　秀2 , 雷小云3 , 章海龙3 , 赵　燕2 , 周丽娟3
(1.昆明奇卉植物多倍体研究所 , 云南 昆明 650201;
2.云南农业大学园林园艺学院 , 云南 昆明 650201;
3.雷森科技有限公司 , 云南 昆明 650031)
摘要:在离体培养条件下 , 研究了秋水仙素不同浓度 、不同处理时间对三色堇实生苗的诱变效果。结果表明:三
色堇对秋水仙素较为敏感 ,以 0.1%～ 0.2%秋水仙素处理 12～ 36 h 为佳 , 最高诱变频率可达到 26%.同时以二
倍体三色堇为对照 ,对四倍体三色堇的形态特征和光合作用特性进行了初步研究。研究发现四倍体三色堇叶色
浓绿 、叶片肥厚 、花大 、花瓣厚 、香味浓 、气孔和花粉粒巨大 。同时四倍体净光合速率 、水分蒸腾速率和气孔导度
均比二倍体高。并将四倍体与二倍体杂交首次获得了三倍体三色堇。
关键词:三色堇;四倍体;三倍体;形态学;光合作用
中图分类号:S 682　　文献标识码:A　　文章编号:1004-390X(2003)04-0397-04
Study on Polyploidy Induction of Viola tricolor in Vitro
ZHENG Si-xiang1 ,2 , 3 , HU Xiu2 , LEI Xiao-yun3 ,
ZHANG Hai-long3 , ZHAO Yan2 , ZHOU Li-juan3
(1.Qi Hui Plant Polyploidy Research Institute of Kunming , Kunming 650201 , China;
2.College of Garden and Horticulture , Y A U , Kunming 650201 , China;
3.Leisen Science and Technology Limitd Company of Yunnan , Kunming 650031 , China)
Abstract:Studied the induction effect of colchicines with different concentration and treatment time on Vio-
la tricolor in vitro.The result shows that the Viola tricolor is very susceptible to colchicines and 0.1%～
0.2% colchicines with 12 ～ 36 h treatment time is effective on polyploidy induction of Viola tricolor.The
highest inducing frequency is 26%Compared with the diploid.The morphological and photosynthetic char-
acteristics of tetraploid Viola tricolor were studied preliminary.The result indicated that the tetraploid leaves
of Viola tricolor are bigger and thicker and the color is more deep green.Its flower is more huge.Its stoma
and pollen grains are significantly bigger and the net photothesis rate of the tetraploid is higher than the
diploid.In addition it was carried out that the tetraploid were hybridized with diploid , and the triploids were
firstly obtained.
Key words:Viola tricolor;tetraploid;triploid;morphology;photosynthesis
　　三色堇(Viola tricolor L.)为堇菜科堇菜属多年
生草本植物 ,又名蝴蝶花 、鬼脸 、猫儿脸等。三色堇
因具有色彩丰富 、品种繁多 、花色多变 、花期长等特
点 ,因而常作为花坛 、花境 、盆花及图案 、景观设计
的首选材料。多倍体是植物进化的重要方式之一 ,
多倍体育种已在枸杞[ 1] 、金鱼草[ 2 , 3] 、莲[ 4] 、黄芩[ 5]
等植物上获得了十分突出的成果 。在三色堇多倍
体研究方面 ,仅有两篇文献报道了相关研究内
收稿日期:2003-02-16
　作者简介:郑思乡(1966-),男 , 湖南岳阳人 ,副教授 , 博士 ,主要从事花卉遗传育种与生物技术方面的研究。
DOI :10.16211/j.issn.1004-390x(n).2003.04.019
容[ 6] 。Bamford R(1941)发现了一个天然的四倍体
三色堇。Chas c.Hart.Seed Company 选育出四倍体
三色堇品种“Magic Carpet”.国内尚无有关研究报
道 ,本研究采用组织培养结合秋水仙素的方法来诱
导产生三色堇四倍体 ,并对其形态特征和光合作用
特性进行研究 ,从而为尽快获得具有自主知识产权
的三色堇多倍体新品种奠定基础。本研究还首次
进行了四倍体与二倍体杂交试验 ,以培育三倍体杂
种优势很强的新品系 。
1 　材料与方法
1.1 　供试材料
供试材料为自交分离的 S3-2 , S2-1等 33个三
色堇纯系 。
1.2 　三色堇多倍体的诱导方法
三色堇种子经 75%酒精浸泡 30 s ,再经 0.1%
HgCl2消毒 6 ～ 8 min ,然后用无菌水漂洗 4次 。将
无菌的种子接种至 1/2 MS+0.2 mg/L 6-BA+0.1
mg/L NAA 培养基上。待种子发芽后用 0.1%和
0.2%秋水仙素浸泡 12 ～ 36 h ,然后转接至上述相
同的培养基上继续生长发育 。生根培养基为
1/2MS+1mg/L NAA+0.05%活性炭。
1.3 　多倍体鉴定
形态鉴定:观察植株的叶色 、叶片厚度 、枝杆的
直径 、花的大小等 。多倍体一般表现叶色浓绿 、叶
片肥厚 、质地粗糙。特别是花大 、花瓣厚 、花粉粒具
有巨大性 。
气孔鉴定:撕取叶片下表皮制片 ,在显微镜下
观察测量气孔大小 ,样本数为 30.多倍体气孔面积
一般比二倍体大一倍左右 ,差异十分显著。气孔大
小可作为多倍体初步鉴定的指标。
染色体鉴定:取根尖或茎尖 ,采用 F-BSG法
制片 ,显微镜观察染色体数目 。
1.4 　多倍体的稳定
将嵌合体变异株去除顶端优势促发大量的分
枝或丛生芽 ,通过反复分割可分离出稳定的多倍体。
1.5 　光合作用测定
采用 CI-301PS 光合作用测定仪 ,同等的环境
条件下对同花期的四倍体 S3-2和二倍体 S3-2进行
了光合作用测定[ 7 , 8] 。所测叶片均为第 5叶(从上
而下数),分别测量 4次 ,然后取平均值。
2 　结果与分析
2.1 　组织培养结合秋水仙素处理对三色堇的诱
变效果
三色堇种子经MS+0.2mg/L 6-BA+0.1mg/
L NAA培养出苗后 ,经 0.1%和 0.2%秋水仙素浸
泡处理 12 ～ 36 h ,然后转接至上述相同培养基上恢
复生长 ,并不断继代繁殖 。培养一个月后 ,取叶片
下表皮进行气孔观察 ,以气孔明显增大作为变异的
指标 ,其诱变效果见表 1.
表 1 　组织培养结合秋水仙素对三色堇的诱变效果
Tab.1　The inducing effect of colchicine on Viola tricolor in vitro
浓度 时间/h
处理
株数
死亡
株数
死亡率
/ %
诱变
株数
诱变率
/ %
0.1% 12 h 100 7 7 2 2
24 100 13 13 13 13
36 100 25 25 18 18
0.2% 12 100 8 8 13 13
24 100 18 18 26 26
36 100 36 36 6 6
从表 1可以看出 ,三色堇对秋水仙素十分敏
感 ,秋水仙素浓度的增高及处理时间的延长 ,三色
堇植株的死亡率明显增加。秋水仙素浓度超过
0.2%,处理时间超过 24 h后 ,死亡率急剧增加 ,虽
然变异明显 ,但由于死亡率高反而导致变异率下
降。从表中可看出采用 0.2%秋水仙素处理 24 h
的方法诱变效果最佳 ,其诱变频率高达 26%.在诱
变过程中还发现不同品种之间差异较小 ,且均对秋
水仙素十分敏感 ,苗的死亡率较高 。
2.2 　离体培养条件下变异株的形态特征
变异株初期下胚轴增粗 ,近根尖局部膨大成球
形 ,根生长受阻 ,逐渐黄化死亡。变异株子叶肥厚 、
叶色浓绿 、茎秆粗壮 、节尖短 。有的呈畸形突变 ,叶
片呈条形或盾片状 ,植株扭曲 。但随着植株的生长
发育 ,以后又可逐渐恢复到正常状态。对外形变异
明显的植株 ,撕取叶片下表皮制片 ,然后进行显微
观察测量 ,以正常的二倍体为对照 ,发现四倍体变
异株气孔明显大于二倍体气孔(见表 2),二者差异
十分显著 。但单位面积的气孔数比二倍体少 ,且保
卫细胞中的叶绿体大 ,数量多 。
2.3 　三色堇四倍体的稳定
经秋水仙素诱变的后代 ,经过去顶端优势促发
丛生芽 ,从中可分离出稳定的同源四倍体。例如通
过这一方法分离的同源四倍体 S3-2即表现出很高
的稳定性 ,S3-2从移栽大田直至开花结实整个生育
398 云南农业大学学报 　　　　　　　　　　　　　　第18卷
期均表现出叶色浓绿 、肥厚 ,全株所有叶片的气孔
均表现出巨大性。而没有经过稳定的变异株移栽
大田后却表现嵌合体的性状。如 S2-1表现出典型
的嵌合体现象 ,在此株上有一个分枝是典型的二倍
体。而另一分枝则表现出明显的多倍体特征 ,其叶
片肥厚 、颜色深绿 、叶缘锯齿深 ,叶片下表皮气孔明
显大于二倍体气孔 ,形成了极为明显的对照 。对于
嵌合体可采用分枝扦插 ,或收获变异枝条上的种子
来稳定四倍体 。
表 2 　三色堇四倍体试管苗气孔大小
Tab.2　The stoma size of tetraploid Viola tricolor in vitro
材　料 气孔长径/μm 气孔短径/μm 差异显著性α=0.05 α=0.01
四倍体 S3-2 61.25±1.96 38.25±0.89 a A
二倍体 S3-2 36.28±1.07 28.25±0.72 b B
2.4 　四倍体三色堇形态特征
四倍体三色堇形态特征十分明显 ,表现出叶色
浓绿 、叶片肥厚 、花朵巨大 、花瓣厚而挺 、香味浓 、花
色艳丽 、花斑大 、气孔和花粉粒巨大 。四倍体三色
堇的观赏价值大为提高 。现以S3-2为例 ,其形态特
征见表 3.
表 3 　三色堇四倍体形态特征
Tab.3　The morphological charouteristics of tetraploid Voila tricolor
材　　料 叶片长×宽/cm
花枝长×粗
/ cm
气孔
/μm 香味
花径大小
/ cm
花粉粒大小
/μm 　　整体感官指标
四倍体 S3-2 4.45×3.25 8.50×0.42 70.13×41.50 浓 7.7×7.7 139.0×127.4 株型花姿较好
二倍体 S3-2 3.40×2.75 7.10×0.28 56.63×37.88 淡 5.7×5.7 107.8×89.5 株型花姿更好 ,花瓣更挺,观赏价值大为提高
2.5 　同源四倍体光合作用特性
采用CI-301PS 光合作用测定仪在同等环境
条件下 ,对四倍体S3-2和二倍体S3-2进行了光合作
用的测定 ,结果见表 4.
表 4 　四倍体三色堇光合作用特性
Tab.4　The photosynthesis characteristics of
tetraploid Viola tricolor
　　　项　目 四倍体
S3-2
二倍体
S3-2
胞间 CO2浓度/(质量分数×10-6) 189.30 133.00
净光合速率/[ μmol·(m-2·s-1)] 10.45 7.07
蒸腾速率/[ mmol·(m-2·s-1)] 3.13 2.05
气孔导度/[ mmol·(m-2·s-1)] 127.17 62.35
叶室空气温度/ ℃ 20.70 20.40
光合有效辐射/[ μmol·(m-2·s-1)] 1 290.53 1 291.47
相对湿度/ % 50.33 44.73
从表 4可以看出四倍体 S3-2净光合速率 、蒸腾
速率 、气孔导度均比二倍体S3-2高 。特别是四倍体
净光合速率比二倍体高 47.8%,这一特性是四倍
体具有巨大性的物质基础。
2.6 　三色堇四倍体育性观察
开花期对四倍体三色堇花粉粒进行了观察 ,发
现四倍体花粉粒更大 、更饱满 ,但也发现有部分花
粉粒不育 。将四倍体进行了自交均能结实 ,但结实
率比二倍体低[ 9] 。同时以四倍体为母本与二倍体
进行了杂交试验 ,首次成功地获得了三倍体三色
堇。有关三倍体三色堇的生物学特性将另文发表 。
3 　讨论
(1)在三色堇多倍体诱导过程中 ,采用组织培
养结合秋水仙素的方法虽能成功地诱导出稳定的
四倍体。但三色堇试管苗死亡率较高 ,且不定芽再
生较为困难。故三色堇采用这一方法所产生的诱
变效果远不如百合[ 10～ 12] 、芦荟[ 13] 、苎麻[ 14] 、芦
笋[ 15]那么明显 。而采用常规的种子浸泡法和苗期
点生长点法能否得到更理想的诱变效果还有待进
一步研究 。三色堇组织培养过程中虽难诱导不定
芽 ,但通过去顶端优势可促发大量分株 ,从中可有
399第 4期　　　　　　　　郑思乡 ,等:离体培养条件下三色堇多倍体诱导研究
效地分离出稳定的四倍体 。若不经过这一稳定 ,则
大部分均为嵌合体。对于嵌合体则可将变异的分
枝进行扦插来稳定四倍体 ,或在变异分枝上进行自
交授粉来获得大量稳定的四倍体种子。
(2)研究发现四倍体三色堇具有明显的巨大
性 ,表现出叶片肥厚 、叶色浓绿 、枝干粗壮。特别是
四倍体花比二倍体大 82.2%,且花瓣厚而挺 、颜色
艳丽 、香味浓。这一系列特征大大增加了三色堇的
观赏价值 ,具有很好的市场开发前景。经过稳定性
试验后可申报四倍体三色堇新品种 ,并进而申报品
种保护。
(3)研究首次采用轮配法将四倍体三色堇与
二倍体进行了有性杂交 ,成功地获得了三倍体 。三
倍体一般在所有倍性中营养生长优势更强 ,且三倍
体具有高度的不育性 ,从而产生无籽现象 ,这将对
于品种权的保护具有重要的意义。当然 ,本研究将
三倍体优势与杂种优势结合起来 ,能否产生观赏价
值更高的新品种还有待进一步研究 。
[ 参　考　文　献]
[ 1] 　秦金山 ,王莉 , 牛德水 ,等.枸杞同源四倍体新物种类
型的建立[ J] .遗传学报 , 1985 , 12(3):200-203.
[ 2] 　岳桦.诱导金鱼草多倍体的初步研究[ J] .园艺学报 ,
1990 , 17(1):76-80.
[ 3] 　岳桦 ,任俐.不同品种金鱼草多倍体诱变方法的研究
[ J] .东北林业大学学报 , 1992 , 22(4):102-107.
[ 4] 　清泉 ,郑思乡 , 杨瑞芳 ,等.莲多倍体诱导研究[ J] .湖
南农业大学学报 , 1997 , 23(1):26-29.
[ 5] 　陈柏君 ,高山林 , 卞云云.黄芩组织培养同源四倍体
的诱导[ J] .资源与环境学报 , 2000 , 9(1):9-11.
[ 6] 　金波 , 王月新.三色堇 、金盏菊 、金鱼草新品种选育
[ J] .园艺学报 , 1995 , 22(1):97-98.
[ 7] 　汤章城.现代植物生理学实验指南[ M] .北京:科学
出版社 , 1999.
[ 8] 　张志良.植物生理学实验指导(第二版)[ M] .北京:
高等教育出版社 , 1990.
[ 9] 　王军卫 ,牛富针.三色堇杂交制种技术[ J] .北方园
艺 , 2000 , (1), 62-63.
[ 10] 　贾敬芬 ,谷祝平 , 郑国 .百合花丝组织培养及细胞
学观察[ J] .植物学报 , 1981 , 23(1):17-21.
[ 11] 　黄济明.百合的组织培养和试管内诱发多倍体试验
[ J] .园艺学报 , 1983 , 10(3):125-128.
[ 12] 　鲍惟钊 , 吴敬音 ,王月芳 , 等.百合组培诱变研究 Ⅰ .
器官水平的多倍体诱变[ J] .江苏农业科学 , 1984 ,
(1):28-30.
[ 13] 　王俐 , 郑思乡 ,李枝林 , 等.库拉索芦荟多倍体诱导
及其变异初报[ J] .云南植物研究 , 2001 , 23(4):493
-496.
[ 14] 　郑思乡 , 罗慧敏 , 董延瑜 ,等.组织培养在苎麻多倍
体研究中的应用初报[ J] .湖南农业大学学报 , 1995 ,
21(4):361-365.
[ 15] 　郑思乡.芦笋多倍体诱导及其离体培养的研究[ J] .
湖南农业科学 , 1996 ,(1):22-23.
400 云南农业大学学报 　　　　　　　　　　　　　　第18卷