全 文 ：综述与专论
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2011年第 5期
里氏木霉及其纤维素酶高产菌株的研究进展
覃玲灵 何钢 陈介南
(中南林业科技大学生物环境科学与技术研究所,长沙 410004 )
摘 要: 随着纤维素在能源、材料及化工等领域的广泛开发和应用, 里氏木霉作为一种重要的产纤维素酶工业用菌种,
越来越受到人们的广泛关注。为了提高其酶活,人们做了大量的工作, 获得了一些相当好的突变株。对里氏木霉及其突变株
的基因组进行研究, 有助于人们理解其高效产酶的机制,同时也有利于构建其基因工程菌。介绍里氏木霉 T r ichoderma reesei
的背景及其部分高产纤维素酶突变株,并阐述近些年来对其突变株的基因组的研究进展。
关键词: 里氏木霉 纤维素酶 突变株 基因组 SNV
Research Development ofTrichoderma reesei and
Its Cellulase Hyperproduction Strains
Q in L ing ling H eGang Chen Jienan
( Institute of B io log ical and Environmental Science& T echnology,
Central South University of Forestry and Technology, Changsha 410004)
Abstrac:t A s w ide ly deve lopm ent and utilization of ce llulose in the fie ld of energy, m ate rials and chem istry industry, T r ichoderma
reesei has been caught m ore and m ore attention for its be ing a k ind of im portant ce llu lase stra in for industry. Fo r enhanc ing its cellu lase
product, peop le have done a lot of work on it, and ob tained seve ra l cons iderably good mutant strains. T o learn the genom e o fT r ichoderma
reesei and its mu tant strains is he lp fu l to us understand its system o f ce llulase hype rproduction, also he lp fu l to people construct its g enet
ic eng ineering stra in in the future. Th is article introduced the background o f T richoderma reesei and part of its hyperce llulaseproduct
stra ins, a lso elabo rated the research deve lopm ent of its m utan t strains genom e in the recent yea rs.
Key words: T richoderma reesei Cellu lase Mu tant stra in Genom e SNV
收稿日期: 20101124
基金项目:国家林业局 948项目 ( 20064123 )
作者简介:覃玲灵,女,硕士研究生,研究方向:生物质能源; Em ai:l canaceiling@ 163. com
通讯作者:何钢,男,教授,从事生物技术教学和科研; Em a i:l hegong262@ yahoo. com. cn
1 背景
随着人口不断增长,以及现有的煤、天然气和石
油存储量的减少,发展新能源成为实现经济社会可
持续发展的必经之路。以纤维素、半纤维素和木质
素形式存在的生物质收集并且存储了大量太阳能,
是一种重要的能源和物质资源 [ 1 ]。地球上最主要
的生物质来自绿色植物, 每年光合作用的生物质净
产量约为 1 800亿 t[ 2]。生物质中含量最多的是纤
维素, 其由成百上千个葡萄糖分子聚合而成,是地球
上存在最丰富的有机大分子, 储量约为 850亿 t[ 3 ] ;
其次是半纤维素,储量约为 500亿 ;t第三类是木质
素,由结构复杂的含芳香环的有机分子聚合而成,约
占 20% ,即 350亿 t[ 4]。这些生物质大多以农业和
林业废弃物的形式存在,并且每年都在大量积累,这
不仅会导致环境的恶化, 而且会导致这种可利用资
源的流失 [ 1]。因此如何充分利用这些资源成为迫
在眉睫的问题,在对生物质的开发利用中,一个重要
瓶颈就是如何高效利用微生物进行酶催化水解将生
物质降解为单糖 [ 5]。
自然界中能降解和利用纤维素的微生物种类
很多, 许多细菌可分解纤维素, 而且产生的纤维素
酶具有高度专一性, 但是它们生长速度慢, 需要厌
氧的生长条件 [ 6] , 这些都限制了其应用。真菌所
产生的纤维素酶多是胞外酶, 便于分离和提取, 且
生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2011年第 5期
产生的纤维素酶各组分较为齐全, 所以一般用于
工业化生产的纤维素酶大多来自于真菌 [ 7] , 在这
些真菌中, Trichoderma属, 尤其是里氏木霉 ( Tri
choderma reesei)被广泛地用于生产纤维素酶 [ 8- 24]。
迄今为止, 产纤维素酶能力最强的微生物是里氏
木霉 [ 25] , 它也是产纤维素酶和半纤维素酶的主要
工业生产菌种 [ 26]。
2 Trichoderma属及其纤维素酶
21 Trichoderma属
Trichoderma属包括了一组有多种代谢功能的
好氧嗜温的菌种,在大多数气候带的土壤中都普遍
存在 [ 27] ,特别常见于潮湿的枯枝落叶中以及硬木林
中 [ 28]。许多 Trichoderma属是非常好的产酶菌, 因
此其作为生物技术中潜力巨大的微生物而受到广泛
关注。此外,一些 Trichoderma属还具有抗性特征,
能够作为生物控制菌对抗植物病原体 [ 29- 31]。
Trichoderma的概念最早由 Persoon[ 32]引入, 开
始概括的 Trichod erma主要有 4个菌种, 即 T. aure
um、T. nigrescens、T. roseum以及 T. viride,不同分生孢
子的颜色是种间的区别, 现在人们已经认识到它们
是彼此无关的种类。Trichoderma现在仅用于描述
以 T. viride为代表的绿色类型的真菌 [ 34]。R ifa it[ 33]
依据微观特征, 界定了 T richoderma属。T richoderma
属的分生孢子梗排列成规则的树状结构而且是重复
多次分枝; 开始形成的分枝较长,后续形成的分枝
随着离基部距离的增加而逐步变短, 多数土壤以
及木材上生长的 Trichoderma菌株, 其有性型还未
观察到, T richoderma中的许多常见种类无有性
世代 [ 34]。
绿色木霉 (Trichoderma virid e)因其在 1944年第
二次世界大战期间一直在毁坏驻扎于东南亚所罗门
群岛上的美军的棉衣和帆布帐篷而被人们发现 [ 35 ]。
在 20世纪 70年代后期, 美国陆军 Nat ick实验室科
学家 E lw yh Reese首次分离出 T richoderma的特定菌
株 QM6a, 被认为是属于长枝木霉 (T. longibrachia
tum )的一种截然不同的类型。为了纪念 E lwyn
Reese的杰出贡献, 1977年,绿色木霉更名为里氏木
霉 (Trichod erma reese)。此时,人们对微生物生产的
纤维素酶及其在生产生物燃料中可能会起到的作用
重新有了兴趣,也意识到纤维素的酶转化过程会是
阻碍其商业化的瓶颈 [ 35]。
22 纤维素酶
木质纤维素降解为小分子糖是一个非常复杂的
过程,需要几十种酶的相互协同参与, 首先破坏植物
细胞壁的复杂结构,进而降解木质素、纤维素和半纤
维素 [ 4]。一个完整的纤维素酶系通常由作用方式不
同的 3类酶组成 [ 36- 40] :内切葡聚糖酶 ( endo1, 4D
g lucanase, EC3214,简称 EG)或称为 Cx酶,这类酶
作用于纤维素分子内部的非结晶区,随机水解 1, 4糖
苷键,产生大量的有非还原端的小分子纤维素; 外切
葡聚糖酶 ( exo1, 4Dg lucanase, EC32191, 简称
CBH)或称为 C1酶,这类酶主要作用于纤维素线状分
子的末端,水解 1, 4糖苷键, 每次切下一个纤维二
糖分子; 葡萄糖苷酶 ( g lucosidase, EC32121,也
称 BG或纤维二糖酶 ), 它的作用是水解纤维二糖及
低分子量的纤维寡糖生成葡萄糖。
Trichoderma reesei已经被证实能够分泌大量高
效的纤维素酶 [ 41 ] ,这种能力使它成为工业生产中最
主要的菌株, Trichoderma reesei的胞外纤维素系统由
60% - 80%的外切葡聚糖苷酶, 20% - 36%的内切
葡聚糖苷酶和 1%的 葡聚糖苷酶组成, 这些酶协
同作用将纤维素转换成葡萄糖 [ 42, 43]。
3 Trichoderma reesei的高产突变株
诱变选育是提高菌株酶活的一种有效方法 [ 44]。
为了提高酶的产量,从 20世纪 60年代末开始,很多
实验室都从 Trichoderma reesei野生菌株 QM6a出发,
将重点集中在对 Trichoderma的直接诱变和对高产
菌株的筛选上 [ 35]。突变株的关系图谱 (截至 1994
年 )如图 1所示 [ 1, 35, 45 - 47]。
31 T. reesei RUT C30
在美国 Rutgers大学,以及美国 Massachusetts州
的陆军 Nat ick实验室和加州大学伯克利分校的化
学工程系,分别使用摇瓶和大型发酵罐进行了两次
酶活测定后, 表明 T. reesei Rut NG14和 Rut C30都
是突出的纤维素酶生产菌株 [ 48 ]。
事实证明, T. reesei RUT C30是最好的产酶菌株
之一 [ 48]。它是通过 3步诱变得到的, 首先, 在代谢
物抑制条件下,通过水解纤维素酶活的筛选,进行紫
外线诱变,得到菌株 M7(这株菌现已不再使用 ); 其
次, 通过化学诱变 (亚硝基胍 )和一个过程与前者相
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似但更严格的酶活筛选之后, 从 M 7中分离出了菌
株 NG14,在胞外蛋白和纤维素酶活力方面, NG14
与亲本株以及其他可用的纤维素酶突变株相比都提
高了几倍 [ 48] ; 最后, 对 NG14经过紫外线诱变, 由于
2脱氧葡萄糖6磷酸的积累会很快导致生长抑
制 [ 49] ,所以经过 2脱氧葡萄糖的抗性筛选从而消除
代谢抑制后,再用一个与前者过程相似的纤维素水
解法, 得到菌株 RUT C30[ 50]。 Rut C30刚分离出来
时纤维素酶的产量能够达到 15 FP un its / ( L h) ,
能产出大约 20 mg /mL的胞外蛋白, 与它的亲本菌
株 NG14相比,胞外蛋白的产量多了 2倍,达到 2%,
在工业发酵罐中的产量超过了 30 g /L,达到了工业
需求的酶产量 [ 51]。通过细胞固定化技术, 能够将其
产量增加到 135 FP un its/ ( L h)并能维持 15 d, 这
同样显示了抗代谢物阻遏的特性 [ 52]。因此, 突变株
C30和 NG14 比起野生型 QM6a 菌株的 FPA
( 05- 10 FP units/mL )都提高了大约 15 - 20
倍 [ 1]。与其他 Trichoderma菌株相比, T. reesei C30
产的外切葡聚糖苷酶稳定性最高:在 pH50, 50 的
条件下培养 30 d,只有 28%的酶失活 [ 1]。
图 1 T. reesei QM6a的突变系谱
32 T. reesei RL P37
1983年, M ontenecourt和 B loomsbury[ 45] 在 Le
h igh大学分离出了 RL P37, 其除了比它的亲本株
Rut NG14的酶活更高之外,重要特性是可以在大约
37 的高温中生长良好, 并且可以保持较高的生长
率,这对于提高胞外糖蛋白酶的产量非常有利,当温
度降至大约 28 时, 酶能够得到最优表达; RL P37
的另一个重要特性是对代谢物阻遏具有抗性, 如它
可以在玉米酿造酒精的过程中产酶, 但不会被其他
的代谢产物,例如甘油所阻遏 [ 45]。
与野生型 QM6a 18 IU / ( L h)的酶活相比, RL
P37的酶活为 108 IU / ( L h), FPA提高了 4- 5倍,
并且相比其他 T. reesei菌株, 如 QM6a、QM9414、
NG14、MCG77和 L27, RL P37的 FPA和内切葡聚
45
生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2011年第 5期
糖苷酶的酶活都提高了 2倍 [ 45]。
除 Rut30之外,人们还获得了不少优良的突变
株, 如 QM9414、MCG77。此三株是至今研究得最
多、应用最广泛的里氏木霉菌株 [ 51, 52]。MCG77虽然
提高了酶活,但还是受到代谢物阻遏 [ 1 ]。其他重要
的突变株及其突变后的产量如表 1。
表 1 生产纤维素酶的微生物和诱变后增加的产量 [ 1]
微生物 FPA (V /mL) CBH (V /m L 10- 3 ) EG (V /mL) BG (V /m L)
Trich od erm a reesei QM 6a 055 1891 59 03
T. reese iQM 9123 168 2926 96 05
T. reese iQM 9414 95 570 110 09
T. reese iMCG 77 105 608 100 135
T. reese iNG 14 146 589 135 03
T. reese i C 30 140 150 11
S clerotium rolf sii CM C 142 14 200 18
S. rolf sii UV 8 20 190
4 突变机制
41 基因组的特点
2008年对 T. reesei基因组序列的测序已经完成,
美国 Los A lamos National Laboratory和 Jo int Genome
Institute等的 M artinez等 [ 53]根据所获得的数据对 T.
reesei基因组分析,预测长度为 339M b的 T. reesei基
因组序列大约由 9 129个基因模型组成,其中编码基
因大约占 4040%, GC含量大约为 52%。编码纤维
素酶的基因总共只有 10个: 1个 CBH1( cel 7A )、1个
CBH2( cel 6)、1个 EG1( cel 7B )、2个 EG2( cel 5)、1个
EG3( cel 12)、3个 EG4( cel 61)、1个 EG5( cel 45), 编
码半纤维素酶的基因总共也只有 16个,这使得它的
半纤维素酶系在所分析的所有真菌中最小。
T. reesei基因组的第二个特点是许多糖水解酶
的基因在基因组中成簇分布, 41%的糖水解酶基因
簇在分布于长度为 14 kb到 275 kb不等的 25个不
连续的区域中 (大约 24M b), 并且基因重排多于基
因重复,这种分布可能有利于糖水解酶类基因表达
的高效调控 [ 53]。
与其他已完成测序的同样可以降解植物细
胞壁的真菌相比, 它只有少量基因编码纤维素酶
和半纤维素酶,大部分基因用来编码利于 T. reesei
在土壤中生存的次级代谢物, 这有助于解释其产
生大量纤维素酶和半纤维素酶的机理和它能够
高效转换纤维素并大量分泌胞外蛋白酶的原因 [ 53]。
基因组分析结果显示, Trichoderma reesei基因组
含有 200个糖水解酶 ( GH )基因, 与该纲其他的丝状
真菌 (N eurosproa crassa 171、Magnaporthe grisea231
和 Fu sarium gram inearum 243)的平均值 215相差不
大, 但其含有的纤维素结合蛋白数目却是最少的,只
有 36个, 其中经典的纤维素酶 ( endo和 exo)最少,
只有 11个,基因组数据分析表明, T. reesei含有较多
的与分泌途径相关的基因, 如蛋白质降解途径的内
质网相关基因和分泌相关的膜融合蛋白基因 [ 53]。
这一结果与 1981年 Rutgers大学的 Eve leigh和 Mon
tenecourt的发现相符。研究发现, 当 Rut C30在生
长阶段大量分泌纤维素酶时, 细胞中的内质网高度
生长,并且内质网的数量比在 QM 6a细胞中的更多。
最初的研究结果表明, 在分泌的显著时期, Ru t C30
内质网中的基质比野生株 QM6a内质网中的基质多
了6- 7倍。由于内质网与胞外酶的合成有关, 他们
认为在 Rut C30中内质网数量的增加与纤维素酶的
高产量有直接关系 [ 54 ] ,而这种类型的突变在其他分
泌机制中很少见 [ 48]。
42 高产突变株的基因变异
Rut C30在 T. reesei的高产纤维素酶菌株中已
经成为一株参考菌, 应用于多种研究领域之中。但
是其产酶的相关机制还有许多未阐明的方面, 虽然
绝大多数用于工业生产的丝状真菌是用传统的突变
方法筛选出来的, 但这些突变的基因位点只有小部
分已经明确 [ 26]。
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2011年第 5期 覃玲灵等:里氏木霉及其纤维素酶高产菌株的研究进展
为了弄清传统的突变方法是如何提高菌株纤维
素酶的产量的, 2009年 Stephane Le C rom等 [ 26 ]利
用大规模平行测序和 Illum ina So lexa技术确认两个
由野生型 T. reesei QM6a得到的纤维素酶高分泌突
变菌株的基因组的突变序列。研究发现, 基因突变
的数量非常高: 223个单核苷酸突变, 15个短的缺失
或是插入,以及 18个更大的缺失 ( > 90 bp) ,导致了
超过 100 kb的基因组 DNA的丢失。根据测序结
果,在 43个主要涉及细胞核的转运、mRNA的稳定
性、转录、分泌 /液泡定位和新陈代谢的基因中,发现
了其中以前没有资料记载过的非同义突变 , 这种
功能分类的同质性表明 , 对提高纤维素酶的产量
而言复杂的变化是必要的, 并不简单的是一些明
确的突变事件,而表型基因芯片检测显示这些突
变中的一部分导致了这两个突变株与野生株
QM6 a碳同化模式的强烈不同 [ 2 6]。
在所有突变中, 最主要的突变是单核苷酸的改
变。在 T. reesei NG14中找到了 126个突变位点,另
外有 97个特定的单核苷酸突变只发生在 Rut C30
中,这样在 Ru t C30中总共就有 223个 SNV s, 由突
变引起的已确定的 SNV在 T. reeseiNG14和 Rut C30
之间存在着显著性差异, NG14中 30%的核苷酸改
变都是 AT GC,然而这些在 Rut C30的特定突变
中只占了 9%, 在 Rut C30中, 75% 的改变都是 G
CAT, 这些都与对 NG14使用两种不同的诱变剂
(亚硝基胍和紫外线 ) , 对 Rut C30只使用紫外线诱
变的情况相符。据报道, 用亚硝基胍诱变主要会导
致 AT GC的突变 [ 52] , 与试验中在 NG14中观察
到的类型一致, 24个点突变中的 19个 ( 79% )映射
到 NG14的外显子, 以及 43个中的 25个 ( 58% )映
射到 Rut C30的外显子都是非同义突变,因此, 这些
都有可能会影响相关蛋白质的特性。值得注意的
是,突变显示发生在 Ru t C30突变过程期间的蛋白
质修饰 ( 25% )比发生在 NG14突变过程期间的
( 15% )更为显著, 这可能与不同的筛选条件有关
(例如 Rut C30对 2脱氧葡萄糖的抗性 ) [ 26]。
通过对 Rut C30进行核型电泳分析,表明染色
体进行了重排, QM 6a的 15个插入或缺失的单核苷
酸突变,有 11个在两株菌中都有出现,有 4个只出
现在 Rut C30中 [ 26]。
5 应用与展望
Trichoderma reesei产生的纤维素酶广泛应用于
食品、饲料和制药等行业。在日本,包括 QM6a在内
的真菌产纤维素酶,从 1960年就开始大规模商业化
生产。在食品工业中,纤维素酶制剂广泛应用于多
种提取过程 [ 57] , 还应用于烘烤 [ 58]、研磨 [ 59]、酿造 [ 60]
和酿酒 [ 58]上。在饲料工业中, 纤维素酶制剂被用于
提高饲料的可消化率 [ 54]。制药工业中,纤维素酶有
助于消化 [ 57]。纤维素酶还在木料加工 [ 62] 和纺
织 [ 63]方面都有应用。目前并没有资料表明 Tri
choderma reesei是人类的病原体, 在用老鼠、豚鼠和
兔子进行 T. reesei致病性研究后, 得到的数据表明
T. reesei并不具有致病性 [ 64]。只有在极端条件下,
对免疫力受到抑制的动物接种大量的孢子, 这种微
生物才会成为病原体,这与其他在酶工业中熟知的
真菌相类似, 如 Rhizomucor m iehei 及 A sp erg illus
属 [ 64]。一些霉菌的孢子能够引起过敏反应 [ 65] , 与
这些霉菌相比, T. reesei既不会引起过敏反应, 也没
有任何必要进行特别的职业卫生防护措施 [ 64 ] ,它是
比较安全的。
虽然很早就已经开始了对产纤维素酶的真菌研
究, 但真菌合成纤维素酶的活性依然不高,这极大地
影响了纤维素酶在工业化生产中的应用。而关于纤
维素酶的研究主要集中在微生物分离、选育、产酶条
件优化以及一些已知纤维素酶基因的克隆和异源表
达上,在以后的研究中, 充分运用分子生物学技术,
对各种纤维素酶合成过程所涉及的基因及其调控因
子的调控模式进行探索, 将有助于在分子水平上揭
示纤维素酶表达调控的机理。在调控机理的指导
下, 可以有目的地设计纤维素酶的高效表达诱导
物 [ 7] ; 另一方面通过科学家对基因组数据的分析,
构建更适于工业应用的 T. reesei工程菌变得更有可
能 [ 53]。通过基因调控阻断纤维素酶表达的阻遏途
径, 同时调控转录激活因子等上游调控元件以增强
纤维素酶启动子的启动能力, 从而提高纤维素酶表
达量和酶活,以满足其在工业中的应用 [ 7]。
参 考 文 献
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