全 文 ：生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN·研究报告· 2008年第5期
收稿日期:2008-03-10
基金项目:国家自然科学基金(30471207)
作者简介:李敬阳(1976-),硕士,专业方向:生物技术;E-mail:aylwin.lee@yahoo.com.cn
通讯作者:金志强(1962-),博士生导师,研究方向:果树生物技术;E-mail:zhiqiangjin2001@yahoo.com.cn
在利用香蕉雄花建立无性再生体系中,诱导出愈伤组织后,再经农杆菌浸染继而诱导胚状体的过程
中,经常出现褐化甚至死亡现象,这也是香蕉转基因效率较低的原因之一[1]。 香蕉体外微繁殖,外植体培
养过程中常常由于酚类物质释放且在培养基中积累造成培养基黑化。这一过程最初是由于外植体表面褐
化引起[2]。因此,外植体褐化成为单子叶植物和木本植物再生体系建立时一个倍受关注的问题[3,4]。George[5]。
阐述了运用抗氧化来抑制不稳定底物氧化的研究,并在培养基中使用柠檬酸和抗坏血酸联合来延缓褐化。
Mantle和 Tepper[6]也报道了成功地运用柠檬酸,抗坏血酸和半胱胺酸来保护外植体褐化。
培养基中氮素形式和浓度对外植体离体培养中胚状体的发生和形成有着深刻的影响。Halperin和
Wetheral,及 Reinert[7,8]都发现,与硝酸钾相比硝酸铵可提高胡萝卜体细胞胚胎发生率。侯学文等[9]的研究
也表明,改变培养基中的氮源比例,有利于玫瑰茄愈伤组织的形成。
此外,激素也影响培养材料的褐变。细胞分裂素能刺激多酚氧化酶活性提高。细胞分裂素被认为可以
降低顶端分裂优势并且诱导侧芽的生长,有利于细胞的分裂与伸长生长、不定根的形成与分化[10]。6-BA和
香蕉转化中的抗褐化及再生研究
李敬阳 张建斌 徐碧玉 金志强
(中国热带农业科学院热带生物技术研究所,海口 571101)
摘 要: 香蕉在进行遗传转化过程中,外植体容易褐化,从而降低了再生频率,影响到遗传转化的效率。为降低香
蕉转化过程中外植体的褐化率,采用香蕉(MusaAAAgroupcv.Brazilian)未成熟雄花作为外植体,以农杆菌介导法进行
遗传转化。结果表明,当改良的MS培养基中铵态氮与硝态氮(NH4+/NO3-)的摩尔比为20.6:67.6时,具有较强的抗褐化能
力。当6-BA浓度为1.0mg/L时,外植体易于诱导出胚状体。
关键词: 香蕉 褐化 氮源 激素
Regenerationfrom DecreasedBrowningofExplantsfrom Banana
MaleFlowerbyAgrobacteriumtumefaciensMediatedGene
Transformation
LiJingyang ZhangJianbin XuBiyu JinZhiqiang
(InstituteofTropicalBioscienceandBiotechnology,ChineseAcademyofTropicalAgriculturalSciences,Haikou571101)
Abstract: Explantbrowningisaproblem thatcancauselowregenerationwhengenetransformationinvolvedin.
Todealwithexplantsbrowningproblem,inthisstudy,maleflowersfrom banana(MusaAAAgroupcv.Brazilian)were
usedasexplantswhichweretransformedbyusingAgrobacterium tumefaciemediatedgenetransformation.Theresults
indicatedthattheexplantbrowningwasreducedsharplyinmodifiedMSmedium withNH4+ andNO3-ataratioof
20.6/67.6(mol).TheresultsalsoshowedthatsomaticembryogenesiswasinducedefectivelyfromexplantsinMSmedium
containing1.0mg/Lof6-BA.
Keywords: MusaAAAgroupcv Brazilianexplantbrowning Nitrogen Hormone
生物技术通报Biotechnology Buletin 2008年第5期
NAA是植物组织培养中常用的两种激素,通常合成部位与表现活性的部位不同,以微量存在表现其活性,
显著地影响植物体的生长和发育。NAA与 6-BA配合使用,可促进胚状体及芽的形成。
1 材料与方法
1.1 材料
以海南大面积种植的巴西香蕉栽培品种(MusaAAACavendish)的未成熟雄花诱导愈伤组织,经带有 B3
芪合酶基因和卡那霉素抗性基因(KanR)的农杆菌(Agrobacteriumtumefacie)侵染后作为抗褐化的培养基优
化试验材料。
1.2 方法
1.2.1 愈伤组织的诱导 取香蕉未成熟雄花花蕾,剥去其外层苞片,至其最终长度约 3cm左右(图 1A),再
将其切成 2~3mm的薄片(图 1B)。以 MS培养基+0.2mg·L-1KT+
0.2mg·L-1NAA+1mg·L-1生物素+100mg·L-1谷氨酰胺+40g·L-1
蔗糖为诱导培养基,每 25d更换一次培养基,经分化培养诱导
出愈伤组织(图 1C)。
1.2.2 大量元素中不同氮源抗褐化效应 本试验设置两种
大量元素配方,一种是 MS大量元素配方(MSD),另一种是去
硝酸铵、加倍硝酸钾的 MS大量元素配方(MSG),分别配制成
20倍的母液,设置 7个处理,每个处理 100ml,分装成 8皿。因
此 MSD和 MSG按如下体积比例混合(5:0,4:1,3:2,2.5:
2.5,2:3,1:4,0:5),即配制的培养基中铵态氮与硝态氮(NH4+/
NO3-)的摩尔比分别为 20.6:39.4,20.6:44.1,20.6:51.9,20.6:
58.2,20.6:67.6,20.6:114.6,0:94。分别命名为 A、B、C、D、E、F、
G。激素选用 1mg/L6-BA+0.2mg/LNAA+10mg/LVc+300mg/L
羧苄酶素。每 30d继代一次,继代 3次后,统计出现正常胚状
体的外植体个数。试验重复 3次。
1.2.3 6-BA和 NAA使用效果分析 采用改良 MS培养基,
同时使用 6-BA和 NAA激素。6-BA浓度分别是 0.5、1.0、2.0、
3.0mg/L,NAA浓度分别是 0.1、0.15、0.2、0.25、0.3mg/L。共做
20个不同处理。经不同激素配比的培养基 3次继代培养后,
统计正常绿色组织超过外植体表面积 50%的外植体个数,除以同样激素处理总外植体个数,计算出绿色
愈伤组织的百分率。
1.2.4 统计分析 每个处理包含约 70个外植体。所有数据应用 SPSS软件 (SPSS11.5forwindows,SPSS,
Chicago,IL,USA)进行方差分析。氮源抗褐化效应采用完全随机设计的单因素方差分析,而激素间的效应
分析则采用随机单位组设计的两因素无重复观察值方差分析,随后通过 LSD比较和 S-N-K测验在 P=5%
水平对每个处理间进行对比分析。
2 结果分析
2.1 香蕉愈伤组织的诱导
外植体在愈伤组织诱导培养基诱导下,经约 5周时间,可在其表面观察到白色、致密愈伤组织 (图
1C)。此时的愈伤组织为非胚性愈伤组织,不能直接诱导出芽,需进一步诱导为胚状体组织。
2.2 不同氮源抗褐化效应
7种含氮不同的培养基(A、B、C、D、E、F和 G)用来检验经农杆菌浸染后,香蕉雄花切片外植体的抗褐
图 1 香蕉雄花体外诱导变化
(A)未成熟香蕉雄花;(B)香蕉雄花切片;(C)非胚
性愈伤组织;(D)抗褐化效果对照;(E)改良培养基
抗褐花效果;(F)剥离的香蕉胚状体细部结构;(G)
紧实的胚性愈伤组织;(H)诱导出的香蕉芽
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化及诱导胚状体能力。通过对比不同的培养基,D、E、F培养基表现出较强的抗褐化能力(表 1),通过 3次
继代培养后,便有白色或黄绿色胚状体出现(图 1F、G)。但在 F、G培养基诱导的愈伤表面出现铁锈状物
质,生长缓慢。
表 1 MS基本培养基中不同的氮源诱导香蕉胚状体的效果
2.3 BA和 NAA的使用效应
经不同激素浓度配比的培养基继代培养 3次后,外植体诱导率结果表明 NAA之间的浓度对胚状体的
诱导率无显著影响,而当 6-BA在较低浓度为
1.0mg/L时较其它浓度下有显著优势(图 2)。
诱导出的胚状体颜色较深绿、致密、易于诱导
出芽。
3 讨论
在香蕉的离体培养过程中,褐变往往是
困扰香蕉转化的一个重要因素,其影响因素
是多方面的。如香蕉的基因型、取材部位、取
材时间、农杆菌浓度、培养条件等理化因素都
会影响香蕉组织培养过程中的褐变率。如何
找到一种克服香蕉褐化的方法,都将为香蕉
的分子育种科研和生产工作产生重大影响。
Mantle和 Tepper等[6]运用柠檬酸、抗坏血酸及半胱氨酸来抑制植物褐化。抗坏血酸作为一种还原剂并且被
转化为脱氢抗坏血酸。当组织受到伤害时,由于氧自由基导致加速氧损伤,抗坏血酸能够清除产生的氧自
由基,随后细胞从氧损伤中得到保护。包含柠檬酸和抗坏血酸等抗氧化物通过中和这些自由基来降低组织
褐化。
本试验主要从培养基中氮源和激素的不同组成来验证其抗褐变能力。试验表明通过调节铵态氮和硝
态氮比例可以改善香蕉雄花外植体组织培养过程中的抗褐化能力,在铵态氮与硝态氮(NH4+/NO3-)的摩尔
比为 20.6:67.6时,褐化相对较少,诱导出的胚状体结构紧密,颜色呈黄绿色,较容易诱导出芽。李哲等[11]的
研究也表明,通过调节培养基中的氮源,也可对香蕉切片获得较好的愈伤组织诱导效果。此外,激素对香蕉
外植体褐化也有一定调控能力,较低的 6-BA浓度下影响较为明显,而 NAA对其影响不甚明显,其主要表
现在胚状体的诱导上。这说明合适的细胞分裂素可以促进细胞分裂、延迟老化的作用,而且可以缩短诱导
时间。
参考 文献
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图 2 激素对未成熟香蕉雄花在 MS培养基中诱导胚状体的影响
李敬阳等:香蕉转化中的抗褐化及再生研究
(下转第144页)
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鼠将患年龄依赖性的糖尿病,说明 MafA基因在胰岛素的表达中起着重要的作用[7]。
用细胞免疫荧光的方法检测到在 TAT-MafA孵育 24h的 IEC-6细胞中有胰岛素的表达,RT-PCR检测
进一步证明了这一点。这说明 TAT介导的 MafA融合蛋白不但可以高效进入 IEC-6细胞,而且进胞后仍然
保持 MafA原有的生物学活性,启动胰岛素基因的表达。
肠组织是体内干细胞最多的组织之一,它与胰腺在发育上有着共同的来源,都来源于内胚层[8],除此之
外,小肠细胞和胰腺内分泌细胞在分化上的相似性预示着小肠细胞有着被诱导成为胰岛素分泌细胞的可
能。IEC-6是大鼠上皮细胞,具有干细胞特性,国外已有报道将腺病毒载体介导转录因子 PDX-1或 MafA等
作用于 IEC-6细胞,能诱导该细胞成为胰岛素分泌细胞[9,10]。利用蛋白质转导的方法将小肠细胞 IEC-6诱
导成胰岛素表达细胞,为以肠组织作为靶器官,利用蛋白质转导的方法治疗糖尿病提供了理论依据。
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