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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2011 年第 9 期
一种高效提取猕猴桃 DNA和 RNA的方法
刘胜洪 刘文 刘明峰 杨凤婷 刘庆生 梁红
(仲恺农业工程学院生命科学学院，广州 510225)
摘 要: 在总核酸提取方法(PS法)的基础上，经多次实践改进，得出一种以高盐低 pH的 HAc-NaAc缓冲体系提取总核
酸的简便方法，可以从富含多糖、多酚的猕猴桃叶片和花蕾中提取同时含有 DNA和 RNA的总核酸。所得的总核酸在 LiCl溶
液中选择性沉淀 RNA，从而有效地分离出 DNA和 RNA样品。紫外分光光度法和琼脂糖凝胶电泳分析表明，所提取的 DNA和
RNA具有较高的纯度和完整性。通过样品 DNA的 PCR和样品 RNA的 RT-PCR，认为所提取的 DNA样品和 RNA样品能够满
足分子生物学试验的基本要求。
关键词: 猕猴桃 DNA RNA 提取方法 SDS
An Efficient Method for Extracting DNA and RNA from
Kiwifruit Leaves and Flower Buds
Liu Shenghong Liu Wen Liu Mingfeng Yang Fengting Liu Qingsheng Liang Hong
(College of Life Sciences，Zhongkai University of Agriculture and Engineering，Guangzhou 510225)
Abstract: Total nucleic acid was extracted through modified PS method from kiwifruit leaves and flower buds and the DNA and
RNA were isolated from the nucleic acid sample． The experimental results showed that the kiwifruit leaves and flower buds，rich in poly-
saccharides and polyphenols，could be easily obtained nucleic acid by extraction solution with HAc-NaAc buffer system at low pH． Then
the genomic DNA and total RNA were separated by selectively precipitating RNA with LiCl solution． Observations based on ultraviolet
spectrophotometry and agarose gel electrophoresis showed high purity and integrity of the DNA and RNA． The DNA and RNA samples
could meet the needs for PCR and RT-PCR analysis．
Key words: Kiwifruit DNA RNA Extraction isolation SDS
收稿日期:2011-02-21
基金项目:广东省自然科学基金项目(8151022501000010)
作者简介:刘胜洪，男，高级实验师，研究方向:果树育种;E-mail:sh-liu01@ 163． com
通讯作者:梁红，男，教授，研究方向:资源植物学;E-mail:lhofice@ yahoo． com． cn
高质量的 DNA和 RNA样品是分子生物学研究
的基础，在植物核酸(包括 DNA 和 RNA)提取过程
中，能否有效地去除材料中的多糖、脂质及酚类物
质，并抑制 DNA酶和 RNA酶活性，是核酸提取效率
及影响核酸样品质量的重要因素［1-3］。
猕猴桃叶片和花蕾是一种富含色素、酚类和
醌等次生代谢物质及蛋白质和多糖等有机大分子
的材料，这些物质不仅影响总 DNA和总 RNA的提
取效率，还干扰以后的反转录和体外扩增。本研
究在改良总核酸提取方法(PS 法)的基础上［4］，从
猕猴桃叶片和花蕾中提取出含有 DNA 和 RNA 的
总核酸溶液;利用 LiCl选择性沉淀 RNA，从而有效
地分离出总 DNA和总 RNA;并通过所提取的 DNA
样品的 PCR 和 RNA 样品的 RT-PCR 核酸样品的
质量分析。
1 材料与方法
1． 1 材料
1. 1. 1 供试材料 本试验所用的猕猴桃材料来自
和平县水果研究所品种试验园的中华猕猴桃“和平
红阳”(Actinidia chinensis‘Heping Hongyang’)雌雄
株。在春季猕猴桃花芽萌动之后，取下幼嫩的猕猴
桃叶片和直径约 4 mm 的雌雄花蕾，用锡箔纸分别
包好，做好标记，放入液氮罐中运回广州，贮存于
－ 80℃超低温冰箱保存备用。
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2011 年第 9 期
1. 1. 2 试剂配制 100 mL 总核酸提取液:含 2 g
SDS、1. 5 g PVP-40、0. 9 g NaCl、NaAc·3H2O 6. 2 g、
HAc 5 mL、4 mL 0. 5 mol /L EDTA(使用时于 35℃水
浴 20 min，摇匀)。
C液:称取 29. 4 g KAc加 11. 5 mL HAc，加 H2O
定容至 100 mL，高温高压灭菌后 4℃保存，待用。
8 mol /L LiCl:称取 42 g LiCl 定容于 100 mL
ddH2O中。
以上试剂均用 0. 1% DEPC 处理的灭菌 ddH2 O
配制。
1. 2 方法
1. 2. 1 总核酸提取 在洗净的研钵中加入 1. 6 mL
总核酸提取液，放入 0. 1 g材料和 1 g石英砂充分研
磨成匀浆，转入 10 mL 离心管中，再用 0. 6 mL 总核
酸提取液洗研钵后转入同一离心管于 65℃水浴
30 min。然后加入 0. 7 mL C 液，充分混匀后于
－ 20℃放置 5 min;取出颠倒摇匀，加入 3 mL氯仿充
分摇匀，4 ℃，12 000 r /min 离心 20 min。取上清液
1. 8 mL加入 1 mL氯仿和 1 mL水饱和酚，充分摇匀
后于 4 ℃、12 000 r /min 离心 15 min;再取上清均分
为两管(约 0. 7 mL /管) ，加等体积异丙醇充分混匀
后于 － 20℃静置 30 min;12 000 r /min 离心 15 min
后弃上清液，用无水乙醇洗涤沉淀;除去乙醇，室温
下晾干后用 100 μL灭菌双蒸水溶解核酸样品。
1. 2. 2 DNA和 RNA 的分离 在核酸溶液中加入
34 μL 8 mol /L LiCl，摇匀后放置 4℃ 下过夜或
－ 20℃ 2 h，以 13 400 r /min 离心 15 min;将上层的
DNA上清液转入另一离心管中，加入 2 /3 体积的异
丙醇沉淀，沉淀的 DNA 用 600 μL 70%乙醇洗 2 次
后溶解于 60 μL ddH2O溶液中;下层的 RNA沉淀用
600 μL 70%乙醇洗 2 次后，倒置离心管，放在室温
下干燥，再用 60 μL水溶解。
取 5 μL 的总核酸、DNA 和 RNA 样品进行
OD260和 OD280测定，并在 1. 2%琼脂糖凝胶上进行电
泳分离。
1. 2. 3 猕猴桃 DNA 的 S1032-850 标记检测 根据
姚春潮等［5］的研究合成猕猴桃 RAPD 雄性标记
(GenBank的登录号为 AY336259)的一对引物:5-
GACGCGAACCACCCACATTTGAG-3(left)和 5-CG-
GCAAGTCGAACCCCACCAAGA-3(right)。PCR 反
应体系(50 μL) :10 × Taq Buffer 5 μL，MgCl2(25
mmol)3 μL，dNTPs(20 mmol)1 μL，Taq polymerase
(5 U /μL)1 μL，引物各 1 μmol /L，模板 DNA 1. 0
μL，ddH2O 37 μL。PCR 反应程序:95℃ 5 min;94℃
45 s，54℃ 45 s，72℃ 60 s，30 个循环;72℃ 10 min;
4℃保存扩增产物。取扩增样品 3 μL在 1. 5%琼脂
糖凝胶上进行水平电泳，分离目的 DNA 带的 DNA
送往 Invitrogen(上海)公司委托测序，并将测得的
DNA 序列在网站 http:/ /www． ebi． ac． uk /Tools /
clustalw2 / index． html 上进行序列比对。
1. 2. 4 猕猴桃 RNA 的 RT-PCR cDNA 合成参照
TaKaRa M-MLV说明书的方法，反应结束后用氯仿 /
水饱和酚(1 ∶ 1)抽提，并加入 1 /10 体积的 3 mol /L
NaAc(pH5. 2) ，再加入总体积 2. 5 倍的无水乙醇沉
淀 cDNA。
PCR 反应体系(体积 25 μL) :PCR buffer 2. 5
μL，Mg2 +浓度为 1. 5 μL，10 ng 模板 cDNA，dNTPs
(10 mmol)1 μL，差异显示引物(表 1)和 Oligo
(dT)16CA锚定引物各 1 μL，Taq DNA polymerase(5
U /μL)1 μL。扩增程序:94℃，5 min;94℃，50 s，
42℃ 50 s，72℃ 60 s，30 个循环;72℃，10 min;4 ℃
1 h。扩增产物在聚丙烯酰胺凝胶［6% acrylamide /
bisacrylamide(19∶ 1)和 7 mol /L尿素溶于 1 × TBE缓
冲液中，pH8. 3］中电泳分离和 0. 1%硝酸银染色及
显色检测［6］。
表 1 差异显示分析引物序列
引物编号 引物序列(5→3)
B0301 TACAACGAGG
B0302 TGGATTGGTC
B0304 TTTTGGCTCC
B0305 GGAACCAATC
B0306 AAACTCCGTC
B0307 TCGATACAGG
B0308 TGGTAAAGGG
2 结果
2. 1 总核酸、DNA和 RNA纯度和完整性检测
用上述方法分别从猕猴桃雌雄株的叶片和花
蕾中提取的总核酸，再分别分离出总 RNA 和 DNA
样品，经紫外分光光度计测定。总核酸样品的
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2011 年第 9 期 刘胜洪等:一种高效提取猕猴桃 DNA和 RNA的方法
OD320值接近 0，其 OD260 /OD230比值介于 2. 615 －
5. 896 之间，说明所提取的总核酸较纯净。RNA
样品的 O D260 /OD280 值在 1. 973 － 2. 225 之间，
DNA 样品的 OD260 /OD280值在 1. 785 － 1. 987 之
间，说明提取的 RNA 和 DNA 纯度较高，没有蛋白
质、多糖等杂质的污染。用 1. 2%琼脂糖凝胶进行
电泳分离，RNA 的电泳图谱中可见到明显的 28S
rRNA和 18S rRNA 两条完整的条带，无明显的拖
尾现象，表明 RNA 样品比较完整。总核酸、总
DNA和总 RNA电泳后，发现各个点样孔清晰无杂
质，无拖尾现象，符合进行 PCR 和 RT-PCR 扩增试
验的要求(图 1)。
1．雄株叶片总核酸;2．雌株叶片总核酸;3．雄花花蕾总核酸;4．雌花花蕾总核酸;5．雄株叶片
总 DNA;6．雌株叶片总 DNA;7．雄花花蕾总 RNA;8．雌花花蕾总 RNA
图 1 猕猴桃总核酸、DNA和 RNA电泳图谱
2. 2 PCR扩增与猕猴桃 S1032-850 标记的研究
根据以上方法，以提取的叶片总 DNA 为模板
进行 PCR 扩增，扩增产物经 1. 5%琼脂糖凝胶电
泳检测，得到了一条约 850 bp 的条带(图 2)。然
后送英潍捷基(Invitrogen，上海)公司测序，每个样
品测序反应为单向，测序长度约为 850 bp。测序
结果(图 3)显示，该条带与 NCBI 网站 GenBank 收
录的 猕 猴 桃 S1032-850 标 记 序 列 (登 录 号:
AY336259)为同源序列。以上结果说明，用此法
提取的总 DNA可以满足猕猴桃分子生物学试验的
需要。
2. 3 猕猴桃雌雄花蕾 mRNA差异显示分析
选用锚定引物 Oligo(dT)16 CA 和 7 个差异显
示引物共 7 个组合，对中华猕猴桃雌雄花蕾进行
mRNA差异显示分析，扩增产物在 6%聚丙烯酰胺
凝胶中电泳、银染及显色。可见，红阳猕猴桃雌雄
花蕾扩增条带主要分布在 100 － 800 bp之间，每组
引物之间大多数扩增条带相同，但是都有一些雌
雄间差异的 cDNA 扩增条带，另外，雌雄花蕾间
还存在一些表达量上差异的条带(图 4)。以上
结果说明，利用本试验方法提取的总 RNA 可以
合成 cDNA 以及进行 RNA 相关的分子生物学
研究。
1．中华猕猴桃红阳雄花花蕾;2．中华猕猴桃红阳雌花花蕾;M．
DNA Marker
图 2 猕猴桃 S1032-850 标记扩增图谱
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生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2011 年第 9 期
图 3 猕猴桃 S1032-850 标记的 DNA序列
M． DNA 分子量标准;1． 雄花花蕾;2． 雌花花蕾;A-G． Oligo
(dT)16 CA 与差异显示引物 B0301、B0302、B0304、B0305、
B0306、B0307 和 B0308 之间的 7 个组合的扩增产物电泳图谱
图 4 中华猕猴桃红阳雌雄花蕾 mRNA差异显示分析图谱
3 讨论
植物 DNA和 RNA提取常用的方法有异硫氰酸
胍法、热酚法、SDS 法、CTAB 法及 Trizol 等试剂盒，
虽然这些方法均能获得较好的提取效果，但是因为
Trizol等试剂盒较昂贵，异硫氰酸胍法、热酚法的试
剂毒害性大，或者是方法操作时间长等，提取效果良
莠不齐，所以针对不同的试验室条件、试验材料和目
的而选用不同的方法［7］。由于碱性条件的提取缓
冲液，减弱了 PVP 的螯合作用［8］，本试验中设计的
核酸提取液呈酸性，pH 值为 4. 9，可有效地增强
PVP对酚类化合物的螯合作用和抑制材料中单宁的
氧化。同时，提取液中的 HAc-NaAc 缓冲体系具有
较高的盐浓度，可以抑制 DNase和 RNase的活性。
提取高质量的 DNA 和 RNA，除需要防止核酸
酶对核酸的破坏之外，还要防止植物组织中多糖、多
酚和醌类等物质对 RNA和 DNA的干扰。从富含多
糖、多酚的植物组织中提取总 RNA，关键在于在提
取过程中能有效地排除 RNase、多糖、蛋白质及多酚
的干扰［9］。由于多糖的许多理化性质与核酸物质
相似，在沉淀 DNA和 RNA时，多糖也随核酸一同沉
淀下来，很容易产生难溶于水的胶状沉淀;单宁、多
酚、醌类物质在酸性条件下极易氧化成红褐色物质，
然后和核酸不可逆地结合，从而为 DNA 或 RNA 样
品的进一步研究带来困难［10，11］。本研究改良了总
核酸提取方法(PS 法) ，在试验过程中发现: (1)在
提取液中增加了 HAc-NaAc缓冲体系，使提取液 pH
值稳定在 4. 9 左右，这种高盐低 pH 的特性可保护
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2011 年第 9 期 刘胜洪等:一种高效提取猕猴桃 DNA和 RNA的方法
核酸不被降解，并有效去除多糖等杂质。(2)利用
本研究的方法在研磨样品时添加石英砂后可以省去
液氮研磨，提取时也未使用 β-巯基乙醇，增加了试
验安全性;(3)提取液中仅适用常规药品配制，省去
了试验过程中添加 DNase I 和 RNase A处理样品时
造成的酶污染，而且节省了试验成本; (4)提取总核
酸后，利用 LiCl选择性沉淀 RNA，使 RNA处于底部
沉淀固相中，而上层液相为 DNA 溶液，可用 1 /2 －
2 /3 体积异丙醇沉淀; (5)在提取液中添加 EDTA，
能够抑制研磨细胞破碎后释放的内源 RNase，从而
降低内源 RNase 降解 RNA 的可能性。(6)本试验
中要求材料少，仅需要 0. 1 g，而且能够同时获得总
DNA和总 RNA，方便于同时对材料进行 DNA 和
RNA分析的试验。
猕猴桃叶是一种含多糖较多的植物材料，提取
高完整性的 RNA和高纯度的 DNA难度较大［12 － 14］。
本试验研究通过对 SDS 提取法的改良，并对所提取
的猕猴桃 DNA进行 S1032-850 引物扩增的研究，准
确扩增出 NCBI 收录的同源序列，以及利用猕猴桃
总 RNA进行雌雄花蕾的 mRNA 差异显示 PCR，获
得较为理想的扩增结果。说明该方法不失为一种简
便有效的猕猴桃 DNA 和 RNA 的提取方法，可作为
其他含较高多糖类物质的植物材料的 DNA 和 RNA
提取的参考。
参 考 文 献
［1］Bekesiova I，Nap JP，Mlynarova L． Isolation of high quality DNA and
RNA from leaves of the carnivorous plant Drosera rotundifolia． Plant
Mol Biol Rep，1999，17(3) :269-277．
［2］李宏，王新力． 植物组织 RNA 提取的难点及对策． 生物技术通
报，1999(1) :36-39．
［3］张志刚，李栒，官春云，等． 改良提取水稻胚乳和拟南芥花柱中
DNA和 RNA的 SDS法．植物生理学通讯，2006(3) :493-495．
［4］刘文，柯辉鹏，梁红．动植物总核酸提取试验．仲恺农业技术学院
学报，2008(3) :17-21．
［5］姚春潮，王跃进，刘旭峰，等．猕猴桃雄性基因 RAPD标记 S1032-
850 的获得及其应用． 农业生物技术学报，2005，13 (5) :
557-561．
［6］王关林，方宏筠．植物基因工程原理与技术［M］．北京:科学出版
社，1998:525-526．
［7］钟凤林，郭志雄，马传营，等． 琯溪蜜柚汁胞 RNA 提取方法的比
较．生物技术通报，2010(2) :109-112．
［8］Loomis WD，Battaile J． Plant phenolic compounds and the isolation of
plant enzymes． Phytochemisty，1966，5(1) :423-438．
［9］淳俊，郑彦峰，王胜华，等．一种广泛适用的 RNA提取方法．生物
化学与生物物理进展，2008，35(5) :591-598．
［10］何振艳，徐文忠，杨学习，等．提取蕨类植物蜈蚣草总 RNA的一
种有效方法．植物学通报，2005，22(2) :198-202．
［11］陈宏林，王玺，何振艳．一种提取高质量红树植物总 RNA 的有
效方法．中国生物工程杂志，2010，30(6) :84-88．
［12］梅晓宏，高红岩，罗云波．提取猕猴桃果实总 RNA的新方法．中
国食品学报，2007，7(3) :55-57．
［13］陈昆松，徐昌杰，张上隆． 富含多糖猕猴桃果实组织中总 RNA
提取方法的改进．植物生理学通讯，1998，34(5) :371-373．
［14］丁建，董晓莉，郑晓琴，等．一种简便高效提取猕猴桃 DNA的方
法．资源开发与市场，2006，22(5) :401-403．
(责任编辑 马鑫)
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