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研究报告

生物技术通报
BIOTECHNOLOGY
BULLETIN 2010年第 8期
GFP基因转化藿香的研究
程志号
惠荣奎
蔡明历
郝大翠
刘焰
(华中农业大学药用植物研究所,武汉 430070 )


摘
要:
以藿香无菌苗幼嫩茎段为受体, 利用根癌农杆菌介导法进行了绿色荧光蛋白基因 ( GFP)的遗传转化研究。经
农杆菌侵染, 通过共培养、选择培养后获得其抗性愈伤组织, 对抗性愈伤组织的诱导过程进行了 GFP荧光检测。结果表明,
GFP基因能在抗性愈伤组织中强烈表达 ,证明 GFP基因能够在藿香遗传转化中得到应用。对抗性愈伤组织的 PCR检测初步
证实外源 GFP基因已整合到藿香愈伤组织的基因组中。
关键词:
藿香
GFP基因
根癌农杆菌
PCR
Transfering Green Fluorescent Protein Gene intoAgastache rugosa
( Fisch. etM ey) . Kuntze
Cheng Zhihao
HuiRongkui
CaiM ing li
H aoDacu i
L iu Yan
( Institute of M edicinalP lant, H uazhong Agr icultural University, W uhan 430070)


Abstrac:t
In o rder to con firm its practical v alue of the green fluorescen t pro te in ( GFP ), a v isua l m arker, in Agastache rugo sa
( F isch. etM ey). Kuntze transfo rma tion, Agrobacterium tum efaciens
m ed iated transfo rm ation by us ing young stem as exp lants w as inves

tigated. GFP detec tion was conducted dur ing the transforma tion and strong GFP expression w as observed in pu tative transform a tion wh ich
ind icated tha tGFP cou ld be used in Agastache rugosa ( F isch. etM ey ). Kuntze transform ation. Results o f PCR proved pre lim inar ily that
the GFP gene had integrated intoAgastache rugosa ( F isch. etM ey). Kuntze ca lluses genome.
Key words:
Agastache rugosa ( F isch. etM ey). Kuntze
G reen fluorescen t prote in gene
Agrobacter ium tum efaciens
PCR
收稿日期: 2010
01
18
基金项目:华中农业大学创新基金项目
作者简介:程志号,男,博士研究生,研究方向:药用植物组织培养及遗传转化; E
m ai:l zh ihaoch eng1@ gm ai.l com
通讯作者:刘焰,副教授, E
m ai:l yan@l m ai.l hzau. edu. cn
藿香 [Agastache rugosa ( F isch. etM ey. ). Kuntze]
为唇形科藿香属一年生或多年生草本植物。它是常
用的药用植物,也是香料植物和蔬菜,是一种重要的
多用途经济植物,具有广泛的开发前景和经济价值。
国内, 藿香的药用成分分析及利用、栽培和药理学方
面有一些相关报道 [ 1
3]。国外, Hye[ 4, 5]报道了向藿
香悬浮培养液中添加前体物以增加培养液中迷迭香
酸的含量, 并对藿香愈伤的挥发成分进行了分析;
Soak
[ 6]报道了农杆菌诱导藿香产生毛状根积累迷迭
香酸。迷迭香酸有明显的抗炎和免疫抑制作用,尚
未见藿香遗传转化方面的报道, 本研究以 GFP为报
告基因,使用藿香茎段为转化受体,通过农杆菌介导
进行基因转化,获得表达绿色荧光蛋白基因的抗性
愈伤组织,并对抗性愈伤组织进行了分子检测,旨在
为今后藿香愈伤次生代谢物的成分改造和利用以及
藿香的抗虫、抗病育种提供帮助。
1
材料与方法
1. 1
材料
藿香 (Agastache rugosa)经华中农业大学药用植
物研究所刘焰副教授鉴定,现栽植于本校药用植物标
本园内。 9- 10月份采收种子,种子经晒干、除杂、风
选后用 70%的乙醇悬选,自然风干,低温保存。
农杆菌菌株 EHA 105及质粒载体 pB IN m
g fp5

ER,均由华中农业大学作物遗传改良国家重点实验
室棉花课题组保存和提供, 该载体含卡那霉素抗性
基因 npt
,以及报告基因 m
g fp5
E,其 T
DNA结构
如图 1所示。
2010年第 8期 程志号等: GFP基因转化藿香的研究
LB. T
DNA左边界; RB. T
DNA右边界
图 1
质粒 pBIN m
gfp5
ER的 T
DNA区结构图
1. 2
无菌苗的制备
取饱满成熟的种子用 70%酒精浸泡 1 m in后,
用 0. 1%的 HgC l2浸泡 8 m in,无菌水洗涤 3次, 播至
1 /2MS培养基上, 25
光照培养 3周后,转入黑暗
条件下培养 1周后作为遗传转化的起始材料。
1. 3
菌液的制备
菌株经活化后接入 MGL 培养基中, 27
、
200 r /m in摇 2 h, OD600在 0. 5 - 1. 5之间即可用于
侵染。
1. 4
愈伤组织对卡那霉素的敏感性试验
MS+ 6
BA 0. 2 mg /L+ 2, 4
D 0. 5 mg /L+ 卡那
霉素 ( Km ) [ 8] , Km设置 20、30、40、50、60 mg /L 5个
浓度梯度确定抗生素筛选浓度。以无菌苗的茎段为
外植体分别接到上述培养基上, 1个月后比较不同
浓度抗生素对外植体增殖的抑制作用, 以确定合适
的选择压力。每个梯度试验外植体数不少于 30个。
1. 5
根癌农杆菌侵染与共培养
把无菌苗茎切成 5- 7 mm长, 用镊子夹到经活
化的菌液, 搅匀, 静置侵染, 设置 5 m in、10 m in、15
m in 3个时间梯度, 倒掉菌液, 滤纸吸干残余菌液,
吹 5 m in使表面稍微干燥, 分布于垫有滤纸的共培
养培养基 (M S+ 6
BA 0. 2 mg /L + 2, 4
D 0. 5 mg /L
+乙酰丁香酮 ( AS) 50 mg /L, pH5. 6)中, 19- 21
,
暗培养,共培养设置 24 h、48 h、72 h 3个时间梯度。
1. 6
选择培养
共培养结束后, 把经过共培养的外植体连同滤
纸一起取出浸入含 500mg /L头孢霉素的无菌水中,
浸泡 15- 20 m in, 用无菌水清洗 3遍, 滤纸吸干水
分,无菌风吹 10 m in使表面稍微干燥, 转入选择培
养基中 (M S+ 6
BA 0. 2mg /L + 2, 4
D 0. 5mg /L +
卡那霉素 + 头孢霉素 + 琼脂 10 g /L, pH6. 0) 26

弱光培养,培养 28 d左右继代 1次。卡那霉素的浓
度依据 1. 4的结果,头孢霉素浓度为 400 mg /L。通
过统计愈伤诱导率、观察 GFP表达情况及愈伤的生
长情况以确定合理的外植体来源、最佳侵染时间及
共培养时间。
1. 7
抗性愈伤的检测
1. 7. 1
GFP的荧光检测
分别在共培养 15 d后利
用体视荧光显微镜检测 GFP基因的瞬时表达。体
视荧光显微镜型号为 LeicaMZ 2500,滤光片为 GFP2,
激发光源为 480 nm波长的蓝光。在以后的筛选培养
中, 每隔 15 d观测不同的转化子的 GFP基因表达
情况。

1. 7. 2
抗性愈伤的 PCR检测
采用 CTAB少量提
取法抽提抗性愈伤总基因组 DNA用于 PCR扩增,
根据 NPT
基因所设计的特异引物: P1: 5

AGA

CAATCGGCTGCTCTGAT
3
, P2: 3

TCATTTCGAAC

CCCAGAGTC
5
。
2
结果及分析
以无菌苗的茎段和叶片为外植体分别接到含卡
那霉素的愈伤诱导培养基上进行筛选, 1个月后比
较不同浓度抗生素对外植体增殖的抑制作用, 试验
结果如表 1所示, 当卡那霉素为 50 mg /L、60 mg /L
时, 外植体几乎全部逐渐退绿变枯, 叶片发白, 最后
死亡。外植体对卡那霉素较敏感, 因而在本研究中
确定卡那霉素的抗性最适浓度为 50 mg /L。
表 1
愈伤组织对卡那霉素的敏感性试验
Km浓度
(m g /L)

愈伤生长情况
20
正常产生绿色愈伤
30
外植体慢慢退绿变白,极少数能产生愈伤,生长缓慢
40
外植体慢慢退绿变白,极少数能产生愈伤,生长缓慢
50
外植体几乎全部逐渐退绿变枯、发白,最后死亡
60
外植体几乎全部逐渐退绿变枯、发白,最后死亡
当菌液 OD600为 0. 6- 0. 8时有利于感染, 菌液
浓度过高则会造成农杆菌过度生长, 增加污染的风
险。共培养方式直接影响到转化率的高低。培养
时, 在共培养基上铺一层滤纸,既吸附了外植体上过
多的菌液,又能较好地完成转化, 而没有滤纸的对照
则会出现继代培养后细菌再度污染的现象。从表 2
可以看出,侵染时间为 10m in, 共培养时间为 48 h,
转化效果最好,侵染时间过长容易导致再度污染;共
培养 24 h,因时间过短, T
DNA转移过程不能完成,
117
生物技术通报 B iotechnology
Bulletin 2010年第 8期
转化不完全,共培养时间过长会导致农杆菌过度生
长而使外植体死亡。
共培养结束后, 将外植体置于倒置荧光显微镜
下,由紫外光激发外植体材料进行绿色荧光观察。
从图 2可见,共培养结束后,被检测的抗性愈伤组织
上呈现出绿光表达,未导入目的基因的则不能表达;
经过 2- 3次的选择培养后,诱导获得卡那霉素抗性
愈伤组织,并且这些抗性胚性愈伤组织能够稳定表
达 GFP基因 (图 2
D)。
表 2
侵染时间及共培养时间对转化频率的影响
侵染时
间 ( m in)
共培
养时
间 ( h)
外植
体数
目 (株 )
分化
愈伤数
目 (株 )
愈伤
形成
率 (% )
GFP检
出数
目 (个 )
GFP
检出
率 (% )
5 24 65 2 3. 07 0 0. 00
48 65 7 10. 77 3 4. 62
72 65 5 7. 69 3 4. 62
10 24 65 36 55. 38 29 44. 62
48 65 43 66. 15 39 60. 00
72 65 40 61. 54 38 58. 46
15 24 65 30 46. 15 26 40. 00
48 65 38 58. 46 35 53. 84
72 65 36 55. 38 33 50. 76
B, D分别为 A, C对应的荧光激发下观察的抗性愈伤
图 2
A、C为普通视野下观察的抗性愈伤
将多次选择继代的抗性愈伤组织,按照外植体
来源编号,提取 DNA,进行 PCR检测,检测结果 (图
3)显示:卡那霉素抗性愈伤组织使用 NPT II基因设
计的引物扩增出约 700 bp的片段, 与质粒 DNA扩
增的片段大小相同,而以未转化愈伤组织 DNA为阴
性对照的扩增产物中无目标片段, 说明外源基因已
稳定整合到抗性愈伤组织的核基因组中; 编号 10、
12和 13的卡那霉素抗性愈伤组织的 DNA 未能扩
增出同样片段,说明这些愈伤组织是假阳性克隆,故
此次试验抗性愈伤组织的阳性比率为 80%。
M. DL 200; P.质粒 DNA阳性对照; N.未转化愈伤组织 DNA阴性对
照; 1
15.抗性愈伤组织 DNA
图 3
经转化的藿香抗性愈伤组织的 PCR检测
3
讨论
本研究首次利用报告基因 GFP基因进行了藿
香遗传转化研究。以 GFP作为标记,转化后代的检
测比较方便,只需要紫外光照射外植体,转化材料就
能发出特定荧光,从而与对照区别开,因此它能够对
转基因材料进行活体追踪, 另外, GFP还能克服穿
透、毒害、光漂白等不利因素 [ 9
11]。本研究发现 GFP
基因作为报告基因在筛选阳性转化的同时, 能够保
持材料的活力,并在转基因藿香的愈伤组织中充分
表达,证明 GFP基因能够在藿香的遗传转化中得到
应用。
在进行植株再生的过程中,抗生素是获得阳性
再生植株的关键, 它是得到阳性转化材料的重要保
证, 但也可能是植株再生困难的根源。在本研究中,
使用卡那霉素作为抗生素的藿香抗性愈伤组织能够
在继代多次后,形成的愈伤没有再次变成绿色,没有
分化出丛芽, 因而没有成功地诱导获得再生植株。
杜丽等 [ 12]以香樟为材料的转化中, 能成功的得到抗
性愈伤也未能分化成再生植株。我们认为卡那霉素
的强烈抑制生长作用使得愈伤组织难以诱导出丛
芽, 含有抗性基因的转化细胞能够抵抗抗生素的刺
激, 但是抗生素对这些材料生长抑制却是一直存在
的, 这种抑制作用可能就是导致抗性愈伤组织的再
生困难的原因之一。因此,未来的研究可通过 GFP
活体检测的阳性克隆,经大量扩增后,在去除掉抗生
118
2010年第 8期 程志号等: GFP基因转化藿香的研究
素的培养基上诱导植株再生。
转基因技术在药用植物育种中已有广泛的应
用,如在西洋参基因组中导入编码几丁质酶基因或
与甜味蛋白相似的抗菌基因后,成功地育成抗真菌
病毒的西洋参品种 [ 13 ]。张家明等 [ 14]将人工合成的
柞蚕抗菌肽 D基因和天蚕抗菌肽 B基因通过农杆
菌同时导入广藿香中, 获得较强抗病性的转基因植
株。我们在藿香的栽培过程中发现藿香有青枯病、
卷叶螟等病虫害,本研究通过对其转化体系的初步
探索, 为今后藿香抗虫、抗病基因的导入奠定了基
础。另一方面, Hye[ 4 ]报道了从藿香悬浮培养液中
提取迷迭香酸,本研究也为直接利用藿香转基因愈
伤组织提取迷迭香酸奠定了基础。
参 考 文 献
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