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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2011 年第 3 期
植物转基因育种的分析与研究
赵彦平 赵春海
(首都师范大学生命科学学院，北京 100048)
摘 要: 自 1983 年培育出第一株转基因植物———转基因烟草以来，转基因育种研究已取得飞速发展。应用转基因技术
培育了一批抗除草剂、抗虫、抗病、抗逆和优质的转基因材料，有些已实现产业化。就近年来转基因研究在转化技术体系、转
化效率和筛选鉴定方面作一概述，就热点问题，如如何培育安全型无选择标记转基因植物和提高外源基因稳定性、表达量等
进行分析，并就有关问题提出建议。
关键词: 转基因育种 基因工程 外源基因整合 筛选标记
Research and Analysis of Transgenic Breeding in Plants
Zhao Yanping Zhao Chunhai
(College of Life Sciences，Capital Normal University，Beijing 100048)
Abstract: Research of transgenic plants has made quick development since the first transgenic plant—tobacco was obtained in
1983． A large number of transgenic materials with herbicide tolerance，insect resistance，disease resistance，stress tolerance and good
quality have been cultivated． The production of some transgenic plants has realized commercialization． This paper described advances on
transgenic plants in recent years for transformation system，transformation efficiency，selection，identification． About concerned issues，in-
cluding:cultivate maker-free transgenic plants and exogenous gene expression and stability were analyzed，and suggestions on relevant
issues were proposed．
Key words: Transgenic breeding Genetic engineering Transgene integration Selection markers
收稿日期:2010-11-24
作者简介:赵彦平，女，硕士研究生，研究方向:转基因植物;E-mail:whatzyp@ yahoo． cn
20 世纪 80 年代开始，科学家试图利用基因工
程技术，将外源基因或经体外修饰后的内源基因导
入植物，改良植物的性状，至今已取得了传统常规育
种技术难以达到的效果和效益。近年来，转基因技
术成为农业生物技术的核心领域，并在世界各地蓬
勃发展起来。
1 转基因技术育种概况
当前，在转基因育种的研究方面，如抗虫性育
种、抗病性育种、抗除草剂育种、高品质育种、远缘杂
交育种、转基因植物生物反应器、转基因植物疫苗和
不育系基因工程都取得了显著成果。我国已经建成
先进的基因转化平台，克隆了一批具有自主知识产
权的功能基因，培育出一批性状优异的转基因材料，
有些具备了工厂化生产的能力，从而形成了从基因
克隆、规模化转化、安全评价、品种培育直至商业化
开发的完善研发体系［1］。但仍存在一些制约因素，
首先生物技术研究费用昂贵，主要是表达量低，转化
体系还不是特别稳定，基因型限制仍然是一个难题。
第二个限制因素是缺少有用的基因。随着分子遗传
学研究的发展，现在育种专家已能够鉴定有用的基
因，并进行定位和分离。第三个限制因素是所谓的
基因沉默现象，即新插入的基因常常是关闭的。当
然随着转基因理论体系和技术体系的不断发展完
善，更多的优良受体材料被应用，更多的优良基因被
发掘，各种基因转化手段也会更加优化，转化效率，
表达量也会随之得到有效提高。总之，随着转基因
植物商品化脚步的加快，转基因作物的持续推广，无
论是对于农民、消费者还是社会，都会带来实实在在
的和持续的效益，并在减轻贫困和饥饿方面作出突
出贡献。
2011 年第 3 期 赵彦平等:植物转基因育种的分析与研究
2 常用的转基因育种技术
应用转基因技术将目的基因导入合适受体并获
得稳定的转基因植株是转基因的重要环节。基因导
入方法主要有:无需载体的 DNA 直接导入的转化，
根癌农杆菌介导转化和生殖系统的遗传转化［2］。
2. 1 DNA直接转入技术
不需依赖生物媒体，将特殊处理的裸露 DNA直
接导入植物细胞，实现基因的转化。
2. 1. 1 基因枪介导法 基因枪法的基本原理是把
外源 DNA包在金粒或钨粒里面，在高压作用下直接
射入受体细胞或组织，外源基因进入细胞整合到染
色体上，实现基因的转化。该法于 1987 年由美国康
乃尔大学 Sansord 等发明，并很快用于玉米基因转
化研究。基因枪法无宿主限制，靶体类型广泛，操作
简便，但其转化频率低，插入位点和拷贝数不稳定。
目前国内外已成功地用基因枪法把 hpt基因、bar 基
因、unidA基因、荧光素酶基因和 Bt 毒蛋白基因等
转入玉米中，得到可育的转基因植株。
2. 1. 2 PEG 法 PEG 是细胞融合剂，能促进细胞
膜间融合，利于外源 DNA进入原生质体。这种方法
成本低，结果比较稳定，存在的问题是建立可靠高效
的原生质体再生系统比较困难。
2. 1. 3 电激法 电激法是利用高压电脉冲对细胞
“电激穿孔”，形成可逆的瞬间通道，促进外源 DNA
的摄取。电激法可以用于原生质体，还可以用于胚
性悬浮细胞系、愈伤组织和幼胚等，操作比较简单，
但转化效率低，插入位点和拷贝数不稳定。
2. 1. 4 超声波介导法 利用低声强脉冲超声波的
物理作用，击穿细胞膜造成通道，使外源 DNA 进入
细胞。超声波介导法转化效率较高，但操作繁琐，载
体 DNA在处理时易断裂。
2. 2 载体转化技术
载体转化系统指将目的基因插入农杆菌质粒或
病毒 DNA上，即转移的 DNA不是裸露的，而是插在
载体上，随载体 DNA的转移而转移。
农杆菌介导法是人们经常采用的一种手段。农
杆菌在双子叶植物上的遗传转化方法已经十分完
善，由于单子叶植物不是农杆菌的天然宿主，在单子
叶植物上的遗传转化研究落后于双子叶植物。
Grimsly等首次以玉米为材料，用农杆菌将玉米条纹
病毒(MSV)的 cDNA 导入玉米植株中，使其表现了
系统感染症状，这是转基因育种的一个重要转折点，
有力地证明了农杆菌能侵染单子叶植物［3］。农杆
菌介导法具有简单易行，不需昂贵的设备，成本低，
转化频率高，能转移较大的 DNA 片段、整合的外源
基因重排少且多以单或寡拷贝整合等优点，使许多
研究者仍热衷于不断完善这一转化体系。尤其近几
年在单子叶植物特别是禾谷类作物上的突破性进
展，表明农杆菌是较具潜力的一种转化方法。
2. 3 种质转化技术
种质转化技术指外源 DNA 借助生物自身的种
质系统或细胞结构功能实现的转化，进展比较大的
是花粉管通道法和子房注射法。
2. 3. 1 花粉管通道法 基本原理是授粉后外源
DNA沿着花粉管渗入，经过珠心通道进入胚囊，转
化为尚不具备正常细胞壁的细胞、合子或早期胚胎
细胞。
2. 3. 2 子房注射法 子房注射法指使用微玻针把
外源 DNA 注入子房，由于子房或胚囊产生高的压力
以及卵细胞的吸收，使外源 DNA进入受精的卵细胞
中，实现基因的转化。
种质转化以子房和花粉为受体，避开了组织培
养过程，利用植物本身的有性繁殖过程进行繁殖，避
免了转化体早期夭亡、不孕和不育等，比较容易得到
种子，但转化后代群体大，需要有简便可靠的筛选
方法。
3 转化频率
转化频率是转化技术体系是否成功和成熟程度
的重要标志。特别是转基因到了产业化阶段，规模
化转基因要求转化技术的转化率、成功率要有大的
提高，有大量的转化体才能够提供足量的材料用以
转基因育种选择。因此，不断提高转化技术的转化
率是改善、创新转基因技术的工作目标。
4 转基因筛选与检测
转基因育种就是将目的基因整合到受体细胞，
并在后代中稳定地遗传和表达，通过选择鉴定，得到
目的植株。也就是说，所有的转基因植株不一定都
是目的植株，还需要多种程序的进一步鉴定，才能确
定它的价值。
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4. 1 筛选
对转基因植物的筛选可利用标记基因或目的基
因赋予的性状，具体筛选方法依导入的外源基因和
转化方法而不同。近年来一种新的安全选择系
统———磷酸甘露糖异构酶(PMI)法建立起来。与传
统筛选体系不同，它以甘露糖为筛选剂对转化细胞
进行正筛选，目前已应用于多种模式植物和经济作
物的转基因筛选［4］。对于大规模生产来说，必须建
立一个准确、快捷、省时、省力又省资金的筛选方法。
4. 2 检测
从分子水平鉴别出阳性转化体，明确目的基因
在转基因植株中的拷贝数和转录与表达情况，需要
结合分子生物学技术检测而达到育种目的。
4. 2. 1 外源基因整合的检测 整合到植物基因组
中的外源基因多以单拷贝形式存在，也有的是多拷
贝。多拷贝的转基因对植物不利，是产生基因沉默
现象的主要原因［5］。
4. 2. 1. 1 PCR法 常规 PCR 法引物设计不合理，
靶序列或扩增产物的交叉污染，外源 DNA插入后的
重排、变异等因素都会造成检测的误差而出现假阳
性，通常常规 PCR的检测结果仅作为转基因植物初
选的依据，有必要对 PCR 技术进行优化。现已发展
有:多重 PCR(multiplex PCR，MPCR)、降落 PCR
(touchdown PCR，TD-PCR)、rpPCR、反向 PCR(in-
verse PCR，IPCR)和实时荧光定量 PCR(real-time
quantitative PCR)等［6］。
4. 2. 1. 2 Southern 杂交 利用 Southern 杂交，不仅
能够检测外源 DNA，而且能够确定外源基因在植物
基因组中的排列情况、拷贝数及转基因植株后代外
源基因的稳定性［7］。其不受操作过程中的 DNA 污
染影响和清除转化中的质粒残留所引起的假阳性信
号，准确度高，特异性强，是研究转基因植株外源基
因整合最可靠的方法。已广泛应用于水稻［8，9］、小
麦［10］、玉米［11，12］、大豆［13］、油菜［14］、白菜［15］、甘
蓝［16］和桃［17］等各类作物转基因植株的检测。
4. 2. 2 外源基因表达的检测 转基因的成功与否在
很大程度上取决于导入基因的表达水平。外源基因
与受体基因组的同源性、基因的插入位点等多种因素
均会影响基因的表达效率［18］。Northern 杂交是检测
基因在 RNA 水平表达的权威方法。Western 杂交可
定性检测出目的基因是否表达出蛋白质。ELISA 是
一种利用免疫学原理检测抗原、抗体的技术。此检测
外源基因表达蛋白的灵敏度高于 0. 1%，并且具有可
定量分析、快速特异、操作简单和经济实惠的优点，特
别适合于大批量检测。
此外，生物芯片技术［19］、原位杂交技术［19］、质
谱分析［20］、色谱分析［20］、生物传感器［21，22］、近红外
光谱［23］和微纤维装置(microfabricated device)［20］
等，在转基因植物检测中都有应用。
5 标记基因及其剔除
5. 1 标记基因
植物细胞经外源 DNA 导入后，需要进行转化
细胞和非转化细胞的选择。标记基因产物给予植
物细胞一种选择压力，致使未转化细胞不能生长、
分化，而转化细胞对该基因产物产生抗性，能正常
生长、分化，从而将转化细胞分离出来。如新霉素
磷酸转移酶(NPTⅡ)对茄科植物(烟草、番茄等)
的转化特别有效;潮霉素磷酸转移酶(HPT)对许
多植物特别是单子叶植物(小麦、玉米等)转化有
效。近年发展起来的磷酸甘露糖异构酶(PMI)基
因，被认为是比较安全的标记基因，作为环境友好
的选择标记［24］，可能在转基因植物研究中具有潜
在、广泛的应用前景。
5. 2 标记基因潜在的安全性问题
在转化过程中使用的这些抗生素标记基因转化
完成后就失去了价值，而且还存在着向其他微生物
或杂草转移的可能，其编码产物对人体和动物的安
全性尚不确定。近年来，转基因植物的安全评价已
引起世界各国政府和科研人员的高度关注，同时也
是转基因植物商业化种植的主要障碍。
转基因植物安全问题主要体现在食品安全和环
境安全两个层面［25］。在食品安全方面，抗生素类基
因及其编码产物对人类或者牲畜可能具有潜在毒性
及致敏性，一旦食物中有所残留，将有可能转入微生
物中，进而影响人或动物消化道内的微生物数量，危
及人和牲畜的健康。在环境安全方面，选择标记基
因有可能会通过基因漂移传播到野生近缘种中，使
杂草获得相应抗性，导致超级杂草的出现。此外，选
择标记基因传播到其他生物体中，可能会破坏生态
系统的平衡。美国科学基金会(NSF)资助的一项研
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2011 年第 3 期 赵彦平等:植物转基因育种的分析与研究
究报告称，一种最普通的转基因玉米(称作 Bt 玉
米)会损害灌溉玉米地的河流生态，这一证据表明，
Bt玉米对昆虫的有毒物质会随河流输送较长距离，
转基因植物对根际土壤生态系统的影响以前也有
报道［26］。
5. 3 标记基因的剔除
选择标记基因及其他冗余基因的剔除，可降低
转基因植物的潜在风险，有利于转基因植物安全评
价和推广。故此，培育安全型转基因植物是目前的
研究热点之一。选择标记基因剔除技术包括:共转
化法剔除选择标记基因、Cre / loxP系统剔除选择标
记基因、FLP /FRT系统剔除选择标记基因、R /RS 系
统剔除选择标记基因、转座子再定位系统剔除选择
标记基因、同源重组系统去除标记基因等［27］。其中
共转化法作为一种简单可行的培育无选择标记转基
因植物的方法，以其操作简单和较高的共转化率而
倍受青睐。目前国内外已成功地运用共转化法获得
了烟草、玉米、水稻、大豆、油菜、大麦和小麦等作物
的转基因品种或品系。
6 外源基因稳定性和表达量分析
6. 1 外源基因稳定性
将外源 DNA导入植物细胞，仅仅是遗传转化的
第一步，紧接着还需要外源 DNA的稳定整合和有效
表达，才能培育出具有新遗传性状的转基因植物。导
致外源基因非孟德尔分离的因素很多，外源基因在植
物核基因组中整合时，整合的 DNA结构变异大、整合
位点多、拷贝数多、基因沉默、损失或丢失整合的遗传
效应复杂，导入外源基因的植株的花粉生活力弱，竞
争不过不含外源基因植株的花粉，会导致不规则的遗
传［28］。这样在有性繁殖过程中传递的遗传规律会比
较复杂，稳定性较差，常出现异常分离。
6. 2 外源基因表达量
外源基因在植物体的表达量受多种因素的影
响，如表达体系、启动子及增强子等，从而表现出表
达量低、蛋白含量少、不稳定以及基因表达出现沉默
等。研究人员为了解决这些问题，不断进行探索，包
括开发组织特异的启动子、转录和翻译增强子、内质
网靶序列以及 3终端序列等，也可以将它们组合起
来共同提高外源基因的表达水平［29］。
6. 3 基因沉默机制及克服探究
在高等植物中，大约 30%的转基因试验都发现
了基因沉默［30］。沉默可以发生在染色体 DNA、转
录和转录后 3 种不同的层次上［31］。
6. 3. 1 转录水平基因沉默 发生在转录水平上的
转基因沉默称为转录失活。
6. 3. 1. 1 甲基化作用 从目前报道看，几乎所有的
转基因沉默现象都与转基因及其启动子的甲基化有
关，DNA甲基化都是从启动子区域开始的，主要发
生在基因 5端启动子区［32］，通常发生在 DNA的 GC
和 CNG序列的 C碱基上，C碱基甲基化不是转基因
沉默前提，但对维持基因沉默是必需的。
6. 3. 1. 2 位置效应 转基因在宿主细胞基因组中
的整合位点往往决定着转基因能否稳定表达。
6. 3. 1. 3 重复序列、同源序列 重复序列诱导的基
因沉默指多拷贝的外源基因以正向或反向串联的形
式整合在植物基因组上而导致的外源基因不同程度
的失活。反向重复的基因或转基因可以进行配对，
配对的 DNA作为信号，使 DAN 异染色质化［33］或从
头甲基化，这样转录过程就会受到抑制。
6. 3. 2 转录后水平基因沉默 转录后水平的基因
沉默是 RNA水平基因调控的结果，比转录水平的基
因沉默更普遍，共抑制(co-suppression)现象是其研
究的热点。共抑制是指在外源基因沉默的同时，与
其同源的内源 DNA 的表达也受到抑制。转录后水
平的基因沉默的特点是外源基因能够转录成 mR-
NA，但正常的 mRNA 不能积累，也就是说 mRNA 一
经合成就被降解或被相应的反义 RNA 或蛋白质封
闭，从而失去功能［34］。
6. 3. 3 环境作用 环境在植物生长和发育中起重
要作用，与动物相比，植物的基因表达与调控对环境
有高度依赖性。其中，光、温度和水等是重要的因
素。在一定环境条件下，导入植物的外源基因可能
由于环境因素诱导而沉默。现已知道环境因素对植
物基因表达的影响是光控因子、热休克元件、种子特
异发育因子等顺式作用元件和反式作用因子以及其
他因子共同作用的结果［35］。
6. 3. 4 转基因沉默的克服方法
6. 3. 4. 1 去甲基化 5-氮胞嘧啶及类似物具有很
好的抑制转基因甲基化和去甲基化作用，从而抑制
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生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2011 年第 3 期
转基因沉默。也可以将与甲基化有关的基因去除，
从而消除沉默现象，如 DNA 甲基化转移酶(Mtase)
与转基因沉默有关，用 RNAi 技术去除水稻(Oryza
sativa L. )中的 OsMET1-1 和 OsMET1-2 酶，能消除
由于甲基化导致的转基因沉默［36］。
6. 3. 4. 2 控制外源基因的拷贝数 Allen 等［37］证
明在外源基因不超过 40 拷贝的情况下，可以减少同
源依赖性基因失活。
6. 3. 4. 3 控制外源基因的结合位点 利用定点插
入的方法，将外源基因插入到与其相似的染色体区
域，避免转基因随机整合到宿主基因异染色质区或
转录不活跃区。Albert 等［38］利用噬菌体 P1 Cre-lox
位点特异性重组系统，将外源基因整合到了烟草基
因组中预先存在的 lox位点上。
6. 3. 4. 4 合理使用增强子和强启动子 用诱导型
启动子的转基因表达，已在少数植物中获得了转基
因植株。姚斌等［39］将 2 个 35S 启动子串联至昆虫
特异性神经毒素 AaIT基因上并导入烟草，获得了高
抗虫性的转基因烟草。
6. 3. 4. 5 利用 MAR 序列 MAR 可能使转基因在
受体基因组整合后形成独立的环状结构，从而提高
转基因的表达水平并减少转基因在不同株系表达差
异，MAR序列可以减少外源基因插入位点附近寄主
染色体对外源基因表达活性的影响，还可以减少同
源依赖性的基因失活。Kim 等［40］用 MAR 构建载
体，转染 CHO细胞，发现 β 球蛋白基因表达量比对
照提高了 7 倍。
7 问题与展望
转基因技术在植物育种中的应用是把双刃剑。
目前，人们恐惧其带来的一些危害，但鉴于转基因育
种的独特优势，我们没有理由仅因为它存在一些潜
在的风险就采取漠视或敌视的态度。相反，应该充
分利用转基因育种，逐步确立一套切实可行的转基
因安全性检测和评价体系，让人们在享受高科技产
品的同时再无后顾之忧。
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(责任编辑 狄艳红)
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