全 文 ：生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN·研究报告· 2008年第3期
收稿日期:2007-12-25
基金项目:山东优秀中青年科研奖励基金(2006BS06012)
作者简介:杜志兵(1980-),男,山东人,硕士研究生,主要从事分子微生物学的研究;E-mail:duzhibing331@163.com
通讯作者:杜秉海,教授,Tel:86-538-8242908;E-mail:bhdu@sdau.edu.cn
枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)是一类能够形成具有较强抗逆性芽孢的革兰氏阳性根际细菌,能产生
多种抗生素,对生物防治有深远的意义。
自 1945年 Johnson等报道枯草芽孢杆菌产生抗菌物质以来,人们对枯草芽孢杆菌不同菌株的研究中,
先后发现了 60多种结构各异的抗生素。这些抗菌物质主要包括肽类抗生素和非肽类化合物,它们中的大
多数分子质量较小(介于 0.3～ kD)[1~3]。其中 subtilin、ericin、mersacidin、sublancin等肽类抗生素是通过核糖
体途径合成的,而通过非核糖体途径合成的肽类抗生素有 surfactin、iturin family、fengycin以及 bacilysin等;
枯草芽孢杆菌产生的非肽类化合物主要有聚酮类化合物 difficidin、多烯 bacillaene、磷脂 bacilysocin以及氨
枯草芽孢杆菌MH25 Iturin A操纵子的克隆与分析
杜志兵 丁延芹 姚良同 朱彭玲 于素芳 杜秉海
(山东农业大学生命科学学院 山东农业大学农业微生物学重点实验室,泰安 271018)
摘 要: 根据已知非核糖体肽合成抗生素操纵子的保守序列设计引物,从对棉花立枯病有很好拮抗作用的枯草芽
孢杆菌(Bacillus subtilis)MH25菌株中克隆相关操纵子。获得了枯草芽孢杆菌MH25的一个非核糖体肽合成抗生素操纵
子序列,其包括 4个 ORF(ORF1,ORF2,ORF3,ORF4) ,与枯草芽孢杆菌 RB14的 ituD,ituA,tiuB和 ituC的同源性分别
为 99%,98.70%,98.99%和 9.48%,4个 ORF编码的氨基酸序列与 ItuD,ItuA,ItuB,ItuC的相似性分别为 98%,98.54%,
98.69%和 8%。然后将 4个 ORF分别进行结构域分析,ORF3的 14 779~14 963序列与 ituB相对应区域的相似性为
86.24%。该操纵子的启动子区为TATACACA-16bp-TAGGAT,与σA-10和-35(TTGACA-17bp-TATAAAT)不同。枯草芽
孢杆菌MH25的Iturin A操纵子序列已在GenBank中注册,登陆号为EU263005。
关键词: 枯草芽孢杆菌 NRPSs Iturin A操纵子 同源性
Molecular Cloning and Analysis of Iturin A Operon from
Bacillus subtilis MH25
Du Zhibing Ding Yanqin Yao Liangtong Zhu Pengling Yu Sufang Du Binghai
(College of Life Science,Shandong Agricultural University,Key L borato y for Agricultural Microbiology Shandong
Agricultural University,Taian 271018)
Abstract: Bacillus subtilis MH25 has obviously antibiotic against Rhizoctonia solani. Acording to conserved
Sequences of NRPSs of knowed antibiotic operons,we esigned primers. U ing these primers,we cloned the antibiotic
operon from Bacillus subtilis MH25. We obtained one operon,which has four open reading frames(ORF1,ORF2,
ORF3,ORF4) ,the homology to ituD,ituA, iuB,ituC of Bacillus subtilis RB14,re pectively,is 99%, 8.70%,98.99%,
99.48%. The homology of four proteins encoded by the four open reading frames to ItuD,ItuA,ItuB,I uC,respectiv ly,is
98%,98.54%,98.69%,98%. When analysised the founctional domains,we found that 14779~14963 sequence of ORF3
exhibits 86.24%homology to corresponding domain of ituB. The promoter of the operon is TATACACA-16bp-
TAGGAT,which is difference toσA-10 and -35(TTGACA-17bp-TATAAAT). The sequence of the operon obtained in
this study has been submitted to GenBank and the accession number is EU263005.
Keywords: Bacillus subtilis NRPSs Iturin A Operon Homology
2008年第3期
基糖 3,3,-Neotrebalosadiamine(NTD)等。
现在已有的克隆枯草芽孢杆菌的抗生素生物合成基因的方法有(1)根据已知抗生素生物合成基因的
保守序列设计探针,通过杂交方法克隆同源的抗生素生物合成基因[4];(2)根据已知抗生素生物合成基因
的保守序列设计引物,通过 PCR扩增的方法克隆同源的抗生素生物合成基因[5];(3)用转座子突变的方法
定位和克隆抗生素生物合成基因[6]。目前,国外已从枯草芽孢杆菌中克隆、鉴定了一些抗生素生物合成相关
基因。如枯草芽孢杆菌菌株 AU195的 bacilomycin基因簇[1]、菌株 168的 corynebactin基因簇[1]、菌株 A1/3的
ericin基因簇 [1]、菌株 ATCC6633的 mycosubtilin基因簇 [7]、菌株 RB14的 iturin基因簇 [8]及菌株 F29-3的
fengycin基因簇[9,10]等,但与拮抗棉花立枯病病原菌-立枯丝核菌相关的基因簇在国内外尚未见报道。
笔者曾从棉花根际土中分离到枯草芽孢杆菌菌株 MH25对棉花立枯病病原菌-立枯丝核菌具有很好
的拮抗作用。根据已知非核糖体肽抗生素生物合成基因的保守序列设计引物,从枯草芽孢杆菌 MH25中克
隆与拮抗棉花立枯病病原菌-立枯丝核菌相关的基因簇,并对基因簇进行了初步分析。
1 材料和方法
1.1 菌株、质粒、试剂
1.1.1 菌种 MH25、大肠杆菌 DH5α由本实验室保存。
1.1.2 质粒 PMD18-T购于宝生物工程(大连)有限公司。
1.1.3 试剂 分子生物学试剂购于宝生物工程(大连)有限公司,3S柱离心式琼脂糖 DNA小量快速纯化
试剂盒(3SSpinAgaroseGelDNApurificationkit)购于上海申能博彩生物科技有限公司。
1.2 DNA的提取
DNA的提取参考文献[11]。
1.3 引物的设计合成
根据国外现有的芽孢杆菌非核糖体合成抗生素的操纵子序列设计兼并性引物 TGD(5-TWYCGIACIGG
IGAYYKIGKICG-3)和 LGG(5-AWIGARKSICCICCISSRIMRAARAA-3),扩增的片段序列测定后在 NCBI上
blast,选择同源性较高的结果,分析其序列的保守区,设计合成其他引物。引物由北京博尚生物技术有限公
司合成。
1.4 PCR扩增
PCR反应体系(25μl)为 Taq酶 0.5μl,10×Bufer(Mg2+)2.5μl,dNTP(10mmol/Leach)0.5μl,引物各 1μl,
模板 DNA1μl,ddH2O19.5μl。
PCR反应条件为 95℃5min,94℃1min,60℃3min,72℃1.5min,30个循环,72℃延伸 10min。
1.5 感受态的制备
感受态的制备参考文献[12]。
1.6 胶回收、连接及转化
胶回收参考上海申能博彩生物科技生产厂家的说明书。连接、转化参考 TakaRa生产厂家的说明书。
1.7 序列测定及拼接
序列的测定由北京博尚生物技术有限公司完成。对所测定的序列在 NCBI上进行相似性比,再根据序
列间的重复序列进行序列拼接。
1.8 序列的初步分析
利用 DNAMan软件及 NCBI的 blast软件对操纵子序列进行分析。
2 结果与分析
2.1 枯草芽孢杆菌 MH25非核糖体肽操纵子保守序列的克隆
用兼并引物 TGD:5-TWYCGIACIGGIGAYYKIGKICG-3和 LGG:5-AWIGARKSICCICCISSRIMRAARAA-
杜志兵等:枯草芽孢杆菌MH25IturinA操纵子的克隆与分析 129
生物技术通报Biotechnology Buletin 2008年第3期
3扩增,根据引物设计时的大约长度选取 800bp左右的片段
(图 1),并将其连接在克隆载体 pMD18-T,获得 pMD18-TM1。序
列测定后,在 NCBI上进行相似性分析,该保守性 DNA片断
(M1)与 B.subtilisRB14的 iturinA操纵子的 30910~31726序
列、B.subtilisATTCAU195bacilomycinD操纵子的 28825~29
247序列和 B.subtilisATCC6633mycosubtilin操纵子的 28997~
29654序列相似性分别为 99%、81%和 80%。
2.2 保守性片断 M1左端序列的克隆
在 M1的 580bp处设计特异性下游引物;根据 M1在 NCBI
上的比对结果,选择相似性较高的 B.subtilisRB14的 iturinA操
纵子序列、B.subtilisATTCAU195的 bacilomycinD操纵子序列、
B.subtilisATCC6633的 Mycosubtin操纵子序列,分析它们左侧的保守序列,设计 14对引物(表 1),相临片
段之间有不同长度的重叠序列。
扩增出来的 DNA片段在 NCBI上比对分析,确定与拮抗相关的片段之后,利用上述相临片段之间的重
叠序列进行拼接,获得 28247bp的 DNA片断。
2.3 保守性片断 M1右端序列的克隆
在 M1的 300bp处设计特异性上游引物,然后根
据 M1在 NCBI上的比对结果,选择相似性较高的 B.
subtilisRB14的 iturinA操纵子序列、B.subtilisATTCA
U195的 bacilomycinD操纵子序列、B.subtilisATCC6
633的 Mycosubtin操纵子序列,分析它们右侧的保守
序列,设计 6对引物(表 2),相临片段之间有不同长
度的重叠序列。
扩增出来的片段在 NCBI上检测是与拮抗相关
的片段之后,利用上述相临片段之间的重叠序列进
行拼接,获得 9758bp的 DNA片段。
图 1 扩增的结果
注:1.用 LGG和 TGD兼并
引 物 扩 增 枯 草 芽 孢 杆 菌
MH25结果 2.用 LGG单引
物扩增枯草芽孢杆菌 MH25
结果 3.用 LGG单引物扩
增枯草芽孢杆菌 MH25结果
表 1 引物序列
表 2 引物序列
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2008年第3期
2.4 序列拼接及初步分析
根据上述 3段序列之间的重叠序列,将序列拼接,最终长度是 38845bp,在 GenBank中注册,登陆号为
EU263005。
利用 DNAman软件,将 B.subtilisMH25序列与 B.subtilisRB14的 iturinA操纵子序列、B.subtilisATTCA
U195的 bacilomycinD操纵子序列和 B.subtilisATCC:6633的 Mycosubtin操纵子序列进行比较,结果发现
相似性分别为 98%,85.47%和 76.38%,因此,参考 iturinA操纵子对该序列进一步分析。
2.4.1 ORF分析 用DNAman软件,对获得的 MH25操纵子序列进行ORF分析,发现该序列含有4个 ORF,
将其 4个 ORF分别与 B.subtilisRB14的 iturinA操纵子序列的 4个对应 ORF序列进行比对,发现 MH25该
操纵子序列的 ORF1与 ituD相似性为 99%,ORF2与 ituA相似性为 98.70%,ORF3与 ituB相似性为
98.99%,ORF4与ituC相似性为99.48%。ORF3的 14779~14963序列与ituB相对应区域的相似性为86.24%,
根据MartinaRembold[7]和MakotoShoda[8]对序列的分析结果,初步推测该序列可能与异构化作用有关。
氨基酸序列比较发现,获得的 MH25操纵子的 4个 ORF编码的氨基酸序列与 ItuD、ItuA,、ItuB和 ItuC
的相似性分别为 98%、98.54%、98.69%和 98%。
2.4.2 启动子区分析 分析 ORF1上游序列发现,转录起始位点是在 ORF1上游 56bp的 A处,转录起始
位点上游有 TATACACA-16bp-TAGGAT序列,其与 σA-10和-35(TTGACA-17bp-TATAAAT)有差别,推测可能
是启动子区(图 2)。
总上分析,绘制出 B.bacilusMH25iturinA操
纵子序列结构示意图(图 3)。
3 结论
通过对芽孢杆菌非核糖体肽抗生素合成操纵
子序列的分析,设计保守区域引物,从枯草芽孢杆
菌 MH25中克隆了与拮抗棉花立枯病(Rhizoctonia
solaniKuhn)的 iturinA操纵子,进一步分析其 4个
ORF,该序列与 iturinA的相似性最高。因此,初步
认为 MH25可能产生伊枯草芽孢杆菌素。MakotoS.
等 [8,13]报道了枯草芽孢杆菌 RB14的 iturinA操纵子
与其拮抗番茄立枯病有关;MH25对棉花立枯病具
有很强的拮抗作用。因此,推测 MH25的 iturinA操纵子可能是与拮抗棉花立枯病相关的操纵子。而对拮抗
棉花立枯病相关的操纵子国内尚未见报道。对该操纵子的进一步验证正在进行中。
参考 文献
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图 2 B.bacilusMH25iturinA操纵子启动子区
图 3 B.bacilusMH25iturinA操纵子结构示意图
杜志兵等:枯草芽孢杆菌MH25IturinA操纵子的克隆与分析 131