全 文 ：生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN·技术与方法· 2008年第3期
收稿日期:2007-11-26
基金项目:云南省烟草专卖局(公司)资助项目(04A10)
作者简介:尚志强(1964-),男,河南安阳人,助理研究员,主要从事烟草育种与栽培研究;E-mail:zhqshang@yntsti.com
烟草(Nicotianatabacum)为茄科属一年生或多
年生作物。经过多种生态环境条件的驯化和人工选
择培养,以及不断的从国外引进,已形成丰富多彩
的品种资源。但对烟草种质资源深度研究不够,创
造利用较少,烟草育种面临亲本匮乏,品种遗传背
景狭窄,肓目性、重复性大等问题[1]。遗传多样性是
一个需要用种、变种、亚种或品种的遗传变异来衡
量其内部变异性的概念,遗传多样性为物种和个体
的适应及进化提供原料。利作 DNA分子标记技术
有肋于从本质上揭示物种遗传变异及其变异规律。
因此从发子水平上揭示烟草遗传资源多样性及其
亲缘关系,建立分子标记辅助育种技术体系非常必
要。
DNA分子标记是 DNA水平上上遗传多样性的
直接反映,DNA水平上遗传多样性表现为核苷酸
序列的任何差异。因而,DNA分子标记在数量上几
乎是无限的。其主要优点是无表型效应,不受环境
影响等。目前,DNA分子标记已广泛应用于作物种
资源源遗传图谱构建、基因定位和分子标记辅助选
择等方面[2]。在烟草质资源研究应用的分子标记主
要有 RAPD、AFLP、ISSR。研究采用分子标记技术对
不同来源的烟草种质资源的遗传多样性和亲缘关系
进行研究,以期从分子水平为烟草品种鉴定、遗传分
类、品种布局及合理选配亲本等提供科学依据[3]。
1 DNA分子标记的概念
遗传标记是指与目标性状紧密连锁,同该性状
共同分离且易于识别的可遗传的等位基因变异,是
基因型的特殊的易于识别的表现形式[4]。目前遗传
标记主要有形态标记、细胞标记、生化标记和分子
标记4种类型。前 3种标记是对基因的间接反映,而
DNA分子标记是 DNA水平遗传变异的直接反映。
2 DNA分子标记的类型
DNA分子标记大多以 DNA片段的电泳谱带形
式表现,依其遗传特性可分为显性和共显性 2种;
分子标记技术在烟草种质遗传多样性研究中的应用进展
尚志强
(云南省烟草科学研究所,玉溪 653100)
摘 要: DNA分子标记作为新发展起来的一种遗传标记形式,凭借其可靠有效等优点,在农业科学研究中的应用
越来越广泛。综述了几种分子标记技术(RAPD、AFLP、ISSR)在烟草种质资源中的应用进展,分析了分子标记技术在烟草
种质资源及遗传多样性研究中存在的问题及今后发展方向。
关键词: 分子标记 烟草 遗传多样性
ProgressoftheApplicationofMolecularMarkersinTobacco
ResearchRelatedtoGrezmplasm GeneticDiversity
ShangZhiqiang
(YunanTobaccoScienceResearchInstitute,Yuxi653100)
Abstract: Asanewlydevelopedgeneticmarker.DNA molecularmarkerisincreasing1yusedinagricultural
research.Theapplicationanddevelopmentofmolecularmarkers,includingRAPD,RFLP,ISSR,thecurentadvanceof
tobaccogermplasm researchwaspresented,andtheperspectiveandthequestionofmolecularmarkersapplicationin
tobaccodiversityinthefuturewerediscused.
Keywords: Molecularmarker Tobacco Geneticdiversity
生物技术通报Biotechnology Buletin 2008年第3期
依其多态性检出所用的分子生物学技术,大致可分
为 3类:以 Southern杂交技术为核心的分子标记技
术,如 RFLP;以 PCR技术为核心的分子标记技术,
如随机扩增多态性 DNA (RandomAmplifiedPoly-
morphicDNA,RAPD)、扩增片段长度多态性(Am-
plifiedFragmentLengthPolymorphism,AFLP);以 DNA
重复序列的标记为核心的分子标记技术[5]。这 3类
分子标记的划分不是绝对的,有的分子标记介于第
1和第 2类之间,有的是两种技术的结合;有的把
第 3类归于 1、2类中。
3 分子标记在烟草种质遗传多样性研究中
的应用
3.1 烟草基因组 RAPD标记的遗传多样性研究
Wiliams[6]和 Welsh[7]等通过利用随机引物扩增
基因组 DNA来寻找具有多态性的 DNA片段,并将
这一方法命名为随机扩增多态性 DNA(randomam-
plifiedpolymorphismDNA,RAPD)。相对于传统的酶
学、RFLP等方法,RAPD具有最快速、简便和无需
预知受试基因组 DNA序列[8]等优点,并且避免了放
射性同位素的污染。RAPD标记还可以对那些
RFLP难以区分的基因组区域作遗传连锁图。但
RAPD标记也存在某些不足,其中最主要的是其重
复性不太令人满意。另外,RAPD标记难以区分开
杂合子和纯合子基因型。RAPD尽管比 RFLP、VN-
TR等检测方法诞生的晚,但由于其具有以上特点,
而被广泛地应用于群体间遗传关系的确定以及分
析 RAPD标记和数量性状座位(QTL)的连锁关系[9]。
RAPD技术已成功地应用于鉴定一系列烟草
基因,以及这些基因在烟草育种中的调控。随着这
些新技术在农业研究中不断发掘利用,将会大大加
快烟草育种速度与进程。肖炳光[10]等利用 RAPD标
记研究了 29个烤烟品种的分子指纹和遗传关系。
100个随机引物经 10个品种筛选,选 18个随机引
物,利用这些引物对 29个品种基因组 DNA扩增,
得到了 29个烤烟品种的分子指纹图谱,参照这些
图谱,对不同烤烟品种进行真实性鉴定,以扩增到
的 79条多态性为基础,计算 29个品种间遗传相似
系数,利用 UPGMA法作聚类图,可将参试品种分
为 3个类型群,其中云南省主栽烤烟品种 K326与
近年选育的 V2、云烟 87和云烟 317等归为一类;
北方烟区主栽品种 NC89、地方品种净叶黄及 G140
归为一类。汪志德等[11]对 24个不同类型烟草核心
种质进行了 RAPD标记,通过聚类分析,将 24个种
质分为 6大聚类群,类群Ⅰ包括 K326、红花大金
元、大白筋 599、TN90等 11个种质;类群Ⅱ包括
NC82、B21、Md609等 9个种质;类群Ⅲ、Ⅴ分别包
含晒烟、黄花烟各一个;Ⅳ、Ⅵ为 2个野生种。各类
群遗传差异由大到小顺序为Ⅵ>Ⅴ>Ⅳ>Ⅲ>Ⅱ>Ⅰ。
3.2 烟草种质资源的 AFLP分析
扩增片段长度多态性 ALFP(amplifiedfragment
lengthpolymorphism)是 1992由 Zabeau和 Vos发展
起来的新一代分子标记技术,其本原理是对基因
DNA进行双酶切,酶切片段与含有与其共同粘性
末端相连接,分别选择在 3′末端分别添加 1～3个
选择性碱基的不同引物,选择性的识别具有特异配
对顺序的酶切片段并与之结合,从而实现特异性扩
增。它结合了 RFLP和 RAPD的优点,既具有前者
的可靠性又具有后者的方便性。
杨友材等[3]对 48份烟草材料的基因组 DNA进
行选择性扩增,共获得 321条扩增带,其中 174条
具有多态性。对 AFLP扩增结果采用 UPGMA法进
行聚类分析,可以将 48份烟草资源分为 2大类群,
即黄花烟草群和普通烟草群,普通烟草可进一步分
为 4组:48份材料的遗传距离变幅为 1.41~11.0之
间。
3.3 ISSR标记在烟草种质遗传多样性与亲缘关
系中的研究
ISSR标记是 Zietkiewicz等[12]提出的一种 DNA
分子标记,由于其在 SSR的
3′端或 5′端锚定 1~4个简并碱基,所用的引物
序列比 RAPD的引物序列长,退火温度较高,不但
具有 RAPD技术的优点,又可克服 SSR和 RAPD技
术的缺点。
祁建民等[13]采用 ISSR标记,对烟草属 4个种
30份材料的遗传多样性进行了分析。从 70个 ISSR
引物中共筛选取出 16个多态性明显、条带清晰、反
应稳定的引物,对 30个样品 DNA共扩增出 309条
谱带,平均每个引物扩增出 19.31条带,多态性条带
比率(PPB)93.20%。种间遗传相似系数在 0.26~0.96
之间,表现出丰富的遗传多态性。而肖炳光等[10]用
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18个 RAPD引物 29份烟草材料进行扩增出 128条
带,平均每个引物扩增 6.72条带,多态性条带比率
为 65.3%;许明辉等[14]对 23份烟草材料进行 RAPD
扩增,16个引物共扩增出 128条带多态性比率为
35.94%。由此可见,ISSR可以比 RAPD检测到更多
的的遗传多态性,即其检测遗传多态性的能力更
高。
4 讨论与展望
4.1提高分子标记在烟草种质资源研究中的高
效性和有效性
RAPD技术用于烟草种质资源的分析效率比
较低,同时由于 RAPD技术对反应条件极为敏感,
其稳定性和重复性一直受到人们的怀疑。AFLP是
随后发展较快的 DNA指纹技术,特别是近年来
AFLP银染技术的发展,大大简化了实验流程,克服
了使用放射性同位素的缺点,AFRP技术也因此成
为研究遗传多样性的最有力工具。
4.2烟草种质资源的遗传多样性
现有的烟草育种使用的亲本主要是 K326、红
花大金元、G28、净叶黄等品种的血缘,导致了中国
育成的烤烟品种的遗传基础日益狭窄。因此,要进
一步收集种质资源,有待于开发新型分子标记,大
力开展分子标记在烟草中的应用研究,建立并优化
相应的分子标记应用体系,为烟草研究提供更为精
确的遗传标记。
参考 文献
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尚志强:分子标记技术在烟草种质遗传多样性研究中的应用进展
孟山都大力支持耶鲁-北京农业生物技术中心
AgBiotech Reporter 2008年25卷1期13～15页报道:耶鲁大学-北京大学联合中心为便于进一步理解植物
生物学,从而旨在改良农作物的生产,已从孟山都公司对联合中心获得为期5年之久的继续支持。
孟山都公司已对北京大学-耶鲁大学植物分子遗传学和农业生物技术联合中心投入了一系列的人才交流和
一系列的植物生物学相关计划,以及相应的作为全球科学合作新模式的跨学科研究计划的资金。孟山都公司将为
北京大学-耶鲁大学联合中心的过去和未来提供或支持了总共超过百万美元的资金。
根据耶鲁大学宣布的新闻,北京大学已于2001年创办了联合中心伊始,该校各个独立的研究团体已开始利
用其共同的设备、资金和专业技术。北京大学校长许智宏教授还说:“孟山都公司一直很支持中国的生物技术”。
汪开治
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