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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2011 年第 4 期
澳洲宝石鲈线粒体 DNA COI基因的克隆与序列分析
张龙岗 郭金峰 孟庆磊 安丽 董学飒 付佩胜
(山东省淡水水产研究所 山东省淡水水产遗传育种重点实验室，济南 250117)
收稿日期:2010-09-20
基金项目:山东省农业良种工程项目
作者简介:张龙岗，男，硕士，研究实习员，研究方向:水产动物遗传育种和分子生物学;E-mail:zlg-0302@ 163． com
通讯作者:付佩胜，研究员，E-mail:jnsfu@ 126． com
摘 要: 对澳洲宝石鲈线粒体 DNA细胞色素氧化酶 I亚基(cytochrome oxidase subunit I，COI)基因进行了扩增、克隆和
测序，并对 COI序列进行了分析。结果显示，澳洲宝石鲈 COI基因序列长度为 631 bp，其中 A、T、G 和 C 4 种碱基的含量分别
为 27. 7%，23. 6%，29. 8%和 18. 9%。与从 GenBank中查到的其他 4 种鯻科鱼类的同源序列比对，邻接法(neighbor-joining)构
建系统进化树。结果显示，5 种鯻科鱼类聚在一起，分为两个大的支系，其中花身鯻与条纹鯻首先聚成一支，然后与詹氏弱棘
鯻和银锯眶鯻聚成的一支共同组成一个支系;而高体革鯻单独聚为一个支系，所得的聚类结果与传统的分类结果基本一致。
关键词: 宝石鲈 COI 克隆 序列分析
Cloning and Sequencing Analysis of COI Gene from Scortum barcoo
Zhang Longgang Guo Jinfeng Meng Qinglei An Li Dong Xuesa Fu Peisheng
(Fresh Water Fisheries Research Institute of Shandong Province，Shandong Provincial Key
Lab for Genetics ＆ Breeding of Freshwater Fisheries，Jinan 250117)
Abstract: Mitochondrial COI gene fragment of Scortum barcoo was amplified via PCR，then the PCR products were purified，
cloned and sequenced． For the COI gene fragment，631 bp nucleotide sequences were obtained，and the A，T，G and C contents were
27. 7%，23. 6%，29. 8% and 18. 9% ． Found four species of Teraponidae from the GenBank and alignmented the sequences，clustering a-
nalysis could build phylogenetic tree with neighbor-joining of the five species． It was revealed that the five species clustered together and
divided into two big sublines，including Terapon jarbua and Terapon theraps assembled a branch，and then assembled another branch of
Hephaestus jenkinsi and Bidyanus bidyanus;Scortum barcoo was a separate one． This result was accorded with the traditional morphology
classification．
Key words: Scortum barcoo COI Clone Sequence analysis
宝石鲈，学名高体革鯻(Scortum barcoo) ，又称
宝石鱼或宝石斑鱼，分类上属于鲈形目、鯻科、革鯻
属。宝石鲈原产于澳大利亚的淡水水域，是澳大利
亚最负盛名的淡水鱼。该鱼肉质细腻，刺极少，鲜美
爽口，是首选的健康美味食品，深受消费者青睐［1］。
2001 年，在青岛举办的“中国国际渔业博览会”上，
由中国水产流通与加工协会促成，青岛晨华种苗有
限公司从澳大利亚引进了第一批鱼种。自宝石鲈引
进我国之后，有关宝石鲈的生物学特性、繁育及养殖
技术、营养和疾病等方面已有不少相关研究［2 － 5］，但
有关其线粒体 DNA方面的研究尚乏人问津。
线粒体 DNA(mitochondrial DNA，简称 mtDNA)
结构简单，呈母性遗传，进化速度快且不发生重组，
是一种应用较广的分子标记。细胞色素氧化酶 I 亚
基(cytochrome oxidase subunit I，COI)基因具有进化
速率适中的特点，可作为种属系统进化以及群体遗
传结构研究的良好标记［6 － 8］。本研究对山东省淡
水水产研究所引进的澳洲宝石鲈 mtDNA COI 基因
序列片段进行扩增和测序，分析线粒体细胞色素氧
化酶 I亚基(COI)基因片段序列特征，并结合 Gen-
Bank中报道的其他 4 种鯻科鱼类 COI 基因的同源
序列进行了比较，以期为高体革鯻的种质资源研究、
2011 年第 4 期 张龙岗等:澳洲宝石鲈线粒体 DNA COI基因的克隆与序列分析
人工养殖和品种培育提供遗传背景资料，并为鯻科
鱼类分类和系统进化提供分子水平的理论依据。
1 材料与方法
1. 1 材料
宝石鲈样本为山东省淡水水产研究所于 2002
年从澳大利亚引进并繁育的后代，取自山东省淡水
水产研究所养殖基地。活体解剖之后取背部肌肉与
－ 70℃冰箱中保存备用。
1. 2 方法
1. 2. 1 总 DNA的提取和检测 取新鲜或冷冻样品
约 100 mg，低温下研磨为糊状，CTAB 法［9］稍加改
进，提取总 DNA。用灭菌双蒸水溶解，1%琼脂糖电
泳检测。纯度较好的 DNA 模板保存在 － 20℃冰箱
用于 PCR扩增。
1. 2. 2 PCR扩增 参照已报道的鯻科鱼类 COI 基
因序列进行同源检索排序，设计 1 对引物。COI 上
游引物 COIF:5-AGTATAAGCGTCTGGGTAGTC-3
(21 bp) ;COI 下游引物 COIR:5-CCTGCAGGAG-
GAGGAGAYCC-3 (20 bp)。用 TaKaRa 公司的
TP650 PCR扩增仪，在 50 μL 反应体系内进行 DNA
扩增。其内含有 4 μL(30 － 50 ng)DNA 模板，0. 5
μmol /L 每种引物，0. 5 mmol /L 4 种 dNTPs，1 单位
Taq酶(TaKaRa 公司) ，2 mmol /L MgCl2以及 5 μL
10 ×缓冲液，由超纯水补足 50 μL。反应程序:94℃
预变性 2 min，94℃变性 1 min，51℃退火 1 min，72℃
延伸 1 min，35 个循环，72℃延伸 5 min。扩增产物
用 1. 5%琼脂糖凝胶电泳法检测，Marker 为宝生物
工程(大连)有限公司的 DL2000，凝胶成相系统观
察、照相。
1. 2. 3 PCR产物纯化与克隆 PCR 产物电泳割胶
回收，经 BBI公司的 EZ-10 Spin Column PCR Product
Purification Kit 纯化，与 pMD18-T 载体(大连宝生
物)连接。连接体系总体积为 20 μL，其中 pMD18-T
载体 1 μL，PCR纯化产物 10 μL，Ligation solution I 9
μL，16℃ 过夜连接。连接液转化到感受态细胞
DH5α中，筛选阳性克隆，液体 LB培养基扩大培养，
经 PCR检测合格后送上海生工测序。
1. 2. 4 测序和统计分析 测序仪为 ABI 3730 基因
分析仪，采用双向测序并对测序结果进行人工校对。
测得序列通过 Clustal X(Version1. 83)软件［10］进行
多序列比对和分析，生成的 Clustal 格式比对文件采
用 MEGA3. 1 软件［11］分析序列的碱基组成。从
GenBank中搜索到鯻科其他 4 种鱼类:花身鯻(Tera-
pon jarbua)、条纹鯻(Terapon theraps)、詹氏弱棘鯻
(Hephaestus jenkinsi)和银锯眶鯻(Bidyanus bidya-
nus)的 16S rRNA 基因片段序列，采用双参数
(Kimura 2-parameter)作为距离参数，邻接法(neigh-
bor-joining，NJ)构建系统进化树。系统树中各结点
的置信度由自引导值(Bootstrap value)估计，重复次
数为 1 000。
2 结果
2. 1 宝石鲈基因组 DNA提取结果
本试验采用 CTAB 法提取的宝石鲈基因组
DNA经紫外分光光度计测定，显示 OD260 /OD280的值
均在 1. 8 － 2. 0 之间，凝胶电泳结果(图 1)显示，基
因组 DNA主带清晰，没有 RNA等污染，没有明显的
拖尾降解现象，表明提取的宝石鲈基因组 DNA纯度
高，蛋白质和 RNA含量少。
图 1 澳洲宝石鲈基因组 DNA提取结果
2. 2 澳洲宝石鲈 COI基因片段的扩增
COI基因片段经特异性引物 PCR 扩增，获得 3
个个体清晰的基因片段。PCR 扩增产物回收结果
(图 2)显示该片段长度约为 700 bp。PCR扩增产物
经过回收纯化、测序、序列比对拼接，删除引物序列
后，得到澳洲宝石鲈 COI基因片段为 631 bp，3 个样
本碱基序列一致。具体核苷酸序列见图 3。
图 2 澳洲宝石鲈线粒体 DNA COI
基因扩增结果
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图 3 澳洲宝石鲈 COI基因部分片段的核苷酸序列
2. 3 澳洲宝石鲈 COI基因片段序列特征
COI基因测序所得到的目的序列用 MEGA
version 3. 1 软件计算其碱基组成，结果见表 1。在
所得到的 COI 基因片段序列中 T、C、A 和 G 碱基
含量中显示，各碱基含量较为平均，序列的碱基组
成为 T(23. 6%)、C(18. 9%)、A(27. 7%)和 G
(28. 9%) ，A + T的含量(51. 3%)显著高于 G + C
含量(48. 7%) ，这一模式与其他鱼类的 COI 基因
相似。
表 1 宝石鲈 COI基因片段序列碱基组成
基因片段
碱基组成(%)
T C A G A + T
COI 23. 6 18. 9 27. 7 29. 8 51. 3
2. 4 系统进化树的构建
为了比较本试验中所研究的澳洲宝石鲈和已报
道的鯻科其他鱼类线粒体 DNA COI 基因的序列差
异，从 GenBank中查找了 4 种其他鯻科鱼类的序列
进行比对，其他 4 种鯻科鱼类的资料见表 2。
表 2 本研究中所用鯻科其他鱼类 COI基因序列的长度及其登录号
物种名称 分类阶元 DNA长度(bp) GenBank登录号
条纹鯻(Terapon theraps) 鯻属 652 EF607581
花身鯻(Terapon jarbua) 鯻属 652 EF607580
詹氏弱棘鯻(Hephaestus jenkinsi) 弱棘鯻属 655 EF609374
银锯眶鯻(Bidyanus bidyanus) 锯眶鯻属 655 EF609298
采用 NJ法构建了鯻科 5 个种的系统树，并对各
分支均进行 1 000 次的重复检验。从系统进化树
(图 4)可知，5 种鯻科鱼类聚在一起，分为两个大的
支系，其中花身鯻与条纹鯻首先聚成一支，然后与詹
氏弱棘鯻和银锯眶鯻聚成的一支共同组成一个支
系;而高体革鯻单独聚为一个支系，所得的聚类结果
与传统的分类结果基本一致。
图 4 NJ法构建的 5 种鯻科鱼类的
系统进化树
3 讨论
动物线粒体 DNA是一种共价闭合、环状的双链
DNA分子，其具有分子结构简单、严格的母系遗传、
进化速度快、不同的区域进化速度存在差异等特征，
适合不同水平的研究，使其成为分子群体遗传学和
分子系统学研究的重要标记［12］。线粒体 DNA 的
COI基因是线粒体基因组中研究较多的基因，其进
化速度快，故不仅适于种群水平差异的检测，也可用
于种间分析，该基因近年来在水产动物种群遗传结
构和系统进化方面有较多的研究［13 － 17］。
本研究对澳洲宝石鲈线粒体 DNA COI 基因部
分片段序列进行了 PCR特异性扩增，得到 631 bp的
碱基序列，其中 A、T、G和 C 4 种碱基的含量分别为
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2011 年第 4 期 张龙岗等:澳洲宝石鲈线粒体 DNA COI基因的克隆与序列分析
27. 7%，23. 6%，29. 8% 和 18. 9%。通过对宝石鲈
COI基因片段遗传特征的研究，发现其在种内的变
异比较低，所测 3 个样本碱基序列相一致。同时，与
从 GenBank中查到的其他 4 种鯻科鱼类的同源序列
比对并采用邻接法(neighbor-joining)构建系统进化
树，结果显示，5 种鯻科鱼类聚在一起，分为两个大
的支系，其中花身鯻与条纹鯻首先聚成一支，然后与
詹氏弱棘鯻和银锯眶鯻聚成的一支共同组成一个支
系;而高体革鯻单独聚为一个支系，所得的聚类结果
与传统的分类结果基本一致。
澳洲宝石鲈具有对环境适应性强、食性广、生长
速度快和抗逆性强等特点，因此具有广阔的养殖前
景。本试验的研究结果为进一步研究宝石鲈的遗传
变异、种群结构和系统进化打下了基础，但是要想进
一步了解其更多的遗传背景还需借助其他的分子生
物学方面的手段和资料，如采用基因克隆测序的方
法研究宝石鲈线粒体其他基因;采用 AFLP、SSR 等
新兴分子标记技术研究核基因组 DNA等。
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(责任编辑 李楠)
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