全 文 ：DOI: 10.13925/j.cnki.gsxb.20140191
三倍体葡萄柚实生后代多倍体的
发掘与SSR遗传鉴定
梁武军，解凯东，谢宗周，徐 强，伊华林，郭文武*
（华中农业大学园艺植物生物学教育部重点实验室·农业部华中地区园艺作物生物学与种质创制重点实验室，武汉 430070）
摘 要:【目的】从三倍体葡萄柚自然授粉的实生后代中发掘多倍体，希望获得一批多倍体新种质，并为探索三倍体遗
传规律奠定基础。【方法】秋季采摘三倍体葡萄柚成熟果实，剥取种子，MT+1 mg·L-1 GA3培养基播种，待种子萌发后，用
流式细胞仪快速检测其倍性，并采用SSR（simple sequence repeat）分子标记鉴定其不同倍性后代植株的来源。【结果】获
得了二倍体、三倍体、四倍体、五倍体、六倍体和疑似非整倍体等不同倍性的再生植株各172、52、7、1、1、18株。用13对
多态性SSR引物鉴定其来源，结果表明，由二倍体可能三倍体母本所产生的1X配子与周边其他二倍体品种的花粉授
粉而来，也可能由三倍体母本产生的重组型2X配子的无融合生殖而来；三倍体大部分由珠心细胞发育而来；四倍体为
杂交起源的四倍体；五倍体和六倍体与母本（三倍体葡萄柚）的带型完全相同。【结论】上述活体材料的发掘为柑橘多倍
体育种奠定了种质基础。
关键词：柑橘；多倍体；SSR（simple sequence repeat）分子标记；三倍体
中图分类号：S666 文献标志码：A 文章编号：1009-9980(2015)01-0013-06
Exploitation of polyploids from open-pollinated triploid grapefruit prog⁃
enies and their genetic identification by SSR molecular markers
LIANG Wujun，XIE Kaidong，XIE Zongzhou，XU Qiang，YI Hualin，GUO Wenwu*
(Key Laboratory of Horticultural Plant Biology (Ministry of Education)，Key Laboratory of Central China Horticultural Crop Biology and
Germplasm Enhancement (Ministry of Agriculture) Huazhong Agricultural University，Wuhan，430070，China)
Abstract:【Objective】To exploit spontaneous polyploids as new germplasm from seedling progenies of
open pollinated triploid grapefruit.【Method】Fruits of triploid grapefruit were harvested in autumn. Seeds
were collected and cultured in vitro. Flow cytometry was applied to verify the seedlings’ploidy level，and
simple sequence repeat (SSR) markers were used to characterize their genetic origin.【Results】172 Dip⁃
loid，52 triploid，18 tetraploid，one pentaploid，one hexaploid and 18 putative aneuploid seedlings were
identified from the recovered plants respectively. The genetic origin of these polyploids obtained by em⁃
bryo rescue were determined by 13 SSR markers，and the results showed that diploid might be 1X gamete
pollinated and fertilized by nearby 1X pollen grain from other citrus cultivars，or it might be a product of
apomixes of recombinant 2X female gamete. Triploids were mostly derived from nucellar cells. Pentaploid
and hexaploid have exactly the same banding pattern as the female parent.【Conclusion】These newly ex⁃
ploited polyploids hold great potential for citrus breeding.
Key words: Citrus；Polyploid；SSR (simple sequence repeat) molecular mark；Triploid
柑橘是世界第一大类水果，我国柑橘面积、产量
均居世界首位。果实无核是市场和消费者对柑橘品
种的一个基本要求，培育无核的商业品种成为柑橘
育种追求的主要目标之一。三倍体柑橘作为天然的
无核类型而被育种家青睐，且在多倍体系列中，三倍
体被认为营养生长最优 [1-2]。三倍体花粉在减数分
收稿日期：2014-05-19 接受日期: 2014-09-15
基金项目：国家自然科学基金（31125024；31221062）；国家863计划课题（2011AA100205）；教育部创新团队项目(IRT13065)
作者简介：梁武军，男，在读硕士生，研究方向：生物技术与种质评价利用。Tel: 13579979891, E-mail:1833773487@qq.com
􀆽通信作者 Author for correspondence. Tel: 027-87281543，E-mail: guoww@mail.hzau.edu.cn
果树学报 2015，32（1）: 13-18
Journal of Fruit Science
果 树 学 报 32卷
裂过程中会出现染色体不均等分裂、落后染色体、染
色体桥及第一、二次减数分裂时染色体不减数等一
系列异常现象，产生大量畸形花粉，导致其育性降低
甚至不育。因此，三倍体在果实无核的同时，Ger⁃
mana等[3]利用三倍体花粉的低育性，采集其花粉授
粉刺激单胚性二倍体品种使其孤雌生殖，从而获得
了单倍体和纯合二倍体再生植株。而单倍体对于生
长周期长、具有高度杂合性、树体高大等特点的柑橘
来说，其在柑橘育种与基因组研究中都扮演着非常
重要的角色[4]；同时借助细胞融合技术也可将单倍体
和二倍体融合，从而快速获得三倍体无核种质[5]。由
于三倍体配子的多样性，且三倍体在自然条件下也
可产生一定数量的种子，这些种子通过胚抢救可获
得丰富的三倍体、四倍体、非整倍体甚至更高倍性的
再生植株。获得的三倍体植株可直接用于优良无核
种质的筛选 [2，6-7]；四倍体可作为培育三倍体无核种
质的优良中间材料 [8-10]；非整倍体材料则在基因定
位、遗传关系等方面具有很高的研究价值[11]。柑橘
作为木本果树，发掘的新种质资源以种子保存的同
时，也可利用组织培养、愈伤组织保存、嫁接等方式
有效保存，且高接可使获得的材料尽早开花结果。
因此，三倍体后代的获得对柑橘育种研究十分有意
义。
三倍体柑橘具有胚败育、童期长等特点，将其作
为母本的报道较少，且其后代的倍性变化也没有明
确的结论。因此，我们以自然授粉的三倍体葡萄柚
为试材，通过胚抢救技术，希望获得一批多倍体新种
质，同时也为利用三倍体进行柑橘减数分裂行为研
究及多倍体育种奠定种质基础。
1 材料和方法
1.1 材料
三倍体葡萄柚（Citrus paradisi，品种名暂未知），
红橘（C. reticulata Blanco），凤凰柚 [C. grandis（L.）
Osbeck]，均定植于华中农业大学柑橘种质圃。
1.2 胚培养
采摘自然授粉的三倍体葡萄柚成熟果实，剥取
种子并统计数量。用1 mol·L-1 NaOH浸泡10 min（除去
果胶等杂质）后，剥去外种皮晾干，用质量分数 3%~
5% NaClO灭菌 15 min，无菌水清洗3~5次后，播种于
MT + 1 mg·L-1GA3培养基上，整个过程均在无菌条件
下操作。最后置于光照培养室中培养。培养条件：
温度（25±2）℃，光照强度1500 lx，光照时间16 h·d-1。
1.3 流式细胞仪对后代再生植株倍性检测
经胚抢救获得的再生植株，待幼苗长出 2~3片
真叶时，参照张俊娥等[12]的方法，取叶片用流式细胞
仪快速检测其倍性。
1.4 获得的多倍体与母本三倍体形态学比较
取三倍体母本、后代不同倍性再生植株叶片，从
叶色、叶缘、翼叶等方面进行形态比较。
1.5 SSR分子标记对后代的遗传鉴定
摘取三倍体母本以及不同倍性后代植株的叶片用
于DNA提取。参照程运江等[13]方法。用NanoDroP 1000
紫外分光光度计（Thermo Scientific，USA）检测DNA浓
度和质量，然后用TE缓冲液将DNA原液稀释至50～
100 mg·L-1，置于-40 ℃冰箱保存备用。
13对具有多态性的 SSR引物由本实验室开发
（未发表）和 Xu等 [14]提供（表 1），由上海 Sangon公
编号
No.
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
引物代号
Primer code
Ma3-2
Ma3-46
Ma3-59
Ma3-64
Ma3-73
Ma3-96
Ma3-120
Ma3-142
Ma3-143
Ma3-153
Csin.0230
Csin.0087
M8-9
正向引物
F-Primer
CGCACTTGAAACGCCTAATA
AAATGGACACTGCAGGCTTT
TTACAGTCACAGCAGCCTGG
CGTCCGGAATAATCAACCAA
ATCCTCATTTGTTTTCCCCC
ATCATTTCAACAAGGGACGG
GCTCGCAAACACTCTCTGAA
TTTCTTCGTCAACCCCAAAG
AATTTGTTGCTGTGCTTCCC
CTGTTGCTGCTCTTGGATCA
TTGGAATCGCAATGAACTGT
TTTTAAGCTAACAAGCCCCC
TTGGCAGAAAACAGAGTTGC
反向引物
R-Prime
TCTGCATCACAGTCGTAGCA
GCTGAGCAAAATGAAGCAAT
AGAAGAGGACGAGGGAGAGG
GGAAGAATAGCGAACACCCA
GTTGGCTTGTGATCGGAGTT
TCGCCAATCAAACAACAAAA
CAAGAAAGGGCAAGAAAACG
TAGAAGAAGGACCCCGAACC
GATCTGGGTTGGATCCTTGA
GTTCCGGATTGAACCATGTC
TCATTCCCTAGGGCTGAAAA
ATGAATGGCCATGATTTTGC
CAATGGGAGTCGTTGATTTG
表1 SSR引物序列
Table 1 The sequences of SSR primers
14
1期 梁武军，等:三倍体葡萄柚实生后代多倍体的发掘与SSR遗传鉴定
图1 三倍体母本与后代二倍体和四倍体再生植株混样（A）以及三倍体母本与五倍体和六倍体再生植株混样（B）的倍性分析
横坐标表示DNA含量；纵坐标表所检测的细胞数量。
Fig. 1 Ploidy analysis of regenerated diploid，tetraploid，pentaploid and hexaploid plantlets by flow cytometry with triploid
grapefruit as a control
X axis refers to DNA content of samples; Y axis refers to the detected cell numbers in samples.
320
240
100
80
0
Cou
nts
0 100 200 FL1 UV LED 0 100 200 FL1 UV LED
80
60
40
20
0
Cou
nts
A B
图2 三倍体葡萄柚果实、种子及不同倍性再生植株的叶片形态比较
Fig. 2 Fruits and seeds of triploid grapefruit and leaf morphology comparison of plantlets with different ploidy levels
司合成。扩增反应在 PTC-200 PCR 仪（MJ Re⁃
search Inc.）上进行。扩增程序为：94 ℃预变性 5
min；94 ℃变性 30 s；55 ℃退火 30 s；72 ℃延伸 40
s；32个循环；72 ℃延伸 10 min；最后 4 ℃保存。扩
增产物经 95 ℃加热变性 10 min后，在恒定功率
80 W条件下，质量分数 6%聚丙烯酰胺凝胶电泳
约 1 h后银染。
2 结果与分析
2.1 植株再生与流式细胞仪倍性鉴定
从三倍体葡萄柚中获得 80个果实，剥取 400粒
种子，平均每果实5粒种子，大部分种子败育。经胚
抢救获得 251株再生植株，用流式细胞仪检测其倍
性（图1），最终分别获得二倍体、三倍体、四倍体、五
倍体、六倍体及疑似非整倍体各 172、52、7、1、1、18
株，获得了丰富的不同倍性后代再生植株。
2.2 不同倍性实生后代植株的叶片形态比较
由于母本植株叶片采自田间（图 2），其叶片明
饱种和小种子
5X 6X4X
3X
2X
母本: 3X
15
果 树 学 报 32卷
完全相同（图4）。
3 讨 论
本文采用胚抢救与流式细胞技术从三倍体葡萄
柚后代快速获得了丰富的不同倍性的再生植株，后
代群体中二倍体与三倍体分别为 172和 52株，占后
代群体的89.2%；同时也获得了更高倍性的四倍体7
株，五倍体、六倍体各 1株。Zhu等[15]进行了三倍体
柑橘开放授粉后种子的胚抢救，分别获得了二倍体、
三倍体、非整倍体和四倍体等不同倍性的后代再生
植株；李林光等[16]研究三倍体乔纳金自然后代的倍
性，通过胚抢救获得的后代绝大多数为非整倍体，也
出现了三倍体和四倍体，其后代群体不同倍性间表
型变化明显，易区分。本文获得的后代植株叶片表
现出较大变异，与三倍体母本相比，四倍体、五倍体
和六倍体在叶形、叶表皮都表现出明显的差异，随着
倍性的增加，其叶形更圆，五倍体和六倍体叶表皮更
粗糙、植株生长极缓慢；非整倍体植株则长势很弱，
叶片也明显更小，且部分植株在生长过程中死亡；二
倍体变异也较大，部分植株的翼叶变大，另有一些与
母本相似。前人[17]研究表明，四倍体与二倍体葡萄
柚相比，其生长旺盛，且更丰产。因此，本文获得的
四倍体再生植株可作为优良的新种质资源，同时作
为培育三倍体的中间材料。对于五倍体、六倍体等
倍性的新种质，研究其后期的表型性状（能否开花、
结果等），在理论上将很有意义。
本文以筛选获得的 13对多态性引物对后代来
源进行鉴定，从不同倍性后代的 SSR遗传鉴定结果
可看出，三倍体后代大部分与母本带型完全一致。
由于所选品种为多胚类型，获得的三倍体植株可能
为珠心细胞发育而来。同时获得172株二倍体再生
植株，占后代群体的68.5%。已有研究表明，三倍体
图3 三倍体葡萄柚后代三倍体来源的SSR鉴定
1~2.三倍体葡萄柚；3~11.后代三倍体
Fig. 3 SSR banding pattern for triploid progenies and their
original parent
1 to 2. Maternal parent - triploid grapefruit；3 to 11. Triploid progenies
M3-2
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
图4 三倍体葡萄柚不同倍性再生植株SSR来源鉴定
1，2.三倍体葡萄柚；3.凤凰柚；4.红橘；5.二倍体；6.四倍体；7.五倍体；8.六倍体
Fig. 4 SSR banding pattern for different polyploidy plantlets and their putative parents
1，2. Maternal parent-triploid grapefruit；3. Fenghuang pummelo；4. Red tangerine；5. Diploid；6. Tetraploid；7. Pentaploid；8. Hexaploid
1 2 3 4 5 6 7 8 1 2 3 4 5 6 7 8 1 2 3 4 5 6 7 8
Mab3-96 Csin.0087 M8-9
显较大，其他倍性植株均为1 a（年）生，温室保存，叶
型较小。从植株外观形态观察，多倍体植株生长健
壮，各器官表现出巨大性，叶片更厚，节位较短。四
倍体叶片形如勺状，部分叶片无翼叶，植株明显矮
化；五倍体和六倍体生长缓慢，叶片明显增厚，叶表
皮粗糙（图2）；疑似非整倍体植株生长缓慢，叶片畸
形，部分植株中途死亡。
2.3 SSR分子标记鉴定
对胚抢救获得的三倍体后代与其2株三倍体母
本，用 13对多态性引物对后代三倍体来源进行鉴
定，表明SSR扩增图谱中，大部分后代与母本扩增图
谱完全相同（编号：3、6、7、8、9、10、11），但编号为 4
的植株只有母本的部分遗传条带；编号 5除有母本
的遗传条带外，还有未知的遗传条带（图3）。
对获得的二倍体、四倍体、五倍体和六倍体（三
倍体母本，栽培于三倍体葡萄柚周边的品种—红橘
和凤凰柚），用13对多态性SSR引物鉴定，表明二倍
体除有母本的遗传信息外，还有来自柚的遗传信息
（图 4）。四倍体除有母本的遗传条带外，也包含外
源的遗传信息。五倍体和六倍体与母本的扩增条带
16
1期
在减数分裂时可形成单倍体、二倍体、三倍体等不同
倍性的花粉；但在与异源花粉杂交后，只有形成的二
倍体植株具有较高的活力，从而存活下来，这种推测
可以通过胚乳平衡理论解释[18]。对二倍体的来源鉴
定，从SSR扩增图谱可看出，部分二倍体除有母本的
遗传条带外，还有来自凤凰柚的遗传信息；因此，其
二倍体后代可能是三倍体亲本所产生的单倍体 1x
配子与其周围二倍体凤凰柚品种的花粉授粉而来。
还有某些二倍体扩增条带只包含母本的部分条带，
推测所获得的二倍体后代可能来自三倍体母本产生
的重组型2x配子的无融合生殖[19]。从获得的不同倍
性的杂种后代不难看出，三倍体母本花粉在减数分
裂时染色体配对较复杂，形成了高频率的单倍体、二
倍体、三倍体以及多倍体的配子。Lim等[20]发现，在
百合的3x与2x的杂交组合中，其后代以近二倍体的
非整倍体居多。三倍体品种在减数分裂过程中，产
生的配子大多是不规则的，但可以产生少量不同倍
性的可育配子。Henry等[21]认为，非整倍体对研究倍
性间的相关性、进化遗传等具有重要意义。
4 结 论
从三倍体葡萄柚开放授粉后的实生后代中获得
了数量丰富的不同倍性的再生植株，并鉴定了其不
同倍性后代的遗传组成，并根据遗传分析结果结合
相关理论推测了不同倍性后代的可能来源。
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详/[s.n.]”。
示例：
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《果树学报》参考文献著录格式
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