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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2010 年第 6 期
MSAP技术在植物抗逆性方面的应用
韩雅楠 赵秀娟 蔡禄
(内蒙古科技大学数理与生物工程学院，呼和浩特 014010)
摘 要: DNA甲基化在植物的生长发育中起着重要的作用。近年来，随着对 DNA甲基化研究的重视，基于 PCR方法检
测 DNA甲基化水平的甲基化敏感扩增多态性技术(MSAP)得到广泛的应用。综述了 MSAP技术在植物的生物与非生物胁迫
研究方面的应用。
关键词: DNA甲基化 甲基化敏感扩增多态性 抗逆性
Application of Methylation-sensitive Amplified
Polymorphism Technology in Plant Stress Resistance
Han Yanan Zhao Xiujuan Cai Lu
(School of Mathematics，Physics and Biological Engineering，Inner Mongolia University Science and Technology，Huhhot 010021)
Abstract: DNA methylation plays an important role in plant stress resistance. With the increasing emphasis on the study of DNA
methylation，methylation-sensitive amplified polymorphism(MSAP)technology，which based on polymerase chain reaction(PCR)method
to detect DNA methylation，is widely used in recent years. This paper summarizes the new research advances in aspects of application of
MSAP technology in biological and abiological stress in plants.
Key words: DNA methylation Methylation-sensitive amplified polymorphism Stress resistance
收稿日期:2010-01-18
基金项目:国家自然科学基金(60761001)
作者简介:韩雅楠，硕士研究生，研究方向:分子生物学;E-mail:hanyananokk@ yahoo. com. cn
通讯作者:蔡禄，教授，E-mail:nmcailu@ 163. com
DNA甲基化是表观遗传学的重要研究内容之
一［1］，可以在转录水平抑制基因的表达。甲基化
通常发生在胞嘧啶的 C5 位，形成 5-甲基胞嘧啶
(5mC) ，甲基化的胞嘧啶多位于 CpG 岛上。CpG 岛
是 CpG二联核苷富集区域，CG含量大于 50%，长约
200 － 500 bp。DNA甲基化的信号可被染色质重塑，
组蛋白修饰所调节，从而改变表型性状［2］，因此
DNA甲基化已经成为近年来的研究热点。
早期的基因组 DNA甲基化分析技术，如 SssI甲
基转移酶分析法、氯乙醛反应法、免疫学抗体技术等
已不能满足现代表观遗传学研究的需求。近年来，
常用的基因组甲基化分析方法有高效液相色谱法
(HPLC) ，亚硫酸盐测序法，甲基化敏感的限制性内
切酶结合 Southern 杂交分析法，甲基化敏感扩增多
态性技术(MSAP)等，其中 MSAP 技术因其操作简
单，可检测出样品 DNA 中大量的甲基化位点，多态
性高以及设计引物简单等优点而被广泛应用［3］。
近年来的一些研究表明 MSAP技术在种质资源
的鉴定，种群遗传结构分析，植物进化以及植物品种
的优化等方面得到了广泛的应用。其中在抗逆性方
面的研究，包括非生物与生物胁迫方面的研究，受到
越来越多的科学家们的重视。
1 MSAP技术原理及试验方法
MSAP技术是由 Reyna-Lopez等［4］在 AFLP(am-
plified fragment length polymorphism)技术上建立起
来的，被国内外科学家广泛用于检测水稻、油棕、苹
果、草莓、拟南芥、棉花、香蕉和土豆等植物的 DNA
甲基化。
1 1 原理
MSAP技术常用的两种限制性内切酶 HpaⅡ和
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2010 年第 6 期
MspⅠ，都能识别并切割 CCGG 序列，但对甲基化进
行特异性扩增的位点 5′-CpCpGpG 胞嘧啶甲基化的
反应不同。HpaⅡ对 CCGG 中的任一个胞嘧啶甲基
化都敏感，不能消化含m CCGG，Cm CGG 和m Cm CGG
的位点，但对单链发生甲基化，则能识别切割;而
MspⅠ对内部胞嘧啶的甲基化是不敏感的，而对外
部胞嘧啶的甲基化敏感，也就是说 MspⅠ能切割 Cm
CGG序列，不能切割mCCGG 和m CmCGG 的序列，因
而能够很好的反映基因组 DNA 5′-CCGG 位点胞嘧
啶的甲基化状态和程序［5，6］。
1 2 试验方法
MSAP的试验方法可分别为 4 个步骤［3］，包括
高质量 DNA 的提取，DNA 模板的制备，设计引物
PCR反应，聚丙烯酰胺凝胶电泳分析。其中 DNA的
提取采用改良后的 CTAB方法，提取的 DNA需通过
紫外分光光度计检测纯度和浓度，选择最适宜的
DNA进行后续试验。在模板的制备时需进行双酶
切，用 EcoRⅠ /HpaⅡ和 EcoRⅠ /MspⅠ组合酶切作
为 DNA模板。之后设计引物进行 PCR 反应，引物
设计需满足以下原则［7］:首先，引物长度保持在 15
－ 30 bp，常用的是 18 － 27 bp;不能过长，否则会不
适于 TaqDNA聚合酶进行反应，并以此确定 PCR 反
应的退火温度，而使用确保退火温度不低于 54℃的
最短引物可获得最好的效率和特异性。其次，GC
含量一般为 40% － 60%，通过在 5′端加入适量的
A、T或 G、C 以防止 GC 倾向和 AT 倾向。此外，退
火温度需要比解链温度低 5℃，而碱基数与退火温
度在一定程度上呈反比，可适当提高与降低。最后
经聚丙烯酰胺凝胶电泳后，根据两种酶的性质区别，
反映出不同长度的片段，说明 DNA是否甲基化以及
甲基化程度。
2 MSAP技术在植物抗逆方面的应用研究
MSAP技术作为检测 DNA 甲基化的有效方法
之一，通过近年来的研究统计，关于在植物的抗逆方
面研究 DNA 甲基化变化的课题已经成为研究的热
点，受到越来越多的科学家的重视。
彭海等［8］证明非生物胁迫中的低温、种植密
度、磨擦、切割伤害和继代培养多诱导甲基化水平下
降，这与盐胁迫效应相反，亦有别于重金属胁迫;生
物胁迫如病原菌感染可使植物甲基化整体水平上
升，而抗性相关基因却发生低甲基化，但是二者皆可
用于理解植物的逆境适应。
2 1 非生物胁迫下植物基因组 DNA 甲基化的
变化
2 1 1 环境因素胁迫下植物基因组 DNA 甲基化
的变化 近年来研究报道的环境因素包括盐碱化、
冷胁迫、光暗条件、空间环境以及干旱胁迫等因素，
而关于其机理的研究尚属少数。王磊等［9］研究表
明，在某些环境条件下，植物体内因产生大量的活性
氧而产生氧化逆境，由于其活泼的化学性质，会对细
胞造成严重的伤害，因此去除活性氧有助于提高植
物的抗非生物胁迫的性能。而为了减少逆境的伤
害，植物在进化的过程中形成了酶类和非酶类的抗
氧化系统来抵抗外界逆境条件，维持自身的正常
生长。
由于现今世界上存在着 3 8 亿 hm2不同程度的
盐碱化土地，而高盐可以对植物造成渗透胁迫和离
子胁迫，前者导致土壤水势下降，使植物吸水困难，
甚至迫使细胞脱水，后者影响植物的正常生理代谢，
从而抑制植物的生长发育，甚是导致植物死亡。因
此，植物的适应性以及如何提高耐盐性，已经成为现
今亟待解决的问题之一。一些研究表明植物可以通
过吸收无机物［10］和合成有机物［11］来增强抗盐性，
还可以通过排盐［12］，拒盐［13］来适应盐逆境。李晓
玲［14］利用 MSAP技术对中国松嫩平原的 3 种重要
的耐盐碱牧草在组织培养过程中产生的遗传变异和
基于 DNA 甲基化变异的表观遗传变异进行了比较
分析，分析结果表明短芒野大麦、星星草和朝鲜碱茅
3 种牧草的愈伤组织和再生植株在分子水平上均发
生了遗传变异和表观遗传变异，且二者在有些情况
下密切相关。冯奇志［15］证明了盐或碱处理以及盐
碱同时处理同样可以导致水稻 DNA 甲基化状态发
生改变，并且这种 DNA甲基化状态可以通过减数分
裂进行传递。李雪林等［16］利用 MSAP 技术研究了
盐胁迫下棉花基因组 DNA 的变化，以陆地棉为材
料，表明对于棉花幼苗的株高和根长，不同浓度的
NaCl有显著的促进或抑制作用，而棉花幼苗根部
DNA的甲基化水平与 NaCl 处理浓度呈显著负相
关。曹聪［17］通过分析水稻早期的 DNA甲基化变化
认识了盐胁迫对植物基因组 DNA 甲基化的影响和
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2010 年第 6 期 韩雅楠等:MSAP技术在植物抗逆性方面的应用
作用机理，是能够克服盐害，寻找到提高植物耐盐性
的最好途径和方法之一。
环境温度的改变可诱导植物内源物质的表达，
从而达到植物抵抗外界环境变化的目的，研究其机
制原理可为建立完整的理论体系奠定基础。华扬
等［18］对水稻冷胁迫诱导的甲基化差异片段 CIDM7
进行了分离和分析，发现一些 CCGG 位点重新甲基
化或去甲基化。何艳霞等［19］研究了光暗条件下大
蒜 DNA 甲基化的差异，其模式发生变化，且在不一
致的条带中，光照条件下相同的与黑暗条件下相同
的带型有差异，光照引起大蒜 DNA 去甲基化。
Cervera等［20］认为 DNA 甲基化水平的变化是为了
适应生存环境而变化的一种自我修饰，而这一点研
究还有待进一步证实，因此，环境条件对植物基因组
DNA甲基化的变化还有待人们通过更进一步的理
论与试验研究，建立完整的理论体系。
王连嵋［21］研究了空间环境对水稻蛋白组和
DNA甲基化的影响，通过试验推测出空间环境是通
过影响水稻的 DNA 甲基化变化来影响其蛋白组的
变化。魏雅娇等［22］利用 MSAP 方法研究了水稻干
旱情况下 DNA 甲基化的变化，证明水分胁迫导致
DNA甲基化平均水平明显增加。综上所述，环境因
素是影响 DNA甲基化变化的重要因素之一。
2 1 2 重金属胁迫下植物基因组 DNA 甲基化的
变化 研究已经证实重金属不仅能引起蛋白质损
伤，也与 DNA损伤和 DNA甲基化异常有关，并且重
金属能引起 DNA 断裂［23］，DNA 交联［24］和 DNA 期
外合成［25］。有关重金属对生物体内 DNA甲基化水
平的影响，科学家们已经将重点放在了动物和人的
改变上，而对于重金属胁迫植物体内 DNA甲基化的
研究还有待进一步突破。葛才林等［26］用 MSAP 技
术研究重金属对水稻和小麦的 DNA甲基化的变化，
证明重金属对水稻和小麦叶片蛋白质合成的抑制和
重金属引起的水稻和小麦叶片中 DNA 甲基化水平
的提高相关。
杨金兰等［6］用镉胁迫研究萝卜基因组 DNA 甲
基化的变化，利用 MSAP 技术分析 DNA 甲基化程
度。经不同浓度 CdCl2处理后，MSAP比率及全甲基
化率均高于对照，并且某些位点发生了重新甲基化，
萝卜叶片 DNA中总甲基化水平的增加与 CdCl2处理
浓度呈显著正相关。马红霞等［27］利用 MSAP 技术
研究了重金属镉对拟南芥 DNA甲基化的影响，证明
低浓度 CdCl2促进拟南芥种子的萌发，CdCl2浓度在
0 5 mg /L 时萌发率最高，随着 CdCl2浓度的继续增
加，种子萌发率逐渐下降，而甲基化程度增高。近年
来的有关研究表明进一步研究重金属对植物 DNA
甲基化水平和甲基化位点分布的影响，有着重要的
理论和实践意义。
2 1 3 化学试剂处理与种质导入对植物基因组
DNA甲基化的影响 除了可以利用盐胁迫来分析
植物基因组甲基化的变化，还可通过某些化学试剂
进行胁迫来分析其机理，其中 MSAP 技术也得到了
广泛应用。Akimoto等［28］利用 MSAP技术研究了水
稻种子在 5-氮脱氧胞嘧啶的处理下的 DNA 甲基化
的变化，结果筛选出了抗病品种，并使其得到遗传，
成功地抵抗了疾病的发生。刘静等［29］利用氯乙烯
致使 DNA损伤，并使 DNA 修复基因同时发生了甲
基化。
张勇等［30］利用 MSAP 技术分析了外源种质导
入引发了小麦表观遗传变异，通过染色体工程将外
源种质向小麦基因组转移的过程中，可以诱发受体
物种基因组结构及基因表达的广泛遗传变异。
MSAP技术分析结果表明，易位系材料发生全甲基
化修饰的比例比小麦亲本明显上升，而半甲基化比
例则明显下降。庄婷婷［31］利用 MSAP 技术检测了
NO胁迫诱导水稻 DNA 甲基化变异，证明 NO 在特
定浓度下能定向诱导水稻组织发生去甲基化变化，
尤其是 CpNpG位点的甲基化。此外，一些转座子和
基因在甲基化降低的情况下发生了表达水平的激活
现象，而对于杂交中的去甲基化变化的代表转座子
和基因，又进一步用亚硫酸盐测序检测了其启动子
区域的甲基化水平，同样发现了甲基化水平的明显
降低。
综上所述，MSAP 技术用于检测非生物胁迫下
的 DNA 甲基化水平方面已经得到了广泛的应用。
今后的研究可以考虑致力于针对不同的材料与胁迫
条件而进一步改善此方法，使其更有益于研究。
2 2 生物胁迫下植物基因组 DNA甲基化的变化
内源 DNA甲基化是真核生物表观遗传调控的
重要组成部分，在真核生物的基因表达调控中具有
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生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2010 年第 6 期
重要的作用。生物胁迫为植物提供一种内在的表观
遗传进化动力。研究生物胁迫下 DNA 甲基化的变
异模式，有助于全面理解 DNA甲基化的表观调控生
物学功能［32］。Sha 等［33］研究发现水稻白叶枯病原
菌诱导了 DNA去甲基化现象的发生，并且生物胁迫
与 DNA甲基化之间确实存在一定的联系。张美善
等［34］利用 MSAP 技术检测 DNA 的甲基化，证实
DNA甲基化水平和模式的变化可能随机发生，也有
可能由于杂交产生的胁迫而定向发生。付胜杰
等［35］对叶锈菌胁迫下小麦基因组进行了 MSAP 检
测，分析了小麦的两种材料近等基因系 TcLr19 及其
感病亲本 Thatcher 的甲基化水平，同时比较了苗期
接种叶锈菌生理品种 THTT 前后基因组 DNA 胞嘧
啶甲基化模式，初步证实叶锈菌可能并没有诱导植
物基因组 DNA胞嘧啶位点的甲基化模式变化。
生物胁迫是否会改变植物基因组 DNA的甲基化
模式，其诱导的甲基化模式改变是否会调节植物抗病
基因的表达以及甲基化模式改变是否会参与病原与
寄主互作中的抗病信号转导，还有待进一步研究［32］。
3 结语
近年来，植物 DNA甲基化在逆境中的研究已经
得到越来越多科学家的重视，而利用 MSAP 技术来
检测逆境植物基因组 DNA 甲基化水平和模式变化
的研究在不断的发展完善中。
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2010 年第 6 期 李国娟等:猪流感的诊断技术研究进展
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