全 文 ：收稿日期:2007-12-18
基金项目:国家科技支撑计划(2007BAD59B02)
作者简介:赵峰(1981-),男,河北省藁城市人,在读硕士研究生,主要从事植物基因工程方面的研究
通讯作者:赵德刚,教授,E-mail:dgzhao@gzu.edu.cn;傅永福,研究员,E-mail:fufu19cn@163.com
前言
在植物体内存在生物振荡器,它的存在保证了植物内在生理活动与外界环境基本协调一致[1]。光信号
通过内源生物钟调节光周期反应途径中的基因表达,引发一系列与光有关的生长发育反应[2]。在拟南芥中,
TOC1(TIMINGOFCABEXPRESSION1)被认为是生物钟的关键基因之一,其通过调控其它基因的相互作用
影响生物节律的变化,从而调节光形态反应[3]。有报道认为 TOC1蛋白的稳定性受 ZTL(ZEITLUPE)调节[4]。
因此,检测 TOC1蛋白在拟南芥中的表达情况对解析 TOC1的功能具有重要意义。
检测蛋白含量最有效的方法之一就是利用抗原与抗体特异反应原理进行 Westernbloting分析。因此
制备 TOC1特异抗体就成为研究 TOC1功能的关键。将目的基因或其片段通过构建到相应的载体并使其在
拟南芥TOC1蛋白特异片段原核表达培养基的优化
赵峰 1,2 赵德刚 1 傅永福 2
(1贵州大学生命科学学院 贵州省农业生物工程重点实验室,贵阳 550025;2中国农业科学院作物研究所,北京 100081)
摘 要: 通过正交设计实验,优化蛋白诱导培养基中的有机成分和无机成分及各因素之间的相互组合,将各因素
对拟南芥生物钟重要组成成分TOC1诱导的影响进行方差分析,发现氧气充足和氧气较缺乏时,培养基最佳组合不同。
对各因素进行回归分析得到目的蛋白的培养基最佳配方为:氧气充足时为酵母提取物 19g·L-1,NaCl5g·L-1,Difco
Peptone25g·L-1,CaCl20.092g·L-1,KCl0.372g·L-1;氧气较缺乏时为酵母提取物 19g·L-1,NaCl5g·L-1,葡萄糖 6g·L-1,胰蛋
白胨21.7g·L-1,NaH2PO4·2H2O0.184g·L-1,MgCl20.847g·L-1,KCl0.372g·L-1。通过进一步的试验发现氧气充足时的最佳配
方优于氧气较缺乏时的最佳配方。
关键词: 拟南芥TOC1 原核表达 培养基优化 正交实验
Medium OptimizationforProkaryoticExpression
ofTOC1ofArabidopsis
ZhaoFeng1,2 ZhaoDegang1 FuYongfu2
(1ColegeofLifeScience,GuizhouUniversity,GuizhouKeyLaboratoryofAgriculturalBioengineering,Guiyang550025;
2InstituteofCropSciences,ChineseAcademyofAgriculturalSciences,Beijing100081)
Abstract: Withorthogonalmethodweoptimizedorganicandinorganicingredientsandeveryconceivablecombinationsof
diferentingredientsinthemediumforproteininduction.WeanalyzetheinfluenceofeachingredientontheexpresionofTOC1,
acomponentofclockinArabidopsis,withvariancemethodandwefindthatthefirst-rankcombinationsofmediumarediferentin
theabundanceofoxygenandtheshortageofoxygen.Withregresionanalysisofeachingredient,wegotthebestcombinationfor
proteininduction.ItshowedthatintheconditionofabundanceofoxygenthebestcombinationisYeastextracts19g·L-1,NaCl
5g·L-1,DifcoPeptone25g·L-1,CaCl20.092g·L-1,KCl0.372g·L-1,whileintheconditionofshortofoxygenthebestcombination
isYeastextracts19g·L-1,NaCl5g·L-1,Glucose6g·L-1,Tryptone21.7g·L-1,NaH2PO4·2H2O0.184g·L-1,MgCl20.847g·L-1,KCl
0.372g·L-1.Thefurtherexperimentindicatedthebestcombinationalmediuminabundanceofoxygenisbeterthanthatinshortof
oxygen.
Keywords: AtTOC1 Prokaryoticexpresion Mediumoptimization Orthogonalexperiment
2008年第2期
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN·研究报告·
2008年第2期
表 1 有机成分因素水平表
大肠杆菌中表达目的蛋白的过程叫做外源基因的原核表达,是获得抗原和制备抗体的第一步。原核表达目
的蛋白具有方便、迅速、易于控制及节约成本等优点,因此已得到广泛应用。
外源基因在原核细菌中的表达受很多因素影响,尤其是培养基成分组成及其不同的浓度[5]。现在研究
发现改变诱导培养基对研究不同外源基因在原核细胞中大量表达有一定的作用,ThucT.Le利用 Minimal
培养基[6,7],GaoChun-fang则应用 NZCYM培养基[8],ShenYi研究了 LB培养基、TB培养基、SOC培养基、SOB培
养基对 TNFα-cecropinX蛋白诱导的影响[9],这说明培养基成分影响着外源蛋白的表达。培养基成分通过影
响 EMP途径、TCA循环和蛋白质合成过程中的一些关键因子起作用。例如:葡萄糖、柠檬酸、氨基酸、磷酸
根、Fe2+、Ca2+、Mg2+、K+等因素,直接影响到 ATP、GTP等的合成,从而可能直接或间接影响目的蛋白质合成。
并且研究发现在无细胞体系中加入了 ATP、GTP、CTP、UTP、混合氨基酸能促进目的蛋白的合成[10]。为了促
进外源蛋白高效表达还有一种方法是通过更换原核表达载体[11],但这种方法既花时间又浪费试剂。而外源
蛋白表达诱导培养基成分的优化,大多是通过依次改变培养基单成分,寻找最佳培养基成分组合,不仅耗
费时间,而且随机性较大,不利于获得最佳条件。昊亚丽等[5]利用正交设计研究了培养基的基本成分和离
子成分对外源蛋白诱导的影响,但没有综合分析各因素对蛋白诱导产生的影响以及各成分对菌体内 EMP
途径、TCA循环和蛋白质合成途径产生的影响。
由于 TOC1蛋白质含有一段疏水区域,使用常规的 LB培养基诱导时表达量很低,因此需要根据 TOC1
蛋白质的特点优化培养基成分组成。在进行实验设计时,由于响应面法设计实验时,如果因素水平确定不
理想得出的培养基优化结果也不是最优的,无法进一步分析各因素的影响[12]。而均匀法设计实验,试验次
数虽少,但其只能描述数据型的变量,无法描述逻辑变量。因此,应用正交设计实验及应用数学系统分析方
法,研究了这些因素在不同水平及各因素之间相互作用时对于目的蛋白质表达的影响,进而研究氧气供应
状态对拟南芥生物钟关键成分 TOC1蛋白质表达量的影响。
1 材料与方法
1.1 基因、菌株、质粒、试剂
原核表达菌株为 E.coliBL21star;质粒选用 pDONR201和 pDEST17(Invitrogen);BP反应试剂盒和 LR
反应试剂盒(Invitrogen);IPTG(Sigma);Bactopeptone(BD);胰蛋白胨和酵母提取物(OXOID);混合氨基酸
(Clontech),FeSO4·7H2O(上海化学试剂公司);CaCl2(天津化工三厂);葡萄糖、柠檬酸钠、NaH2PO4·2H2O、
MgCl2、KCl(北京化工试剂公司);硝酸纤维素薄膜 Hybond-ECL(Amersham);脱脂奶粉(伊利);His-抗体
(Novagen);羊抗鼠二抗(PIERCE)。
基本培养基为 LB培养基,诱导培养基以 1.9%酵母提取物和 0.5%NaCl为基本成分[5],其它试剂浓度
水平设置成一定的梯度(如表 1、表 2),然后按照正交表 3设计有机和无机因素的不同组合,最后调节 pH
至 7.0。
赵峰等:拟南芥 TOC1蛋白特异片段原核表达培养基的优化 117
生物技术通报Biotechnology Buletin 2008年第2期
表 2 无机成分因素水平表
表 3 正交试验设计表
注:先对 A、B、C、D、E因素按照表所示不同水平的组合进
行正交试验,在得到 A、B、C、D、E的最佳组合后,再对 F、
G、H、I、J因素进行正交组合优化
1.2 载体构建
利用 Invitrogen公司的 GATEWAY系统构建原核表达
载体。首先,选择拟南芥 TOC1特异片段 ATG下游 475bp~
1440bp,设计 AtTOC1的一对引物:正向引物(AtTOC1-Forw
ard)为:5-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTAATG
GTGGGATCTGATCAAAGTGAT-3和 反 向 引 物 (AtTOC1-
Reverse)为:5-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCT
TATCCATTCGGATGATTTGGTTG-3。
通过 PCR从拟南芥 (Col-0)cDNA中克隆得到目的片
段。按照 Invitrogen的实验程序依次进行 BP反应和 LR反
应,最后得到 pDEST17-AtTOC1原核表达载体。将此载体转
化原核表达菌株 E.coliBL21star,筛选阳性克隆,并保存
于-80℃。
1.3 目的蛋白的诱导表达
首先挑取保存于-80℃的目的菌接种于含氨苄青霉素
(100μg/ml)的 LB培养基中于 37℃,230r/min震荡培养至
OD600=0.6~0.8时,保存于 4℃或直接诱导。目的菌株的诱导
表达都在 100ml三角瓶中进行,首先将上述菌液按照 1:
100的接种量接种至含不同因素、不同水平的诱导培养基
(表 3)中于 37℃、230r/min摇荡培养约 3h,至 OD600为 0.8~
1.0,加入 IPTG至终浓度为 1mM,然后将其置于 30℃[13]、
170r/min震荡培养诱导表达 5h,分别收集 2ml菌体。
诱导条件如下:先通过对可能影响目的蛋白表达量的
10个因素分为有机因素和无机因素依次分别进行正交设计,设定各个因素不同水平,并对每次试验分别
设定空气充足和空气较缺乏两个水平。设定以八层纱布封口的三角瓶为空气充足,以塑料薄膜封口的三角
瓶为空气较缺乏。
1.4 Westernbloting检测目的蛋白的表达量
由于载体 pDEST17中含有 6×His标签及相应的接头序列,总分子量为 8kDa,目的蛋白质为 35kDa,因
此诱导蛋白大小为 43kDa。利用 His抗体,可通过 Westernbloting检测目的蛋白的表达情况。
将上述收集到的菌体用 1×SDS-PAGE上样缓冲液悬浮裂解,于沸水中煮沸 10min,14000r/min离心
6min,各取上清 10μl上样,于 95v电压下进行 SDS-PAGE电泳(浓缩胶 4%,分离胶 12%)。用半干转移仪
(Bio-Rad)于 20v15min将蛋白转移至硝酸纤维素薄膜,然后用 5%脱脂奶粉封闭膜,His-抗体及羊抗鼠二抗
118
2008年第2期
分别杂交 1h,然后于暗室中显影处理 15s,利用 ImageJ软件(htp:/rsb.info.nih.gov/ij/Java1.5.0_09)对照片
进行分析处理,最后对获得的数据做相应统计分析。
2 结果分析
2.1 有机成分对蛋白表达的影响
有机成分葡萄糖、柠檬酸钠、胰蛋白胨、Bactopeptone、氨基酸混合物(表 1)可能参与 EMP途径、TCA
循环或蛋白质合成,或为细菌生长提供氮源,这些成分都可能影响目的蛋白的表达。Westernbloting清晰反
映不同条件下目的蛋白的表达情况(图 1),应用 ImageJ对目的蛋白表达量及相应菌体蛋白上样量进行分
析对比,得到不同条件下蛋白的相对表达量(表 4),并对这些数据进行统计分析得到各组合对蛋白表达量
的影响(表 5和表 6)。
图 1 Westernbloting分析在氧气充足(α、β)和氧气较缺乏(γ、δ)时不同水平有机
成分的条件下目标蛋白的表达情况
α、γ分别为Westernblot杂交结果,β、δ为Coomassiebriliantblue染色图。图上方数字为表C中
的实验号,即不同组合
表 4有机和无机成分因素正交试验设计结果
注:LC是 loadingcontrol的缩写,表示菌体总蛋白上样量,其数值通过 ImageJ分析得到;R1、R2分别代
表有机因素在氧气充足和氧气较缺乏情况下目的蛋白表达量,R3、R4分别代表无机因素在氧气充足
和氧气较缺乏情况下目的蛋白表达量,其数值通过 ImageJ分析得到;表中 R1/LC1、R2/LC2、R3/LC3
和 R4/LC4分别代表每次试验目的蛋白表达量和菌体蛋白上样量的比值
赵峰等:拟南芥 TOC1蛋白特异片段原核表达培养基的优化 119
生物技术通报Biotechnology Buletin 2008年第2期
表 7 氧气充足时无机因素方差分析表
图 2 Westernbloting分析在氧气充足(α、β)和氧气较缺乏(γ、δ)时不同水平无机离子的
条件下目标蛋白的表达情况
α、γ分别为Westernblot杂交结果,β、δ为菌体蛋白的Coomassiebriliantblue染色图。图上方数字为表
C中的实验号,即不同组合
表 5和表 6中的 F值[14]表明,在氧气充足情况下,有机因素的最佳组合为 A2B2C1D4E3;氧气较缺乏时
为 A4B3C2D4E3
2.2 无机成分对蛋白表达的影响
培养基中的磷酸根、Fe2+、Ca2+、Mg2+、K+等无机成分参与能量代谢和蛋白合成途径,并且可能是很重要
的辅基,直接影响目的蛋白的表达。我们在有机成分组成的基础上,通过改变无机成分浓度,同样用
Western杂交方法检测无机成分不同浓度对目的蛋白诱导的影响(图 2)。通过对图 2进行与图 1类似的分
析,获得无机成分的最佳组合(表 7和表 8)。
表 5 氧气充足时有机因素方差分析表
表 6 氧气较缺乏时有机因素方差分析表
120
2008年第2期
表 8 氧气较缺乏时有机因素方差分析表
表 7和表 8中的 F值[14]证明,在氧气较充足的情况下,无机因素的最佳组合为 F1G4H2I3J3;氧气较缺
乏时为 F3G2H2I2J4。
因此,可知氧气充足时各因素最佳组合为 A2B2C1D4E3F1G4H2I3J3;氧气较缺乏时为 A4B3C2D4E3F3G
2H2I2J4。
3 讨论
通过 GATEWAY系统的 BP和 LR反应得到相应的原核表达载体 pDEST17-AtTOC1,并使用正交设计
试验筛选到能促进目的蛋白表达的氧气充足和氧气缺乏时的最佳有机成分和无机成分组合。对各因素进
行显著性分析发现,在氧气充足时,有些因素对试验影响很小,例如 B、E、G、I,可以将这些因素忽略。而在
EMP途径、TCA循环和蛋白质合成中占重要地位的柠檬酸根、磷酸根、钾离子则对试验产生较大影响,因
此氧气充足时的最佳配方为 C1D4F1J3,F因素可以不考虑。而在氧气较缺乏时,柠檬酸根、铁离子、钙离子
的存在对于目的蛋白的诱导表达并不能起到很好的促进作用,但参与 EMP途径的葡萄糖则对蛋白诱导的
影响极其显著,可能与葡萄糖为蛋白质合成提供大量能量和碳源有关。一些离子因素对蛋白的诱导也有一
定影响,此时各因素的最佳配方为 A4B3F3I2J4。
3.1 氧气充足时各因素对 AtTOC1诱导的影响
通过对氧气充足时 C、D、J因素进行回归分析发现,C、D、J因素与目的蛋白的表达呈线性关系,可得
相关方程为:
C因素:y=-3.179x+3.1298;D因素:y=0.2791x+1.9543;J因素:y=0.5712x+0.6623
由 C、D因素的方程可知,两个因素的曲线相交于 x轴的正值区域,因此 C因素和 D因素相互影响进
而影响目的蛋白的表达。而 C因素方程中 x的系数为负值,对蛋白诱导产生负影响。由于方程中 x系数的
绝对值较大,其产生的负效应较大,此时 C因素可以不被考虑。同理可以分析 A因素,发现其产生的也是
负效应,诱导蛋白表达时可以将其舍弃。
H因素对试验的影响并不显著,通过回归分析可知其影响曲线亦为直线,方程为:y=1.0565x+0.726。
x系数为正值,产生正影响,可以将其考虑进去。其曲线与 J因素曲线在 x轴的正值区域不相交,可以推测
H因素与 J因素分别单独影响目的蛋白表达。
因此氧气充足时,目的蛋白表达最佳因素组合为酵母提取物 19g·L-1,NaCl5g·L-1,DifcoPeptone25g·L-1,
CaCl20.092g·L-1,KCl0.372g·L-1,由于 DifcoPeptone、CaCl2、KCl产生的都是正影响,增加三者浓度是否会对
目的蛋白的表达产生影响需要进一步验证。
3.2 氧气较缺乏时各因素对 AtTOC1诱导的影响
通过对氧气较缺乏时 A、B、I、J因素进行回归分析发现,A、B、I、J因素浓度变化和目的蛋白产量呈直
线关系,其方程为:A因素:y=2.0833x+1.133;B因素:y=0.2416x+1.3119;I因素:y=-0.0981x+
1.3662;J因素:y=0.6916x+1.113
并且分析可知 F因素在氧气较缺乏时呈明显的抛物线趋势,可得其方程为:y=-19.819x2+7.3069x+
赵峰等:拟南芥 TOC1蛋白特异片段原核表达培养基的优化 121
生物技术通报Biotechnology Buletin 2008年第2期
0.8753
A因素和 B因素的曲线相交于 x轴的正值区域,可知此时 A因素和 B因素相互作用影响 AtTOC1的
表达。尽管 B因素对目的蛋白表达产生正影响,但通过 F值检验发现第三水平时最佳,因此可能此水平能
很好的促进 A因素发挥作用进而影响目的蛋白表达。
I因素和 J因素的曲线分别与 F因素的曲线相交于 x轴的正值区域,说明三因素相互作用影响
AtTOC1的表达。尽管 I因素产生负影响,但由于其在第二水平时能够更好的促进 F因素和 J因素发挥作
用,因此其存在也是必需的。
通过对 F因素的方程求导得到 F因素 y值最大时 x=0.184,即 F因素的浓度为 0.184g/L时能够最大限
度地促进 AtTOC1的表达。
因此,在氧气较缺乏时,目的蛋白 AtTOC1诱导培养基的最佳组合为酵母提取物 19g·L-1,NaCl5g·L-1,
葡萄糖 6g·L-1,胰蛋白胨 21.7g·L-1,NaH2PO4·2H2O0.184g·L-1,MgCl20.847g·L-1,KCl0.372g·L-1,葡萄糖和
KCl对目的蛋白表达影响的最佳浓度需进一步探索。
综上所述,培养基中氧气的充足与否对目的蛋白的表达会产生很大影响,尤其是各因素水平组成也随
氧气的充足与否变化很大。通过进一步的试验比较发现氧气充足时的最佳配方略优于氧气较缺乏时的最
佳配方,两种配方的目的蛋白表达量可达到 1.5:1.1。
分别分析了有机因素和无机因素对目的蛋白表达的影响及有机因素之间和无机因素之间的相互作用
影响目的蛋白表达的情况,并得到在原核细胞中难表达的蛋白——拟南芥生物钟成分 TOC1的高效表达
配方。研究结果为在细菌中低水平表达蛋白提供了参考。
参考 文献
1 HarmerSL,PandaS,etal.AnnualReviewofCelandDevelopmentalBiology,2001,17:215~253.
2 SimonBarak,ElaineM.Tobin,etal.TrendsInPlantScience,2000,5:517~522.
3 PalomaM s,DavidAlabad,etal.ThePlantCel,2002,15:223~236.
4 PalomaM s,Woe-YeonKim,etal.Nature,2003,426:567~570.
5 昊亚丽,刘冬,等.氨基酸和生物资源,2006,28:76~79.
6 ThucTLe,CalinCGuet,etal.ProteinExpressionandPurification,2006,48(1):28~31.
7 SunChao-hong,SongDan-ying,etal.ProteinExpressionandPurification,2006,48:56~60.
8 GaoChun-fang,KongXian-tao,etal.CelResearch,2001,11:95~100.
9 ShenYi,LaoXue-gang,etal.InternationalJournalofMolecularSciences,2007,8:478~491.
10 TVS.Murthy,WeilinW,etal.ProteinExpressionandPurification,2004,36:217~225.
11 孙军.大学时代,2006,7:130~131.
12 郝学财,余晓斌,等.食品研究与开发,2006,27(1):38~41.
13 LeokadiaBicka,JacekKu′zmak,etal.ActaBiochimicapolonia,2001,48(1):227~232.
14 董如何,肖必华,等.安徽建筑工业学院学报,2004,12(6):103~106.
122