全 文 ：生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN·研究报告· 2008年第4期
收稿日期:2007-02-29
基金项目:国家自然科学基金项目(30371101)、教育部留学回国人员科研启动基金项目、上海市浦江人才计划项目(05PJ14086)
作者简介:陈翠芬(1980-),女,山东菏泽人,硕士研究生,主要从事海洋生物学研究;E-mail:cfchen@stmail.shfu.edu.cn
通讯作者:何培民,教授,Tel:021-65710364,E-mail:pmhe@shfu.edu.cn
紫菜(Porphyra)是世界上最重要的人工栽培海藻,其年产值约 18亿美元[1]。我国是紫菜栽培大国,年产
量已为世界第一[2]。紫菜育苗是紫菜栽培关键并决定全年生产成败。常规紫菜育苗技术通常受到海况气象
条件和育苗管理水平的制约,往往在幼苗最佳下海时段不能及时提供大量苗种,目前已很大程度上制约
外界因子对条斑紫菜自由壳孢子囊枝形成和生长影响
陈翠芬 李信书 杨玲 王兰刚 何培民
(上海水产大学农业部水产种质资源与养殖生态重点开放实验室,上海 200090)
摘 要: 主要研究了不同光照周期(8L:16d、12L:12d和 16L:8d)、不同温度(15℃、20℃和 25℃)、不同光照强度
(29、42、57、72和86μmolm-2·s-1)等外界因子对条斑紫菜自由丝状藻丝切断诱导形成壳孢子囊枝影响,以期获得条斑紫
菜壳自由孢子囊枝形成的最佳外界条件。结果表明,在25℃和57μmolm-2·s-1条件培养30d后,短日照(8L:16d)对壳孢子
囊枝诱导形成效果最好,其壳孢子囊枝形成率高达92.5%,50d后几乎达到100%;在25℃和短日照条件培养 30d后,光照
强度为57μmolm-2·s-1时,壳孢子囊枝诱导形成率达到最高(92.2%),光照强度过高过低均不利壳孢子囊枝形成;在
57μmolm-2·s-1和短日照条件下,当温度为25℃时,壳孢子囊枝形成率最高,形成率随温度下降而减少。在12L:12d光照
周期、57μmolm-2·s-1光照强度和25℃温度条件下,自由壳孢子囊枝生长最快,其日平均相对生长率可达54.43%。以上研
究为实现紫菜细胞工程育苗新技术-自由壳孢子囊枝育苗奠定了坚实基础。
关键词: 条斑紫菜 外界因子 自由壳孢子囊枝 形成 生长 温度 光照强度
EfectofExternalFactorsonFormationandGrowthofFree-
livingConchosporangiainPorphyrayezoensis
ChenCuifen LiXinshu YangLing WangLangang HePeimin
(TheKeyLaboratoryofAquaticGeneticResourcesandAquaculturalEcosystemCertificatedbyTheMinistryof
Agriculture,ShanghaiFisheriesUniversity,Shanghai200090)
Abstract: Inthispaper,efectsofexternalfactorsofdiferentphotoperiod(8L:16d,12L:12dand16L:8d),
temperature(15℃,20℃,25℃)andlightintensity(29,42,57,72and86μmolm-2s-1)onthefree-livingconchosporangia
formationfrom free-livingconchocelisfilamentcutingsandgrowthinPorphyrayezoensisHB,linewerestudied.When
free-livingconchoceliswereculturedat25℃ and57μmolm-2·s-1 for30days,theformation ratesoffree-living
conchosporangiainshortphotoperiod(8L:16d)groupswerethehighest,ashighas92.5%.Whentheywereculturedfor
morethan50days,formationratesreachedupto100%.Culturedat57μmolm-2·s-1 and8L:16dfor30days,the
formationratesoffree-livingconchosporangiain57μmolm-2s-1lightintensitygroups,were92.2%.Iflightintensitywas
toohighortoolow,theconchosporangiaformationwouldbeinhibited.With57μmolm-2·s-1 and8L:16d,formation
ratesoffree-livingconchosporangiaat25℃ groupswasthehighest,andfree-livingconchosporangiaratewoulddecrease
with temperaturesdecreasing.At57μmolm-2·s-1,12 L:12d and 25℃ ,daily relative growth rate offree-living
conchosporangiareachedashighas54.43%.Thestudydatawouldlayanimportantfoundationforfurtherdevelopment
ofnewbreedingtechnologyusedforfree-livingconchosporangia.
Keywords: PorphyrayeroensisExternalfactorsConchosporangia Formation Growth Photoperiod
Temperature Lightintensity
2008年第4期
了紫菜产业的发展,因此迫切需要海藻生物技术对常规紫菜育苗方式进行改进[3]。王素娟和何培民[4,5]曾应
用细胞酶解技术和单细胞培养再生技术,成功地创建了紫菜体细胞育苗技术,其育苗周期需要 20多天,但
因工艺复杂以及酶成本太高,未能在生产上得到广泛应用。目前我国正在应用海藻组织培养技术发展一种
新的紫菜细胞工程育苗技术-紫菜自由壳孢子囊枝育苗技术[6]。陈国宜等[7]首先采用组织培养技术,最早成
功地研究了自由丝状体生产性育苗技术。该技术不需酶,但涉及到丝状体生长发育调控等复杂因素,至今
该项育苗技术也未能在生产上推广应用。如何诱导提高紫菜自由壳孢子囊枝形成率和壳孢子同步放散一
直是紫菜细胞工程育苗新技术-紫菜自由壳孢子囊枝育苗技术关键。目前国内外主要单一地研究了盐度[8]、
温度[9~13]、光照强度[8,9,11~14]、光照周期[13]、色光[15]和营养盐——氮[8,15]、磷[8,17]、铁[8]以及 pH值[8]等生态因子对
自由壳孢子囊枝形成的影响。其中汤晓荣和费修绠[9]研究了光强和温度对紫菜丝状体发育影响;陈烨[17]等
研究了不同浓度、不同形式的磷源对坛紫菜壳孢子囊枝形成的影响;杨玲和何培民[16]研究了光照强度与培
养密度对条斑紫菜自由壳孢子囊枝放散壳孢子的影响。He和 Yarish[19]曾应用紫菜细胞工程技术成功地建
立了一种北美紫菜(P.leucosticta)壳孢子囊枝育苗技术。但目前对条斑紫菜自由壳孢子囊枝形成与生长影
响的缺乏系统研究,自由孢子囊枝育苗技术至今还未能规模化应用于生产上。因此,采用丝状体组织培养
技术,较为系统地探讨了不同温度、光照周期、光照强度等因子对条斑紫菜自由丝状藻丝切断诱导形成壳
孢子囊枝及其生长的影响,其中对条斑紫菜壳孢子囊枝生长的影响是首次报道,这为建立条斑紫菜壳自由
孢子囊枝育苗新技术奠定了基础。
1 材料与方法
1.1 藻种与培养条件
实验材料条斑紫菜(Porphyrayezoensis)为上海水产大学生命学院海藻生物技术实验室筛选和保存的
抗高温株 HB丝状藻球[18]。培养方法参照 He和 Yarish[19]文献,在超净工作台将丝状藻球切割到 100μm左
右长度的丝状体,放入光照培养箱中培养。培养条件为:光照强度 40μmolm-2·s-1,温度 20℃,光照周期 16L:
8d,无菌充气培养,培养液为 VSE,每周更换培养液一次。收集生长旺盛的丝状体用于实验。
1.2 光周期对自由壳孢子囊枝形成的影响
适量自由丝状体放入盛有 VSE培养液的容积为 5ml的青霉素瓶中,并放置于光照培养箱中培养,设置
16L:8d,12L:12d,8L:16d等 3个不同光照周期组,每个光照周期组设 2个平行,温度(25℃)和光照强度
(57μmolm-2·s-1)均相同,每天摇瓶 2次,每周更换培养液,并在显微镜下检测自由壳孢子囊枝形成的比例,
自由壳孢子囊枝形成检测和计算方法均参照 He和 Yarish[19]文献。
1.3 温度对自由壳孢子囊枝形成的影响
适量自由丝状体放入盛有 VSE培养液的容积为 5ml的青霉素瓶中,温度设置为 15,20和 25℃3个梯
度组,每个梯度组 2个平行,光照周期为 8L:16d,光强 57μmolm-2·s-1,每天摇瓶 2次,每周更换培养液,并
在显微镜下检测自由壳孢子囊枝形成的比例。
1.4 光照强度对自由壳孢子囊枝形成的影响
适量自由丝状体放入盛有VSE培养液的容积为5ml的青霉素瓶中,光强设置29、42、57、72、86μmolm-2·s-1
5个梯度组,每个梯度组 2个平行,光照周期为 8L:16d,温度 25℃,每天摇瓶 2次,每周更换培养液,并在显
微镜下检测自由壳孢子囊枝形成的比例。
1.5 温度和光照周期对自由壳孢子囊枝生长的影响
0.1g自由壳孢子囊枝放入盛有 200ml培养液的容积为 250ml的三角烧瓶,光照周期设置 8L:16d、12L:
12d、16L:8d3个组,温度为 15,20和 25℃3个梯度组,光照强度为 57μmolm-2.s-1,培养初始和结束时称量
自由壳孢子囊枝干湿重。每个梯度组设两个平行。
1.6 光照强度对自由壳孢子囊枝生长的影响
陈翠芬等:外界因子对条斑紫菜自由壳孢子囊枝形成和生长影响 167
生物技术通报Biotechnology Buletin 2008年第4期
1.5g湿重的自由壳孢子囊枝放到装有 3000ml培养液的 3000ml容积三角烧瓶中培养 2周,设置 57、
86、114μmolm-2·s-13个光照强度梯度组,每个光照强度设 2个平行。光照周期为 12L:12d,温度为 25℃,实
验结束后称量各个瓶中培养物的干湿重。
1.7 数据处理
试验数据用 SPSS11.0统计分析软件和 T检验进行显著性差异分析。
2 结果
2.1 光照周期对自由壳孢子囊枝形成的影响
光照周期对自由丝状藻丝诱导形成壳孢子囊枝具有重要影响。从图 1可以看出,在 25℃,57μmolm-2·
s-1条件下,丝状体经过一个月的培养,8L:16d,12L:12d和 16L:8d3个光照周期组形成的自由壳孢子囊枝
比例分别是 92.5%,83.5%和 26.5%。经方差分析不同光周期对其影响极显著(P<0.01)。继续培养到第 40d,
在短日照(8L:16d)条件下,自由壳孢子囊枝的比例可以达到 100%。此时在中日照(12L:12D)和长日照
(16L:8d)条件下,自由壳孢子囊枝的比例分别可以达到 90%和 27.1%。
2.2 温度对自由壳孢子囊枝形成的影响
图 2显示了温度对自由壳孢子囊枝形成具有重要作用。丝状藻丝在适宜的光强和光周期条件下培养
1个月,25℃条件下自由壳孢子囊枝形成的比例最高,达到了 92.5%,20℃和 15℃其次,分别为 54%和 33%。
经方差分析不同温度对自由壳孢子囊枝形成影响差异极显著(P<0.01)。
图 1 光照周期对自由壳孢子囊枝形成的影响 图 2 温度对自由壳孢子囊枝形成的影响
2.3 光照强度对自由壳孢子囊枝形成的影响
光照强度对自由壳孢子囊枝形成影响的实验结果见图 3。实验表明,57μmolm-2·s-1光照强度条件下培
养 1个月,自由壳孢子囊枝的形成比例最高,达到 92.5%。光照强度太高或太低均不利于壳孢子囊枝形成。
72μmolm-2·s-1自由壳孢子囊枝比例也达到 84.2%,86μmolm-2·s-1条件下只有 27%。42μmolm-2·s-1和
29μmolm-2·s-1组形成自由壳孢子囊枝比例分别只有 61%和 53%。方差分析不同光照强度对其影响极显著
(P<0.01)。
2.4 温度对自由壳孢子囊枝生长的影响
悬浮培养的自由壳孢子囊枝在两周后检测的生长情况见图 4。在 12L:12d,57μmolm-2·s-1条件下,15、
20和 25℃3个温度组的自由壳孢子囊枝日平均相对增长率分别为 25.7%,34.03%和 54.43%。由此可见,
温度越高,自由壳孢子囊枝生长越快。经方差分析不同温度对其影响极显著(P<0.01)。
2.5 光照周期对自由壳孢子囊枝生长的影响
从图 4还可以看出,各种温度条件下,12L:12d光照周期组的自由壳孢子囊枝日平均相对增长率均最
大,其中 25℃组的自由壳孢子囊枝形成比例可达到 54.43%,而 8L:16d和 16L:8d光照周期条件下自由壳
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孢子囊枝日平均相对增长率均处于较低水平,分别为 22.31%和 16.65%。经方差分析不同光照周期对其影
响极显著(P<0.01)。
图 4 温度和光照周期对自由壳孢子囊枝生长的影响
图 3 光照强度对自由壳孢子囊枝形成的影响
2.6 光强对自由壳孢子囊枝生长的影响
采用 3000ml三角烧瓶培养自由壳孢子囊枝,3个光照强度对自由壳孢子囊枝生长影响的实验结果见
图 5。结果表明,86μmolm-2·s-1条件下自由壳孢子囊枝的日平均相
对生长率最高,可达到 40.18%。光照强度过高或过低均对自由壳
孢子囊枝生长不利。114μmolm-2·s-1和 57μmolm-2·s-1条件下,壳孢
子自由壳孢子囊枝的日平均相对生长率分别为18.91%和26.23%。经
方差分析不同光照强度对其影响极显著(P<0.01)。
3 讨论
紫菜自由壳孢子囊枝发育调控是紫菜细胞工程自由壳孢子囊
枝育苗技术的关键和核心[16]。曾用 5000ml三角瓶较大规模培养条
斑丝状藻丝切断,在光照周期为 8L:16d、温度为 25℃、光照强度为
57μmolm-2·s-1条件下培养 50多天,其丝状藻丝切断可完成形成自
由壳孢子囊枝,表明条斑紫菜自由丝状藻丝切断在一定条件下培养,可通过发育调控全部(100%)形成自
由壳孢子囊枝,这是继 Porphyralecosticta报道后[17]第 2个紫菜种类。丝状藻丝切断完全形成壳孢子囊枝对
于紫菜自由壳孢子囊枝育苗技术十分重要,表明壳孢子囊枝可以规模化培养并实现发育同步化,为下一步
壳孢子同步大量放散奠定了坚实基础。
为了获得高比例的自由壳孢子囊枝,光照周期、温度、光照强度等外界因子的调节均十分重要[19]。本实
验结果表明光照周期、温度、光照强度对条斑紫菜丝状藻丝完全形成自由壳孢子囊枝均具有同等重要作
用,不能忽视其中任何一个因子。这与 Orfanidis[20]、He和 Yarish[19]等研究 Porphyraleucosticta的结果相同,但
温度和光照强度均高于 Porphyraleucosticta自由壳孢子囊枝。在短日照条件下,当温度为 20℃和光照强度
为 30μmolm-2·s-1,Porphyraleucosticta丝状藻丝则完全形成了自由壳孢子囊枝以往研究中,对于壳孢子囊枝
诱导形成外界因子多只关注光照周期和温度,而对光照强度很少研究[20,22~25]。结果表明,光照强度对自由壳
孢子囊枝诱导形成影响很大,其自由壳孢子囊枝形成最低比例为 27%,而最高比例可达 92%,最高比例与
最低比例相差 3倍。一般说适当提高光强有利于自由壳孢子囊枝形成,将各个环境因子调控到最适宜状态
才有利于自由壳孢子囊枝快速大量形成。
目前对自由丝状藻丝生长研究较多[11,12],而对自由壳孢子囊枝生长研究较少[16]。本实验首次研究了温
度、和光照强度等因子对条斑紫菜自由壳孢子囊枝切断生长影响。其结果表明,温度 25℃、光照周期 12L:
图 6 光强对自由壳孢子囊枝生长的影响
陈翠芬等:外界因子对条斑紫菜自由壳孢子囊枝形成和生长影响 169
生物技术通报Biotechnology Buletin 2008年第4期
12d、光照强度 86μmolm-2·s-1条件下自由壳孢子囊枝切断生长最快,其自由壳孢子囊枝切断的日相对生长
率可以高达 54.43%,倍增时间只需 2d。且已有实验证明,自由壳孢子囊枝切断营养生长繁殖后仍可以放散
壳孢子[16],这为今后直接应用自由壳孢子囊枝大规模扩增培养用于苗种生产奠定了基础。
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