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紫叶稠李组织培养过程中防止褐化的研究



全 文 :收稿日期:2013-07-24
2014年
第 6期
2014
№6
辽 宁 林 业 科 技
Journal of Liaoning Forestry Science& Technology
紫叶稠李(Prunus virginiana)为蔷薇科李属,落
叶乔木,株高可达 10 m以上,冠幅达 7 m。嫩叶鲜
绿色,老叶紫红色;总状花序,花瓣白色;核果成熟
时黑色[1]。其彩叶性状、表型特征非常具有观赏性,
极大地丰富了城市色彩,为目前国内珍贵的彩叶乔
木树种。
利用组织培养技术,可在短期内建立繁殖体
系,不仅保存了优良的种质资源,也实现了苗木生
产产业化,但在组织培养中外植体褐变是影响组织
培养成功与否的重要因素[2]。褐化主要与植物材料
的基因型和生理状态、取材时期、培养基以及培养
条件等有关[3]。本试验通过外植体消毒时间、基本
培养基、不同生长调节物质质量浓度、抗褐化剂使
用、光照强度及暗培养时间,以控制继代培养中紫
叶稠李腋芽的褐化,为其组织培养提供参考。
1 材料与方法
1.1 材 料
在辽宁省干旱地区造林研究所试验园采集紫
叶稠李当年生越冬枝条,室温(20 ℃)水培,待抽出
新嫩枝,取其腋芽为试验材料。
1.2 方 法
1.2.1 消毒方法及培养条件
将萌发的枝条用流水冲洗 2 h后,切取含腋芽
3~4 cm的茎段,放入加少量洗涤剂的水振荡冲洗
5 min,用水冲洗干净,置于无菌室超净工作台上,先
用 70%酒精消毒(30、40、50 s),用无菌水冲洗 3次,
再用 0.1%HgCl2消毒(9、10、11 min),无菌水冲洗 5
次,吸干水分后切取侧芽接种到培养基中。每处理
接种10瓶,每瓶接种1个腋芽,重复3次。
每种处理的培养基中均加入蔗糖25 g·L-1和琼
脂7 g·L-1,灭菌前pH值为5.8。培养条件:温度(25±
1)℃,每天光照12 h。
1.2.2 基本培养基对紫叶稠李褐化的影响
分别以1/2MS、WPM和MS为基本培养基,15 d
统计外植体褐化率,腋芽诱导率及生长情况。
1.2.3 不同生长调节物质对紫叶稠李褐化的影响
以WPM培养基为基本培养基,分别附加BA
(0.5、1.0、1.5 mg·L-1)、NAA(0.1、0.15、0.2 mg·L-1)、
IBA(0.05、0.1、0.2 mg·L-1),选用正交表 L9(34)[3],
25 d统计褐化率、褐化程度及腋芽生长情况。
1.2.4 不同抗褐化剂对紫叶稠李褐化的影响
在附加 BA 0.5 mg·L-1 + NAA 0.1 mg·L-1 +
IBA 0.05 mg·L-1的WPM培养基中加入抗坏血酸
(VC)200、300、500 mg·L-1,聚乙烯吡咯烷酮(PVP)
300、500、1 000 mg·L-1,活性炭(AC)1 000、3 000、
5 000 mg·L-1,以不添加抗褐化剂作为对照(CK)。
14 d和28 d统计外植体褐化和生长情况。
1.2.5 光照强度对紫叶稠李褐化的影响
将处理后的腋芽接种到附加BA 0.5 mg·L-1 +
NAA 0.1 mg·L-1+ IBA 0.05 mg·L-1的WPM培养基
紫叶稠李组织培养过程中防止褐化的研究
郑 璐
(辽宁省干旱地区造林研究所,辽宁 朝阳 122000)
摘 要:以紫叶稠李腋芽为材料,研究消毒剂、消毒时间,基本培养基,植物生长调节物质质量浓
度,抗褐化剂,光照强度及暗培养对其组织培养过程中褐化的影响。结果表明:70%酒精浸泡30 s、
0.1%HgCl2消毒10 min,最适基本培养基WPM,BA 0.5 mg·L-1、NAA 0.1 mg·L-1和 IBA 0.05 mg·L-1,
VC 300 mg·L-1,光照强度 1 500 lx,暗培养 3~6 d,均能降低紫叶稠李腋芽褐化,提高诱导率,且腋
芽生长良好。
关键词:紫叶稠李;组培;褐化
中图分类号:S792.189.05 文献标识码:A 文章编号:1001-1714(2014)06-0038-03
—— 38
中,分别置于 1 000、1 500、2 000和 2 500 lx的光强
下培养25 d,统计外植体的褐化率、褐化程度、诱导
率和生长情况。
1.2.6 暗培养时间对紫叶稠李外植体褐化的影响
将腋芽消毒后接种于诱导培养基上,分别进行
0、3、6、9 d的暗培养,然后在不同的光照强度下培
养25 d,观察外植体褐变和生长情况。
2 结果与分析
2.1 消毒剂和消毒时间对紫叶稠李腋芽褐化影响
由表 1可以看出,外植体消毒时间短,褐化较
轻,但污染较重;消毒时间长,污染率降低,褐化率
却明显升高。可见延长消毒时间会导致褐化加
深。最佳消毒组合为70%酒精浸泡30 s、0.1%HgCl2
消毒 10 min,污染率和褐化率均相对较低,腋芽生
长良好。孙周平等在刺五加腋芽培养抗褐化研究
中也有类似报道[4]。
2.2 不同培养基对紫叶稠李外植体褐化的影响
由表2可以看出,培养基1/2MS的褐化率最低,
WPM次之,MS较高。其原因可能是,无机盐浓度
过高,致使酚类物质大量产生,引起细胞褐变,因
此,降低盐浓度则可以减少酚类外溢,从而减轻褐
变[5],这种现象在黑松、苹果、桑树等的微繁中也有
类似的报道。但到培养后期,1/2MS培养基中的外
植体诱导率较低,长势不良,MS、WPM培养基诱导
率较高。综上所述,最适基本培养基为WPM。
2.3 生长调节物质对紫叶稠李褐化的影响
由表 3可以看出,BA、NAA和 IBA对紫叶稠李
外植体褐化及生长影响不同,因素内水平极差(R)
的大小说明该因素对试验结果的影响程度,可见对
紫叶稠李外植体褐化的影响程度依次为 NAA>
BA>IBA。经方差分析结果表明(表 4):NAA和
BA对降低紫叶稠李外植体褐化的影响差异显著,
IBA差异不显著,可见降低其褐化的最优组合为
BA 0.5 mg·L-1 + NAA 0.1 mg·L-1 + IBA 0.05 mg·L-1,
其苗较粗壮,叶大而浓绿。
2.4 抗褐化剂对紫叶稠李褐化的影响
从表5可以看出,在未加入任何抗褐化剂(CK)
时,植株褐化程度较重,培养28 d褐化率达到80%,
生长相对较慢;而添加VC、PVP和AC抗褐化剂,植
株褐化程度降低,褐化进程趋缓,生长逐渐变好,其
中VC的抗褐变效果最好,当VC添加300 mg·L-1、培
养 14 d时,腋芽褐化率 25.1%最低,生长良好,明显
高于对照和其他处理。观察发现及时转瓶也有利
于降低褐化。
表1 不同消毒剂和消毒时间组合对腋芽褐化影响
酒精
/s
20
20
20
30
30
30
40
40
40
HgCl2
/min
9
10
11
9
10
11
9
10
11
污染率
/%
53
33
17
12
9
9
9
5
5
褐化率
/%
15
24
33
21
20
48
32
53
61
褐化
程度
*
**
***
*
*
***
**
***
****
生长
状况
++
++
+
+++
+++++
++
++
+
+
表2 不同种类培养基对外植体褐化的影响
培养基
MS
WPM
1/2MS
褐化率/%
55.8
31.4
28.6
诱导率/%
86.3
83.8
52.2
褐化程度
***
*
*
生长状况
++++
++++
++
表3 不同生长调节物质浓度变化对紫叶稠李褐化的影响
试验号
1
2
3
4
5
6
7
8
9
K1
K2
K3
k1
k2
k3
R
NAA
/mg·L-1
0.1
0.1
0.1
0.15
0.15
0.15
0.2
0.2
0.2
40.0
52.6
62.7
13.3
17.5
20.9
7.6
IBA
/mg·L-1
0.05
0.10
0.2
0.05
0.10
0.2
0.05
0.10
0.2
55.0
52.6
47.7
18.3
17.5
15.9
2.4
BA
/mg·L-1
0.5
1.0
1.5
1.0
1.5
0.5
1.5
0.5
1.0
40.0
55.2
60.1
13.3
18.4
20.0
6.7
褐化
率/%
10
15
15
20
20.1
12.5
25.0
17.5
20.2
T=155.3
褐化
程度
*
**
**
**
**
*
***
**
***
生长
状况
++++
++
++
+
+
+++
+
+++
+
表4 方差分析
变异来源
6-BA
NAA
IBA
e

自由度
2
2
2
2
8
平方和
86.2
9.2
73.2
1.19
169.8
均方
43
4.6
36.6
0.6
-
F值
72.3*
7.73
61.5*
-
-
F0.05
19.0
-
注:*代表差异显著。(p<0.05)
注:“*”表示褐化程度;“+”表示生长状况,以下同。
郑 璐:紫叶稠李组织培养过程中防止褐化的研究第 6期 2014年
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2.5 光照强度对紫叶稠李外植体褐化的影响
从表 6可以看出,外植体褐化率随光照强度增
加而升高;当光照强度为1 000 lx时,外植体的褐化
率、腋芽诱导率均最低;光照强度为 1 500 lx时,外
植体的褐化率较低,腋芽诱导率却最高,生长最好;
光照强度为2 500 lx时,外植体褐化率最高,诱导率
较低。综合分析,最适宜光照强度1 500 lx。
2.6 暗培养对紫叶稠李外植体褐化的影响
从表 7可以看出,没有进行暗培养的褐化率最
高。在培养初期,暗培养可以减轻紫叶稠李的褐化
程度,这可能与黑暗条件抑制了酶的活性和减少了
酚类物质的氧化有关。试验发现,暗培养3~6 d比
直接光照褐化较轻,生长良好;随暗培养时间延长,
褐化率会有所下降,但外植体长势较差。因此,合
理控制暗培养的时间对紫叶稠李外植体的褐化抑
制起重要作用。
3 结 论
以紫叶稠李腋芽为外植体,先用70%酒精浸泡
30 s,再用 0.1%HgCl2消毒 10 min,污染率和褐化率
都相对较低,生长良好;WPM为最适基本培养基,
在添加BA 0.5 mg·L-1、NAA 0.1 mg·L-1和 IBA 0.05
mg·L-1的培养基中腋芽的褐化程度最低,苗较粗壮,
叶大而浓绿。在培养基中添加VC 300 mg·L-1、培养
14 d的褐化率最低,苗生长良好。同时,及时转瓶
也可以有效降低褐化现象的发生。最适宜的光照
强度为 1 500 lx;此外,暗培养有助于减轻褐化,暗
培养3~6 d比直接光照褐化程度轻,生长良好。
参考文献:
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(责任编辑:张素清)
表5 不同种类和浓度抗褐化剂对紫叶稠李褐化影响
抗褐变剂
CK
AC
PVP
VC
质量浓度
/mg·L-1
-
1000
3000
5000
300
500
1000
200
300
500
褐化率/%
14 d
53.0
32.7
55.9
68.0
44.9
64.9
64.8
41.2
25.1
50.2
28 d
80.0
47.2
65.1
78.5
62.9
76.9
67.5
65.2
47.2
67.6
褐化
程度
****
*
***
***
*
***
***
**
*
**
生长
状况
+
+++
++
++
++
+++
++
+++
++++
+++
表6 光照强度对紫叶稠李外植体褐化的影响
光照强度/lx
1000
1500
2000
2500
褐化率/%
12.1
15.3
34.1
57.3
诱导率/%
28.1
95.8
71.5
40.2
褐化程度
*
*
**
***
生长状况
+
++++
+++
+
表7 暗培养对紫叶稠李外植体褐化的影响
暗培养时间/d
0
3
6
9
褐化率/%
68.1
35.3
34.8
26.7
褐化程度
*****
**
**
**
生长状况
+
+++
+++
+
辽 宁 林 业 科 技第 6期 2014年
目林森林生态系统对改善项目区的生态环境发挥
的重要作用。因此,建议政府部门在制定和建立可
持续发展规划决策时,应对森林潜在服务功能价值
有足够的认识,合理利用与经营森林资源。
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(责任编辑:董莉莉)
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