全 文 ：学术园地　Academic Field
PR ACTICA L FORES TRY TECHNOLOGY 7　
二〇〇九年第八期　林业实用技术
蒙古扁桃组织培养中愈伤组织褐化机理初探＊
樊　荣2 　滕　鹤1 　白淑兰1 　王玉霞1 　慈忠玲1
(1.内蒙古农业大学林学院　呼和浩特　010019;2.呼和浩特市赛罕区实验苗圃)
＊基金项目:国家自然基金项目(30860225)
资助 ,内蒙古农业大学博士基金项目(BJ06-11)。
作者简介:樊　荣(1968-),男 , 高级工程
师,主要从事林木育苗及生物技术研究。
上 ,选取了反应成分中模板浓度 、引
物浓度 、dN TPs 浓度 、Mg2+浓度及
Taq酶用量 5个重要因子 ,通过正
交试验所设计的 16组试验号在 Bi-
ometra Tg rident96型基因扩增仪上
一次完成扩增反应 , 并在筛选出的
最适条件下进行退火温度的梯度试
验以及循环次数的优化。结果表
明 ,在 20μL 的 RAPD -PCR 反应
体系中 ,各项因子的最适条件:模板
DNA 1.5 ng/μL ,随机引物 0.8 ～
1.0 μmol/ L , dN TPs 0.1 ～ 0.15
mmo l/L ,Mg2+ 2.0 ～ 2.5 mmol/ L ,
Taq酶用量 0.5 ～ 1 U , 10 ×PCR
Buffer 2 μL , 加 ddH 2O 至 20 μL。
其热循环参数为:94 ℃预变性
2 min ,之后进行 40个循环(94 ℃变
性30 s ,36 ℃退火 60 s , 72 ℃延伸
90 s),最后 72 ℃总延伸7 m in后在
4 ℃终止反应 。该体系重复性好 ,可
靠性高 ,与普小兰等[ 5] 所研究的巨
龙竹 RAPD 优化体系结果相吻合 ,
由此可见 , 该体系不但可以有效应
用于云南箭竹的遗传多样性研究
中 ,甚至可以试用于竹亚科中其它
竹种的遗传多样性研究 。
参考文献:
[ 1] 　汪小全 ,邹喻苹 , 张大明 , 等.RAPD
应用于遗传多样性和系统学研究中
的问题 [ J] . 植物学报 , 1996 , 38
(12):954-962.
[ 2] 　卢　江.随机放大多态性 DNA
(RAPD)一种新的分子遗传标记技
术[ J] .植物学报 , 1993(35):119-
127.
[ 3] 　吴益民 , 黄纯农 , 王君晖.四种竹子
的 RAPD指纹图谱的初步研究[ J].
竹子研究汇刊 , 1998 , 17(3):10-13.
[ 4] 　师丽华 , 杨光耀 , 林新春 , 等.毛竹
种下等级的 RAPD 研究[ J].南京林
业大学学报 , 2002 , 26(3):65-68.
[ 5] 　普小兰 , 李　鹏 , 杜　凡.巨龙竹基
因组 DNA 的提取及 RAPD 反应条
件的优化[ J] .昆明理工大学学报
(理工版), 2003 , 28(1):127-131.
(6 ～ 16 本刊略)★
[ 摘要] 　选取不同培养时间及不同培养
条件下的 15 个样品 , 通过分光光度法测
量其总酚含量 、多酚氧化酶(PPO)活性 、
超氧化物歧化酶(SOD)活性 、过氧化物酶
(POD)活性 ,发现除总酚含量与愈伤组织
褐化情况相关外 , 较高的 SOD 酶活性与
较低的 POD酶活性也是导致愈伤组织褐
化的重要因素。
[ 关键词] 　蒙古扁桃　组织培养　褐化
　酶活性
蒙古扁桃(Prunus mongolica
Ma xim.)属于蔷薇科(Rosaceae)李
属(Prunus)的多年生灌木 ,又称为
山樱桃 、土豆子[ 1] 。分布于内蒙古 、
甘肃 、宁夏的荒漠区和荒漠草原区
的低山丘陵坡麓 、石质坡地及干涸
河床 , 多 分 布于 海拔 1 000 ～
2 400 m 。蒙古国也有分布[ 2] 。蒙
古扁桃是亚洲中部戈壁荒漠特有
种 ,是荒漠区和荒漠草原的景观植
物和水土保持植物 。由于不堪承受
强烈人为活动影响及自然环境进一
步恶化 ,蒙古扁桃的种群数量锐减 ,
分布范围日益缩小 ,分别被中国植
物红皮书和蒙古国植物红皮书收录
为濒危植物[ 3] 。在国家环境保护局
首次公布的“中国珍稀濒危保护植
物名录”中被列为三级保护植物[ 4] 。
蒙古扁桃种质资源保护日趋引起人
们的关注 。但蒙古扁桃在生产上无
法使用分蔸繁殖 、扦插繁殖等无性
方法进行繁殖。繁殖方式主要为种
子繁殖。但由于其种子外具有坚硬
的果核 ,直播 、破壳 、酸蚀的萌发率
都低 ,经越冬处理后萌发率仍不足
30%[ 5-6] 。因此 ,对蒙古扁桃进行组
织培养 ,在实验过程中发现 ,愈伤组
织经过一段时间的培养 ,逐渐出现
褐化现象 ,褐化的程度及速度因培
养条件不同而有所差异 。为了控制
褐化 ,本研究以不同条件下蒙古扁
桃愈伤组织为材料 ,测定并分析不
同生长时期与褐化相关的因子 ,从
而探讨蒙古扁桃组织培养过程中褐
化的生理生化机制 。
1　材料与方法
1.1　材料
本实 验供 试激 素:6-BA 和
NAA , 6-BA 选 择 1 种 浓 度:
0.7 mg/ L , NAA 选择 3 种浓度:
0.2 mg/ L 、0.4 mg/ L 、0.6 mg/ L ,培
养基选择了 MS 培养基 。外植体为
蒙古扁桃 30 d的幼龄实生苗茎段通
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过组织培养所产生的不同时间段的
愈伤组织(20 、30 、40 、50 、60 d)。
1.2　方法
1.2.1　愈伤组织内总酚含量测定
　先绘制标准曲线[ 7] 。然后分别准
确称取 0.5 g 不同培养时间的蒙古
扁桃愈伤组织 ,加少量含 2%HCl的
甲醇 ,充分研磨 , 定容至 10 mL ,室
温 、避光提取 24 h 。4 000 r/min 离
心 10 min ,取上清液 0.2 mL 加入
1.0 mL 福林—肖卡试剂 , 0.8 mL
7.5%的Na2CO3 溶液 ,缓慢搅拌反应
30 min后 , UV-4802紫外可见光分
光光度计 ,在 765 nm 波长下测量吸
光度值[ 7] ,每个处理3个重复 ,下同。
1.2.2　PPO 酶活性测定　取愈伤
组织 1.0 g , 加入少量 0.05 mol/L
磷酸缓冲液(pH 值 5.8)充分研磨 ,
定溶 至 5 mL , 400 r/min 离 心
10 min ,取上清液 1 mL 加入 0.08
mol/L 的邻苯二酚溶液 1 mL ,0.05
mol/L 磷酸缓冲液(pH 值5.8)定容
至 5 mL。室温准确反应 5 min ,在
525 nm 波长下测量吸光值 ,并计算
酶活性[ 8] 。
1.2.3　SOD酶活性测定　取愈伤
组织 1.0 g , 加入少量 0.05 mol/L
磷酸缓冲液(pH 值 7.8)充分研磨 ,
定溶 至 5 mL。 400 r/min 离心
10 min , 取上清液 0.3 mL , 加入
0.05 mo l/L 磷酸缓冲液(pH 值
5.8)1.5 mL 、130 mmo l/L 、Met 溶
液0.3 mL 、750 μmo l/L 、NBT 溶液
0.3 mL 、100 μmol/L EDTA -Na2
溶液 0.3 mL 、20 μmo l/L 核黄素溶
液 0.3 mL。 4 000 lx 光照反应
30 min ,在 560 nm 波长下测量吸光
值 ,并计算酶活性[ 9] 。
1.2.4　POD酶活性测定　取愈伤
组织 0.1 g , 加入少量 0.05 mol/L
磷酸缓冲液(pH 值 5.8)充分研磨
后 ,定容至 5 mL。400 r/min 离心
10 min , 取 上 清 液 1 mL , 加 入
0.05 mol/ L愈创木酚溶液 1.0 mL 、
2%H2O2 1.0 mL 、0.05 mol/L 磷酸
缓冲液(pH 值5.8)定容至 5 mL ,立
即于 30 ℃水浴中保温 5 min , 在
470 nm波长下测量吸光值 ,并计算
酶活性[ 10] 。
酶活性计算公式:
酶活性= A×V
0.01×Vs×W×t
式中:A:吸光度值;V:酶液总体积
(m L);Vs:反应用酶液体积(mL);W:样
品鲜质量(g);t:反应时间(min)。
2　结果与分析
2.1　NAA 浓度对愈伤组织褐化的
影响
研究表明在愈伤组织生长的同
一时间内 ,培养基中 NAA 含量为
0.6 mg/L 的愈伤组织生长状况较
好 ,褐化情况与其他浓度处理外观
上差异明显;NAA含量为0.4 mg/L
的愈伤组织初期生长迅速 ,但后期
褐化较严重;NAA含量0.2 mg/L的
愈伤组织生长缓慢 ,且褐化严重。
2.2　不同处理对愈伤组织总酚含
量的影响
通过对照标准曲线 ,不同激素
浓度随着培养时间的推移 ,愈伤组
织的总酚含量逐渐增加(见图 1)。
图 1　不同处理对愈伤组织
总酚含量变化的影响
愈伤组织内总酚含量测定结果
显示:随着培养时间的延长 ,愈伤组
织内总酚含量不断增加 ,说明随着
细胞的老化 , 酚类物质不断积累。
另外 ,在同一时间 ,培养基内 NAA
浓度 0.2 mg/L 的愈伤组织内总酚
含量最高 ,NAA 浓度0.6 mg/ L的愈
伤组织内总酚含量最低 ,说明逆境
会促使愈伤组织细胞产生酚类物
质。由此可见 ,在蒙古扁桃组织培
养过程中 ,愈伤组织褐化情况与其
内部总酚含量的变化相关。
2.3　不同处理对愈伤组织 PPO 活
性的影响
由图 2可知 ,不同 NAA 浓度随
着培养时间的推移愈伤组织中 PPO
酶活性逐渐降低。
图 2　不同处理对愈伤组织中
PPO酶活性变化的影响
愈伤组织内 PPO 酶活性测定
结果显示:随着培养时间的延长 ,愈
伤组织内 PPO 酶活性不断下降。
PPO酶活性的下降导致愈伤组织细
胞代谢产生的酚类物质无法转化 ,
可能是总酚含量随时间积累的原因
之一 。在同一时间 ,培养基内 NAA
浓度 0.2 mg/L 的愈伤组织内 PPO
酶活性最低 , NAA 0.4 mg/L的愈伤
组织内 PPO酶活性最高 ,说明 PPO
酶活性与细胞活性有关 ,可能也与
愈伤组织褐化有关 。
2.4　不同处理对愈伤组织 SOD及
POD活性的影响
由图 3可知 ,不同 NAA 浓度随
着培养时间的推移 , 愈伤组织中
SOD酶活性逐渐增强 。
图 4表明 ,不同 NAA浓度随培
养时间的增长 POD 酶活性显著降
低。愈伤组织内 SOD酶与 POD酶
活性测定结果显示:随着培养时间
的延长 ,愈伤组织内 SOD 酶活性逐
渐升高 ,相反 POD 酶活性逐渐降
低。因而认为可能是随着细胞的老
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化 ,需要大量 SOD酶分解细胞内不
断增多的氧自由基 , 但却没有足够
的 POD酶来分解由 SOD酶歧化氧
自由基产生的 H 2O 2 等过氧化物 ,
最终过量的过氧化物毒害细胞 ,导
致了细胞死亡 、愈伤组织褐化 。
在同一时间 ,培养基内 NAA 浓
度为 0.2 mg/ L 的愈伤组织 SOD酶
活性最低 , NAA 0.4 mg/L 的愈伤
组织 SOD 酶活性最高 ,说明 SOD
酶活性与细胞活性有关。而 POD
酶活性在培养初期(约 40 d之前)培
养基内 NAA 浓度为0.2 mg/L时最
低 ,NAA 0.4 mg/L时最高 ,也表现
出与细胞活性相关。培养过程中 ,
在 NAA 浓度为 0.4 mg/L 的培养
基上生长的愈伤组织内 POD 酶活
性下降速度较快 , 至培养后期(约
40 d之后)其 POD酶活性已低于在
NAA浓度为 0.6 mg/L 的培养基上
生长的愈伤组织 。这正好与生长于
NAA浓度为 0.4 mg/L 培养基上生
长的愈伤组织前期生长迅速 ,后期
褐化严重的情况相符。也从另一个
角度说明在蒙古扁桃组织培养过程
中 ,愈伤组织褐化现象的出现与愈伤
组织内 SOD酶和 POD酶活性有关 ,
SOD酶与 POD酶活性失衡是导致蒙
古扁桃愈伤组织褐化的重要因素。
3　小结与讨论
(1)通过本研究可初步认定 ,通
常认为在组织培养过程中导致愈伤
组织褐化的酚类物质对蒙古扁桃组
织培养起同样的作用 ,但在某些植
物组织培养中与愈伤组织褐化现象
密切相关的 PPO 酶在该实验中作
用不明确 。这与阿月浑子组织培养
过程中愈伤组织褐化情况相似[ 11] 。
此外 ,发现 SOD 酶与 POD 酶活性
的变化也是蒙古扁桃组织培养过程
中愈伤组织褐化的重要原因 。
(2)对于蒙古扁桃组织培养过
程中愈伤组织褐化严重的情况 ,我
们采用了一些常规的延缓愈伤组织
褐化的方法 ,如:调节培养基 pH 值 、
加入还原剂 、缩短继代间隔期等 ,但
是效果均不明显。主要原因可能是
在该实验中导致这两种酶活性变化
的深层机理尚不明确 ,故无法针对
其设计出最适宜的解决方案 。所
以 ,我们还将对此进行深入地研究 。
参考文献:
[ 1] 　马毓泉 , 富象乾 , 陈　山.内蒙古植
物志[ M].呼和浩特:蒙古人民出版
社 , 1989.
[ 2] 　赵一之.蒙古扁桃的植物区系地理
分布研究[ J].内蒙古大学学报 ,
1995 , 26(6):713-715.
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古扁桃种子萌发过程的呼吸代谢变
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与分子生物学研讨会论文集[ C] ,
2006:66.
[ 4] 　吴高升 , 刘　忠 , 赵书元.蒙古扁桃
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1994(3):25-28.
[ 5] 　燕　玲 , 李　红 , 宋述芹.干旱区五
种野生观赏植物的引种栽培试验
[ J].干旱区资源与环境 , 2004 , 18
(6):159-163.
(6 ～ 11 本刊略)★
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