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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2011 年第 9 期
表观遗传学研究方法进展
郑小国1． 2 陈亮1 楼巧君1 罗利军1． 2
(1上海市农业生物基因中心，上海 201106;2华中农业大学，武汉 430070)
摘 要: 表观遗传调控是基因表达调控的重要组成部分，已成为当前研究的热点。目前其研究主要集中在 DNA甲基化
和组蛋白修饰。针对这两种表观修饰，其研究方法也取得了较大进展，一方面方法的灵敏度和特异性都在不断提高;另一方
面表观修饰的检测正在逐步从定性检测向定量分析方向发展，从个别位点向高通量检测发展。此外，新一代测序技术的应用
将大大推动表观遗传研究的发展，包括单分子实时测序法、单分子纳米孔测序法等。综述目前常用的 DNA 甲基化、组蛋白修
饰研究方法以及最新的单分子测序技术，并对它们在表观遗传修饰检测中的应用作了简要对比分析。
关键词: 表观遗传学 DNA甲基化 组蛋白修饰 限制性内切酶酶切法 重亚硫酸盐法 染色质免疫共沉淀 单分
子实时测序 单分子纳米孔测序
Research Method Progress of Epigenetics
Zheng Xiaoguo1． 2 Chen Liang1 Lou Qiaojun1 Luo Lijun1． 2
(1Shanghai Agrobiological Gene Center，Shanghai 201106;2Huazhong Agricultural University，Wuhan 430070)
Abstract: Epigenetic regulation has become a hotspot in the study on gene expression regulation． Epigenetic regulation mainly fo-
cuses on DNA methylation and histone modification． A great deal of techniques has been developed to detect these epigenetic modifica-
tions and great progresses have also been achieved in terms of detection sensitivity and specificity，qualitative and quantitative assay．
The next-generation sequencing technologies will greatly promote the development of epigenetic research providing a chance for rapid
and high throughput epigenetic detection，which include the single-molecular，real-time sequencing，single-molecule nanopore DNA se-
quencing． This review introduced the most commonly used and newly developed techniques，and made a brief comment about their ap-
plications in the detection of DNA methylation and histone modification．
Key words: Epigenetic DNA methylation Histone modification Restriction endonuclease enzyme digestion Bisulfate
Chromatin immunoprecipitation(ChIP) Single-molecular real-time sequencing Single-molecule nanopore DNA sequencing
收稿日期:2011-04-07
作者简介:郑小国，男，博士研究生，研究方向:表观遗传学;E-mail:zxg08@ sagc． org
通讯作者:罗利军，男，研究员，博士，研究方向:水稻节水抗旱;E-mail:lijun@ sagc． org． cn
表观遗传(epigenetic)是指 DNA 序列不发生变
化，但基因表达却发生了可遗传的改变。这种改变
是细胞内除了遗传信息以外的其他可遗传物质发生
的改变，且这种改变在发育和细胞增殖过程中能稳
定遗传［1，2］。
表观遗传学的现象很多，DNA 甲基化(DNA
methylation)、组蛋白修饰(histone modification)、基
因组印记(genomic imprinting)、RNA编辑(RNA edi-
ting)、基因沉默、核仁显性、休眠转座子激活和性别
相关性基因剂量补偿效应等都是典型的表观遗传现
象［3，4］。表观遗传研究目前主要集中在 DNA 甲基
化和组蛋白共价修饰两方面。
DNA甲基化(DNA methylation)是常见的表观
遗传现象，它是指在 DNA甲基转移酶(DNA methyl-
transferases，DNMTs)的作用下将甲基添加在 DNA
分子中的碱基上。常见的 DNA 甲基化发生在 DNA
链上的胞嘧啶(C)第 5 位碳原子和甲基间的共价结
合形成 5 甲基胞嘧啶(5mC)［5，6］。除此以外，在腺
嘌呤(A)N6 位置可以引入一个甲基形成 N6 甲基腺
嘌呤(N6-mA)。在真核生物中，DNA 甲基化主要发
生在 CpG二联核苷酸上，也常在植物基因组 CNG
和 CNN 序列上发现［7，8］。在某些区域，CpG 序列密
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度很高，可达均值的 5 倍以上，成为 C 和 G 的富集
区，就像在 DNA 序列汪洋大海中浮现的一座座孤
岛，称为 CpG岛(CpG islands)［9］。作为表观遗传学
最重要的现象之一，DNA甲基化对基因的表达发挥
着重要的调控功能，涉及异染色质形成、转座子扩散
防御、基因印迹、源基因表达调控、转基因沉默和细
胞分化等，在生命活动中起着重要的作用［3，4，10］。
组蛋白共价修饰(histone modification)包括［11］:
乙酰化(acetylation)、甲基化(methylation)、磷酸化
(phosphorylation)、核糖化(ribosylation)、泛素化
(ubiquitylation)和类泛素化(sumoylation)。这些修
饰共同构成了可以通过特殊解码蛋白解读的组蛋白
密码，在解码过程中影响基因表达［12，13］。其中乙酰
化和甲基化主要发生在组蛋白 lys 残基上，乙酰化
与转录激活相关;甲基化既可能与转录激活相关，也
可能与转录抑制相关，激活或抑制取决于甲基化 lys
位点以及添加的甲基基团数目［8，14，15］，每个 lys 残基
可以加上 1 － 3 个甲基基团，形成单甲基化、二甲基
化、三甲基化 3 种形式，每种形式有其独特的功
能［16］。磷酸化是另外一种重要的调控方式［17］，在
基因转录、DNA 修复、细胞凋亡以及染色质凝聚等
过程中起重要作用。核糖化［18］是指组蛋白 H1、
H2A、H2B 及 H3 和多聚 ADP-核糖的共价结合，
ADP-核糖基化被认为是在真核细胞内启动复制过
程的扳机;泛素化［19］是指将被降解的蛋白质连接上
泛素标记，一些可以诱导基因启动子区域的 H2B 组
蛋白会被修饰以启动基因表达;类泛素蛋白［20］
(small ubiquitin-like modifiers，SUMO)对蛋白质的翻
译后修饰被认为与蛋白质的细胞内定位、稳定性和
转录活性有关，也可能参与异染色质结构的调节。
近年来，人们越来越认识到表观遗传在基因表
达调控方面的重要性，并开发出一系列检测表观遗
传修饰的方法，尤其是 DNA甲基化和组蛋白修饰检
测方法取得了较大进展，一方面方法的灵敏度和特
异性都在不断提高;另一方面表观修饰的检测正在
逐步从定性检测向定量分析方向发展，从个别位点
向高通量检测发展。
1 DNA甲基化研究技术
目前全基因组或接近全基因组甲基化检测技术
较多，主要分为 3 类:第 1 类技术以限制性内切酶酶
切为基础，用一个或多个酶限制性切割未甲基化
DNA(如 Hpa II 和 Not I)或甲基化 DNA (如
McrBC)。这些方法结合芯片、毛细管测序［21］等技
术已经检测了多种生物的全基因组甲基化，但仅限
于内切酶能够识别的 CpG 位点。第 2 类技术依赖
于全基因组 DNA重亚硫酸盐转换，经重亚硫酸盐处
理后基因组 DNA 未甲基化胞嘧啶(C)转换为尿嘧
啶(U) (经扩增后最终为 T) ，甲基化 C 保持不
变［22］。此方法可以进行单 CpG 位点解析并且可以
结合芯片或高通量测序。但此方法的局限性在于经
过重亚硫酸盐转换后，序列特异性降低，在芯片上难
以设计足够的特异性探针进行全基因组分析。此
外，如果用于较大基因组日常分析，此方法十分昂
贵。第 3 类技术以免疫学为基础，用 5-甲基胞嘧啶
特异性抗体或者用含有甲基结合结构域的蛋白通过
免疫沉淀富集基因组甲基化或未甲基化片段［23］，称
为甲基化 DNA 免疫共沉淀(methylated DNA immu-
noprecipitation，MeDIP or mDIP)［10，24 － 28］，MeDIP 结
合芯片(MeDIP-chip)技术可以对任何物种进行高通
量全基因组 DNA甲基化作图［29］。
以上 3 类技术可以与测序或芯片技术组合形成
多种方法:如酶切结合测序、酶切结合芯片技术、亚
硫酸氢钠结合测序、亚硫酸氢钠结合芯片技术、免疫
沉淀结合测序和免疫沉淀结合芯片技术等。
1． 1 以限制性内切酶为基础的 DNA 甲基化检测
技术
1． 1． 1 甲基化敏感扩增多态性(methylation sensi-
tive amplification polymorphism，MSAP) 本方法是
在扩增片段长度多态性(amplified fragment length pol-
ymorphism，AFLP)技术的基础上建立起来的［30，31］。
其基本程序是:提取基因组 DNA，根据 Hpa II、Msp I
两种酶对甲基化敏感程度不同，分别用 EcoR I /Hpa
II、EcoR I /Msp I 两组酶组合对基因组 DNA 进行双酶
切，连上接头后，用按照接头序列设计的引物加上一
个选择性碱基进行 PCR 扩增，称为预扩增。预扩增
产物稀释后，再加入另外两个选择性碱基引物进行第
二次 PCR 扩增，称为选择性扩增。扩增产物变性后
在 6%的 PAGE胶上电泳，最后采用银染或同位素放
射自显影方法处理 PAGE 胶，统计和分析 DNA 条带
即可得出基因组 CpG位点甲基化状态。还可以对差
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异扩增片段回收克隆测序，通过比对可鉴定甲基化差
异位点。MSAP技术相对其他 DNA甲基化测定技术
有如下优点:不需知道被测 DNA的序列信息;操作相
对简便，在 AFLP 基础上可直接操作;可在全基因组
范围检测 CCGG 位点的胞嘧啶甲基化变化。MSAP
技术的局限性在于只能检测 CCGG位点的胞嘧啶甲
基化。此方法常用于研究动植物全基因组甲基化
状态。
1． 1． 2 McrBC酶切法 McrBC是一个 DNA甲基化
特异性限制性内切酶，识别(A /G)C 基序中甲基化
的 C，切割一条或两条链上含有甲基化胞嘧啶的
DNA。McrBC 不作用于非甲基化的 DNA。McrBC
的 DNA识别位点包含两个(G /A)mC 形式的半位
点。半位点的间距最长可达 3 kb，但最适宜切割的
间距是 55 － 103 bp。McrBC 切割时需要 GTP 存在，
当存在 GTP的非水解类似物时，该酶可以特异性地
结合到甲基化的 DNA 上，而不产生切割反应。
McrBC在一对 PumCG序列元件上进行切割，因此可
以检测相当大一部分的甲基化 CpGs。
通常该方法结合芯片技术检测甲基化 DNA，其
基本程序是:首先用 McrBC 酶对全基因组 DNA 进
行酶切，然后将酶切片段与芯片杂交，对数据统计分
析检测甲基化 DNA。该方法的局限性在于:McrBC
不能识别内部胞嘧啶甲基化了的 Hpa II /Msp I 位点
(CCGG) ，而且该酶在每一对半位点之间切割一次，
切割位点靠近这一对半位点的一侧，但通常距最近
的甲基化碱基大约 30 bp。当 DNA 片段含有多个
McrBC识别半位点时(如含有甲基化胞嘧啶的基因
组 DNA) ，因该酶的切割位点具有不确定性，易导致
切割位点重叠［32］。
1． 2 重亚硫酸盐法
重亚硫酸盐法的原理是单链 DNA 在 HSO3 存
在的条件下能有效地将未甲基化 C 转变成 U，两轮
PCR扩增后，该位点变为 T，而 m5C 则保持不变，仍
然为 C。通过扩增克隆测序比对，可以鉴别待测位
点是否发生了甲基化［22］。该技术很容易确定个体
基因组 DNA 分子中各个单链的甲基化状态及甲基
化位置。
在此基础上，可以结合 DNA 直接测序、限制性
内切酶分析、甲基化特异性 PCR 扩、甲基化敏感的
单核苷酸引物延伸法、高效液相色谱法以及锁式探
针技术等方法测出相应序列的甲基化情况［33］。
1． 2． 1 重亚硫酸盐结合 DNA直接测序法 该方法
由 Formmer等［22］提出，其基本过程是:提取高质量
基因组 DNA平均分为两组，一组经重亚硫酸盐处理
转换，另一组作为对照。用引物进行扩增，对分别获
得的两组扩增片段进行测序对比，如果处理后一组
的 C 变为 T，则这些转变的位点为没有发生甲基化
的位点，若处理后仍然为 C，则这些位点发生了甲基
化。该方法适用于特定基因甲基化检测，如鉴定某
个基因在某种状态下的甲基化状态。
1． 2． 2 联合重亚硫酸盐限制性内切酶分析法 联
合重亚硫酸盐制性内切酶分析法(combined bisulfite
restriction analysis，COBRA)由 Xiong 和 Peter 报
道［33，34］，其基本程序是:先对样本 DNA 进行重亚硫
酸盐处理，PCR 扩增目的片段，随后用限制性内切
酶消化，此酶识别序列中需包含 CG 序列，如 BstU I
(CGCG)。若其识别序列中的 C 发生完全甲基化
(5mCG5mCG) ，则 PCR 扩增后保留为 CGCG，BstU I
能够识别并进行切割;若待测序列中，C 未发生甲基
化，则 PCR 后转变为 TGTG，BstU I 识别位点丢失，
不能进行切割。这样酶切产物再经电泳分离、探针
杂交、扫描定量后即可得出原样本中甲基化的比
例［35，36］。用 COBRA 和 Agilent 2100 Bioanalyzer 对
酶切产物进行直接分析，使 COBBA 的定量更快速、
准确且无放射性污染［37］。此方法相对简单，不需预
先知道 CpG 位点及样本序列;可对 DNA 甲基化水
平进行定量研究;需要样本量少，可用于石蜡包埋样
本的分析。本方法的局限性在于只能获得特殊酶切
位点甲基化情况，因此检测阴性不能排除样品 DNA
中甲基化存在的可能。此方法常用于样本量少，
DNA甲基化定量检测试验中。
1． 2． 3 亚硫酸盐结合甲基化特异性 PCR法 甲基
化特异性 PCR(methylation-specific PCRMS-PCR)是
Herman等［38］首先提出的一种检测基因组 DNA 甲
基化水平的常用方法［33，38］。该法是将 DNA经重亚
硫酸盐处理，非甲基化的胞嘧啶转变为尿嘧啶，而甲
基化的胞嘧啶保持不变。在 PCR 反应时，设计两套
不同的引物对:一对引物序列针对经亚硫酸氢钠处
理后的甲基化 DNA 链设计，若用该对引物能扩增出
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片段，说明该检测位点发生了甲基化;另一引物针对
经亚硫酸氢钠处理后的非甲基化 DNA 链设计，若用
该对引物能扩增出片段，说明该检测位点没有甲基
化。两套引物都具有很高的特异性［39］:引物末端均
设计至检测位点结束;两套引物分别只能与重亚硫
酸盐处理后的序列互补配对，即一对结合处理后的
甲基化 DNA 链，另一对结合处理后的非甲基化
DNA 链，与未经处理的 DNA 序列无互补配对;MSP
引物覆盖序列中必须含有一个或一个以上的 CpG
岛，以保证引物的特异性，经克隆测序就检测出引物
所覆盖序列的甲基化位点，引物覆盖序列中 CpG 岛
所占比例越高，甲基化 DNA检出率越高。该法不足
之处在于［40］:引物的选择和设计非常关键，否则易
导致假阳性;如果亚硫酸氢钠对 DNA 处理不完全，
也易导致假阳性。可通过限制性内切酶酶解法检验
PCR产物作进一步判断。
1． 2． 4 甲基化敏感的单核苷酸引物延伸法 甲基
化敏感的单核苷酸引物延伸法(methylation-sensitive
single-nucleotide primer extension，Ms-SNuPE)可用于
快速判断 DNA片段中某些具体位点的甲基化状况。
由 Gonzalgo and Jones提出［41］。其基本原理是:样本
DNA经重亚硫酸盐处理后 PCR扩增目的片段，产物
电泳分离后平均分为两份作为 Ms-SNuPE 模板。分
别针对所检测的 CpG 位点设计上游引物，使 3端引
物紧邻 C。扩增时加32P标记的 dCTP或 dTTP进行单
核苷酸延伸反应。如果待测位点被甲基化，则同位素
标记的 dCTP会在反应延伸时连于引物末端;若是未
被甲基化，则标记的 dTTP参与反应［42 － 44］。再电泳分
离产物，成像。根据某一 CpG 位点的 C /T 信号强度
比，可定量其甲基化程度。也可不经电泳，PCR 产物
直接转移到尼龙膜上，成像后即可得到所测多个 CpG
位点的平均甲基化程度。Ms-SNuPE可快速定量多个
CpG位点的甲基化程度，但序列较长时此方法不适
用，且此方法具有放射性。
1． 2． 5 高效液相色谱法(high performance liquid
chromatography，HPLC) Oefner 等［45］首先提出变
性高效液相层析(denaturing HPLC，DHPLC)用于单
核苷酸和 DNA 分析。邓大君等［46］将其改进并与
PCR 联用建立了一种检测甲基化程度的分析方法，
其原理是将经重亚硫酸盐处理的 DNA 进行差异性
扩增，由于原甲基化的胞嘧啶经重亚硫酸盐处理被
保留，因此在随后的 PCR 扩增时，其变性温度也相
应上升，使 PCR 产物在色谱柱中保留的时间明显延
长，从而判定出 PCR产物的 DNA 序列甲基化状况。
1． 2． 6 亚硫酸盐结合锁式探针法 锁式探针(pad-
lock probe)及其应用是 Nillssion 等首次报道
的［47，48］，其原理是只有当锁式探针和相应的检测靶
DNA同时存在于连接体系中且完全互补配对时，线
型锁式探针才能在连接酶的作用下被有效地连接成
环型，而在没有相应靶 DNA 存在时锁式探针不被
连接酶连接，仅以线性形式存在。在核酸外切酶的
作用下，线性形式存在的锁式探针被消化水解，而
连接成环状的锁式探针就可以在接下来的扩增反应
中得到扩增［49］。对扩增产物或扩增信号进行分析，
就可以判断连接体系中是否存在检测靶 DNA。锁
型探针以前是用来获取外显子并进行测序的［50］。
亚硫酸盐结合锁式探针法的基本程序是［51］:首
先合成长约 150 nt的寡核苷酸链，酶切裂解转换成
锁式探针;然后锁式探针文库与经重亚硫酸盐处理
的 DNA退火，延伸，再与 5端连接环化，并酶切除线
状 DNA分子;最后用一对常用引物对所有的环状锁
型探针进行 PCR扩增，鸟枪法测序。
此方法有两个主要困难［51］:亚硫酸盐处理
DNA使所有未甲基化的胞嘧啶转换成了尿嘧啶，使
序列复杂性显著减少，因此从亚硫酸盐处理的 DNA
中获得特异性的序列比天然 DNA困难;此方法获取
灵敏度低、偏差高及等位基因随机缺失。因此，用目
前存在的方法获得精确高效的 DNA 甲基化分析是
不可能的。尤其是无法解决等位基因的缺失问题。
此外合成探针数量较多，工作量较大，价格昂贵。
1． 2． 7 结合新一代测序技术的高通量单碱基解析
新一代测序技术的出现，使全基因组测序单碱基
分析成为可能。可以通过高通量测序对比检测基因
组 DNA甲基化程度及位点［52］。此方法的优势在于
能够对全基因组甲基化进行精确分析。最近，重亚
硫酸盐结合新一代测序技术完成了拟南芥约 120
Mb 基因组 DNA甲基化图谱分析［53］。
1． 3 甲基化 DNA 免疫共沉淀(methyl-DNA immu-
noprecipitation，MeDIP)
MeDIP方法是用 5-甲基胞嘧啶特异性抗体或者
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用含有甲基结合结构域的蛋白通过免疫沉淀富集基
因组甲基化或未甲基化片段［23，54］，其基本程序是:
(1)提取全基因组 DNA，经超声波打断成长度为
400 － 500 bp 的片段; (2)加热变性，将变性的单链
DNA样品平均分为两份; (3)其中一份加入甲基化
DNA特异性抗体，另一份作为 Total input DNA 样
品;(4)使用亲和层析分离上一步样品中的甲基化
DNA片段的抗体复合物，样品中其余的非甲基化
DNA片段被洗脱，纯化得到甲基化 DNA 片段(MeD-
IP DNA)。得到纯化的甲基化 DNA 片段后可以结
合荧光定量 PCR 技术定量检测 DNA 甲基化，也可
结合芯片技术检测基因甲基化。
1． 3． 1 MeDIP 结合实时荧光定量 PCR 技术(Me-
DIP-qPCR) 实时荧光定量 PCR 技术是在 PCR 反
应体系中加入荧光试剂，利用荧光信号实时检测
PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量
分析的方法。实时荧光定量 PCR 能够专一，灵敏，
快速，高重复地精确定量起始模板的浓度。
实时定量 PCR技术与 MeDIP技术结合，先通过
MeDIP技术富集甲基化的 DNA片段，再利用实时荧
光 PCR技术进行检测，经过数据分析处理得到检测
的生物样品中特定位点的甲基化水平的精确数值。
此方法的特点是:高特异性;不需要标记探针;
精确度高，重复性好;灵敏度高。
1． 3． 2 MeDIP 结合芯片技术(MeDIP-chip) 甲基
化免疫共沉淀结合芯片技术基本程序是［29］:用 Me-
DIP的方法富集甲基化的 DNA 片段，与全基因组对
照分别标记后(MeDIP － Cy3，Input － Cy5)混合与设
计的芯片杂交，用高解析度芯片扫描仪检测杂交信
号;对杂交结果进行数据提取、标准化、峰值分析和
报告。
但到目前为止不能通过 MeDIP 方法准确估计
甲基化水平，而且低 CpG密度区域甲基化分析存在
问题。
1． 4 单分子实时测序法直接检测 DNA甲基化(sin-
gle-molecular、real-time sequencing，SMRT)
SMRT是最新开发的方法，由 Flusberg 等［55］提
出，本方法不需要亚硫酸盐处理，而利用 DNA 聚合
酶进行边合成边收集荧光信号的方法进行测序。其
原理是:DNA聚合酶催化荧光标记的核苷酸结合到
核苷酸链上，当核苷酸掺入时，通过荧光脉冲到达和
持续的时间检测可以获得聚合酶动力学信息，从而
可以直接测定 DNA模板上的核苷酸修饰，包括:N6-
甲基腺嘌呤，5-甲基胞嘧啶，5-羟甲基化胞嘧啶。
Pacific Biosciences公司发明了一种直径只有几
十纳米的纳米孔(zero-mode waveguides，ZMWs) ，单
分子的 DNA聚合酶被固定在这个孔内。聚合酶链
式反应开始时由于荧光标记的 A、T、C 和 G 较快速
地从外面进入到孔内又出去，它们形成了较稳定的
背景荧光信号。当这些荧光标记的脱氧核苷酸被掺
入 DNA链的时候，它的荧光就同时能在 DNA 链上
探测到。当它与 DNA链形成化学键的时候，它的荧
光基团就被 DNA聚合酶切除，荧光消失。这种荧光
标记的脱氧核苷酸不会影响 DNA聚合酶的活性，并
且在荧光被切除之后，合成的 DNA 链和天然的
DNA链完全一样。
该技术还需进行优化，第一个是把双链 DNA环
化反复测序，DNA 聚合酶能够以环化的 DNA 作为
模板滚环复制，反复测一段 DNA序列。这种反复测
序，纠正了偶尔出现的复制错误，从而使测序精度非
常高，准确率达 99． 99%。第二个是激发光中断测
序法:DNA聚合酶虽然很稳定，但是在强大的激发
光作用下酶也是有一定寿命的。如果把激发光中断
一段时间，在这段时间内 DNA 聚合酶继续复制
DNA，当激发光重新开启以后，就可以测到长 DNA
链后面的序列。
1． 5 依赖于单分子纳米孔技术的测序(single-mole-
cule nanopore DNA sequencing)
该方法由英国 Oxford Nanopore Technologies 的
科学家在 2010 年初提出［56］，单分子纳米孔测序仪
能直接分辨出未修饰的胞嘧啶和甲基化胞嘧啶。其
原理是当核酸外切酶消化单链 DNA后，单个碱基落
入孔中，它们瞬间与环式糊精相互作用，并阻碍了穿
过孔中的电流。每个碱基 A、T、G、C 以及甲基胞嘧
啶都有自己特有的电流振幅，每个碱基也有特有的
平均停留时间，它的解离速率常数是电压依赖的，
+ 180 mV的电位能确保碱基从孔的另一侧离开，因
此很容易转化成 DNA序列。
以往对甲基胞嘧啶进行测序，都要先进行重亚
硫酸盐转化，纳米孔技术就能直接读出这第 5 种碱
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基。目前，纳米孔测序仅限于短的寡核苷酸。此外，
Oxford Nanopore的测序仪仍面临两个重要的技术问
题:一是如何将核酸外切酶更好地附着在孔上，让它
每次以正确的序列顺序只进入一个碱基，然后从另
一侧离开，这是一个大挑战;另一个是并行化，这个
问题可能简单一些，可以开发出一个芯片，上面有数
万个孔，来确保整个测序过程更快速。不过，一旦成
功，第 5 种碱基 5mC 的直接测序将会产生重大
影响。
2 组蛋白修饰研究技术
组蛋白修饰较多，包括甲基化、乙酰化、磷酸化、
泛素化、SUMO化和 ADP 核糖基化等。但目前组蛋
白修饰研究方法较少，目前最常用的为染色质免疫
共沉淀技术。
染色质免疫沉淀技术(chromatin Immunoprecipi-
tation，ChIP)由 ONeill 和 Turner［57］提出，是研究体
内蛋白质与 DNA 相互作用的一种技术。它的基本
原理是在活细胞状态下固定蛋白质———DNA 复合
物，然后通过超声或酶处理将染色质切断为一定长
度范围内的染色质小片段，然后通过免疫学方法沉
淀此复合体，特异性地富集与目的蛋白结合的 DNA
片段，通过对目的片段的纯化与检测，从而获得蛋白
质与 DNA相互作用的信息。染色质免疫沉淀技术
一般包括细胞固定，染色质断裂，染色质免疫沉淀，
交联反应的逆转，DNA的纯化，以及 DNA的鉴定。
ChIP不仅可以检测体内反式因子与 DNA 的动
态作用，还可以用来研究组蛋白的各种共价修饰与
基因表达的关系。而且，ChIP 与其他方法的结合，
扩大了其应用范围:ChIP与基因芯片相结合建立的
CHIP-chip方法已广泛用于特定反式因子靶基因的
高通量筛选［58，59］;ChIP 与体内足迹法相结合，用于
寻找反式因子的体内结合位点［60，61］;RNA-ChIP 用
于研究 RNA在基因表达调控中的作用［62，63］。染色
质免疫共沉淀结合芯片技术(CHIP-chip)和染色质
免疫共沉淀结合新一代短序列测序技术(ChIP-seq)
是目前检测组蛋白修饰最常用的方法。
2． 1 染色质免疫共沉淀结合芯片技术(ChIP-chip)
ChIP-chip是将 ChIP 与生物芯片相结合，在全
基因组或基因组较大区域上高通量分析 DNA 结合
位点或组蛋白修饰的方法［64］。该技术获得的信息
量主要取决于芯片的探针的密度、分辨率与覆盖度。
探针密度指生物芯片表面所固定的 DNA 探针的数
量。分辨率指设计生物芯片时两个相邻探针的
DNA序列在基因组上相隔的距离，分辨率越高，相
邻探针之间的距离越短。覆盖度指固定在生物芯片
上 DNA序列占基因组全序列的比例。
该技术的基本程序是:先通过染色质免疫共沉
淀技术(ChIP)富集组蛋白被修饰的 DNA 片段，然
后加上通用接头进行 PCR扩增，在扩增过程中引入
荧光基团。由于富集的片段长短不同，所以扩增效
率不同，通过控制循环数来减少偏好性。最后将扩
增的片段与设计的芯片杂交。
杂交可通过两种方法，一种是单杂交法:对照组
(未经免疫沉淀富集的基因组 DNA)与试验组分别
与芯片杂交，然后对比;另一种是双色竞争法:用另
一种颜色的荧光标记对照组，对照组和试验组同时
与设计的芯片竞争性杂交，通过两种信号强弱对比
得出该位点的修饰程度。
2． 2 染色质免疫共沉淀结合短序列测序技术
(ChIP-seq)
ChIP-seq是将 ChIP与测序技术相结合，在全基
因组范围内检测 DNA组蛋白修饰的高通量方法，可
以应用到任何基因组序列的物种，并能确切得到每
一个片段的序列信息［64］。
该技术的基本程序是:通过 ChIP 富集目的片
段，纯化后加上通用接头进行 PCR扩增，最后加 sol-
exa接头进行测序。目前该技术比较成熟，通量也
在不断提高，成本随着新一代测序技术的出现和发
展逐步降低，ChIP 和测序技术的结合越来越广泛
的应用到 DNA与互作蛋白分析。
该技术的主要困难在于测序完成后对海量数据
的分析。并且各个环节的差别，如 DNA 质量、获取
的片段长短不同导致的扩增效率差异、基因组的重
复程度以及测序和序列比对过程中的错误都会引入
系统误差造成假阳性［65］。
2． 3 组蛋白泛素化和 SUMO化修饰研究
组蛋白泛素化和 SUMO 化研究中，至今没有针
对这种组蛋白修饰的特异性抗体，虽然有报道 H2B
泛素化多克隆抗体，但没有商用［66］。Beger 实验室
尝试用分支肽开发 H2B-SUMO 抗体也未获得成
86
2011 年第 9 期 郑小国等:表观遗传学研究方法进展
功［20］，而且两种修饰在原生质细胞萃取物中不稳定
且易被降解。所以必须开发独特的方法用于组蛋白
泛素化和 SUMO 化分析，目前已有利用组蛋白、泛
素上含有抗原决定簇标签的独特酵母菌株研究组蛋
白泛素化和 SUMO化的报道［12］。
3 讨论
表观遗传调控是生物生长发育重要的调控机
制，其中 DNA甲基化和组蛋白修饰是表观遗传学研
究的重要内容。目前 DNA甲基化检测方法较多，主
要分为 3 类［21，22，25］:依赖于限制性内切酶的检测技
术;依赖亚硫酸盐转换的检测技术;结合免疫方法的
检测技术。在这 3 类技术中依赖于限制性内切酶的
方法比较简便易行，且不需知道被测 DNA 的序列信
息，在不同生物上具有通用性，可用于 DNA 序列背
景知识未知的生物全基因组范围检测 CCGG位点的
胞嘧啶甲基化变化，但局限性较大，只能检测部分
DNA甲基化，如 CpG 位点或者 CpG 岛的甲基化。
依赖亚硫酸盐转换的检测技术被视为检测 DNA 甲
基化的金标准，亚硫酸盐处理后未甲基化 C 转换为
U，甲基化胞嘧啶保持不变，经扩增后未甲基化 C 变
为 T，甲基化 C保持不变，通过测序对比即可即可定
性定量检测 DNA甲基化［22］。以亚硫酸盐转换为基
础开发的方法较多，各有优缺点。优点是此方法检
测比较准确，很容易确定个体基因组 DNA分子中各
个单链的甲基化状态及甲基化位置，结合不同技术
可灵活检测全基因组或特殊序列位点甲基化状态。
缺点是亚硫酸盐转换后序列特异性降低，不易设计
特异性引物，获取特异性序列比未处理的 DNA 困
难;在结合某些方法时容易出现假阳性，如 COBRA
方法［33，34］;且全基因组检测价格比较昂贵。结合免
疫方法的技术能准确检测全基因组任何位点 DNA
甲基化，不受序列限制，也不会像亚硫酸盐转换方法
降低序列的特异性，可以进行高通量检测，不需要标
记探针，精确度高，灵敏度高。此方法结合芯片或高
通量测序是目前最常用的 DNA 甲基化检测方法。
缺点是步骤较多，易出错。目前市场有较多试剂盒
可用，大大减少了步骤出错率。此方法结合芯片技
术目前尚不能准确估计甲基化水平，低 CpG 密度区
域甲基化分析也存在问题［29］。
这 3 类检测方法可以相互结合或者与芯片、高
通量测序等其他技术结合灵活检测样品 DNA 甲基
化。如限制性内切酶结合高通量测序技术、限制性
内切酶结合芯片技术、亚硫酸盐转换结合高通量测
序技术、亚硫酸盐转换结合芯片技术、亚硫酸盐转换
结合限制性内切酶技术、免疫沉淀结合高通量测序
技术、免疫沉淀结合芯片技术和免疫沉淀结合荧光
定量技术等。
除了这 3 类较成熟的技术以外，最近开发的两
种新型测序技术也可用于 DNA 甲基化检测。一个
是单分子、实时测序技术(SMRT)［55］，根据合成
DNA链时聚合酶停留的时间检测 DNA 是否甲基
化，目前仪器已经问世;另一个是单分子纳米孔测序
技术［56］，根据各种碱基通过单分子纳米孔时都有自
己独特的电位变化进行 DNA 测，当 5mC 通过纳米
孔引起的电位跟其他 4 种碱基不同，可以精确检测
DNA链上甲基化位点。这两类技术的发展大大缩
短了测序时间，减少了测序成本。
组蛋白修饰研究方法相对较少，而且研究重点
主要集中在组蛋白甲基化和乙酰化上。目前主要用
染色质免疫共沉淀结合芯片的方法(ChIP-chip)和
结合短序列测序技术(ChIP-seq)［64］。ChIP-chip 方
法获得的信息量主要取决于芯片的探针密度、分辨
率与覆盖度。ChIP-seq 技术比较成熟，可以应用到
任何基因组序列的物种，并能确切得到每一个片段
的序列信息，但是数据量较大，且易出现假阳性。
组蛋白泛素化和 SUMO 化研究中，至今没有它
们的特异性抗体，且这两种修饰对原生质萃取物中
的蛋白质水解酶敏感，所以必须开发独特的方法用
于组蛋白泛素化和 SUMO化分析［12］。
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(责任编辑 狄艳红)
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