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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2011 年第 8 期
精胺对 Nup98 基因的调控研究
张磊 万涛 田圆圆 王李英 李凯 秦栋栋 曲嘉琳 汤华
(重庆医科大学感染性疾病分子生物学教育部重点实验室，重庆 400016)
摘 要: 利用基因芯片比较鸟氨酸脱羧酶抑制子基因敲除小鼠和正常小鼠肝组织的表达差异;高效液相色谱法测定鸟
氨酸脱羧酶抑制子基因敲除小鼠和正常小鼠肝组织中的精胺含量;构建 Nup98 的启动子 －虫荧光素酶报告基因质粒;脂质体
Lipofectamine 2000TM转染小鼠细胞(NIH3T3) ，在含有精胺或正常培养条件下，测定虫荧光素酶活性。结果显示，Nup98 基因在
鸟氨酸脱羧酶抑制子基因敲除小鼠肝组织表达增强;鸟氨酸脱羧酶抑制子基因敲除小鼠肝组织中，精胺含量增高;成功构建
Nup98 的启动子 －虫荧光素酶报告基因质粒 pGL3-Nup98-P;精胺能在体外培养的条件下，增强虫荧光素酶的活性。这些结果
证明精胺能激活 Nup98 基因的启动子活性，增强其在 NIH3T3 细胞中的表达。
关键词: 精胺 Nup98 鸟氨酸脱羧酶抑制子基因敲除小鼠 表达
Spermine Regulating the Nup 98 Expression in NIH3T3
Cells Through Enhancing Its Promoter Activity
Zhang Lei Wan Tao Tian Yuanyuan Wang Liying Li Kai Qin Dongdong Qu Jialin Tang Hua
(Key Laboratory of Molecular Biology on Infectious Diseases，
Ministry of Education，Chongqing Medical University，Chongqing 400016)
Abstract: The Nup98 expressions between Azin1 knock out mice and wild-type mice were analyzed by using Real-time PCR. The
levels of spermine in Azin1 knock out mice and in wild-type mice were determined by HPLC method. Nup98 promoter luciferase report-
er plasmid was constructed，then NIH3T3cells were transiently transfected with the same amount of Nup98 promoter luciferase reporter
plasmid，and luciferase activity was detected with and without spermine． Results showed that Nup98 expression on mRNA level is signif-
icantly elevated in liver of Azin1 knock out mice． The level of spermine was increased in Azin1 knock out mice． Nup98 promoter lucifer-
ase reporter plasmid pGL3-Nup98-P，was constructed successfully． Spermine could enhance the activity of Nup98 promoter． These data
demonstrated that spermine regulates the Nup98 expression in NIH3T3 cells through enhancing its promoter activity．
Key words: Spermine Nup98 Azin1 gene knock out mice Expression
收稿日期:2011-01-24
基金项目:国家自然科学基金资助项目(30671080)
作者简介:张磊，硕士，研究方向:分子生物学;E-mail:leizi198315@ 163. com
通讯作者:汤华，研究员，E-mail:tanghua86162003@ yahoo. com. cn
精胺(spermine，Spm)是多胺(polyamine)的一
种，是生物代谢过程中产生的具有生物活性的低分
子量脂肪族含氮碱。精胺在生物体内含量不高，却
是微生物、动物及人体合成核酸和蛋白质所必需的
一种调控物质。凡生长旺盛的组织，如胎肝、幼仔胃
肠道及癌肿瘤中，都伴有精胺合成和分泌的明显增
加，并且先于 DNA、RNA 及蛋白质的合成。因此精
胺在细胞增殖、增生和分化中具有重要作用［1］。精
胺可参与 DNA、RNA、蛋白质及带负电的膜成分之
间静电反应。
在真核细胞中，鸟氨酸在鸟氨酸脱羧酶(ODC)
的作用下生成腐胺;甲硫氨酸在腺苷甲硫氨酸脱羧
酶(S-AdeMetDC)作用下生成脱羧的 S-腺苷甲硫氨
酸;腐胺和脱羧的 S-腺苷甲硫氨酸在精脒合成酶作
用下生成精脒;精脒经精胺合成酶转化成精胺。其
中，作用于脱羧过程的 ODC 和 S-AdeMetDC 是生物
合成过程的限速酶，它们不仅半衰期短，而且在多种
水平上受到高度调节。ODC 的主要调节因子是鸟
2011 年第 8 期 张磊等:精胺对 Nup98 基因的调控研究
氨酸脱羧酶抗酶因子(Antizyme，AZ) ;AZ 能与 ODC
单体结合，抑制 ODC的催化活性，是 ODC 酶的抑制
蛋白;AZ 与 ODC 的结合能激发 26S 蛋白分解体
(proteasome)对 ODC 的降解反应。另一个 ODC 的
调节因子是鸟氨酸脱羧酶抗酶抑制子(ornithine de-
carboxylase antizyme inhibitor，AZI) ，AZI 与 ODC 结
构有近 50%相似性，分子量也与 ODC 相似，但 AZI
不具有催化活性，AZI、ODC 与 AZ 之间发生竞争结
合，而且 AZI 与 AZ 的亲和力强于 ODC 与 AZ 的亲
和力，AZI 能把 ODC从 AZ的结合中解救出来，减弱
AZ对 ODC催化活性的抑制。AZI能对 ODC的催化
活性起稳定作用［2］。为了研究鸟氨酸脱羧酶抗酶
抑制子基因功能，我们利用基因捕获技术构建了鸟
氨酸脱羧酶抗酶抑制子基因缺失的小鼠［3］。基因
芯片结果显示，鸟氨酸脱羧酶抗酶抑制子基因敲除
小鼠中 Nup98 (Nucleoprotein98)的表达是上调
的［4］，所以推测鸟氨酸脱羧酶抗酶抑制子基因敲除
后，精胺的上调与 Nup98 基因的过表达可能存在相
关性。
本试验拟利用荧光定量 PCR 检测 Nup98 基因
在鸟氨酸脱羧酶抗酶抑制子基因敲除小鼠与野生小
鼠的表达差异，构建含有 Nup98 基因的启动子 －萤
火虫荧光素酶报告基因质粒，将其转染 NIH3T3 小
鼠成纤维细胞，在含有精胺或正常培养条件下，测定
其萤火虫荧光素酶活性，从而验证 Nup98 基因的表
达与精胺的关系。
1 材料与方法
1. 1 材料
MIH3T3 细胞系由本实验室保存，大肠杆菌
DH5α由本实验室保存。质粒 pGL3-Basic、pRL-TK
及双荧光素酶检测系统购自 Promega 公司。pGL3-
DNAJB4-P由本实验室构建［5］。精胺(SB0902)由上
海生工生物工程技术服务有限公司提供。
1. 2 方法
1. 2. 1 细胞培养 NIH3T3 细胞系培养于含有
10%胎牛血清，1%青 /链霉素的 DMEM 培养基中，
培养条件:含 5%CO2，增湿的 37℃孵箱。
1. 2. 2 Real-time PCR鉴定 Nup98 在 AZI基因敲除
小鼠与野生小鼠的表达差异 Real-time PCR 采用
IQ5 multicolor Real-time PCR detection system(Bio-
Rad)测定，用 Power SYBR Green PCR Master Mix
在 25 μL反应体系中进行。采用 ABI Primer Express
软件设计的引物。
Nup98:forward:5-CAGGCACAGCCAAATCACAT-
3，reverse:5-CCGTTGGCTAGAGATGGTTCA-3。
β-actin:forward:5-CCTGGCACCCAGCACAAT-
3，reverse:5-GCCGATCCACACGGAGTA-3。
Real-time PCR反应条件:50℃ 2 min 合成 cD-
NA，95℃，5 min 使逆转录酶失活，接着 40 个循环
95℃ 20 s，55℃ 20 s。溶解曲线的获得 95℃ 1 min，
55℃ 1 min，55℃ 10 s每次增加 0. 5℃，40个循环。通
过计算阈值(Ct值)来评估mRNA水平。Ct值用 β-ac-
tin来标化，目的基因(GT)的 mRNA 相对量 = 2-ΔΔCt。
所有试验都是同时做 3份，进行 3次独立试验。
ΔΔCt =［CtGT(sample) － Ctβ-actin(sample)］－［CtGT(control) －
Ctβ-actin(control)］
1. 2. 3 Nup98 启动子的荧光素酶表达质粒的构建
及鉴定 从 Promoter 2. 0 Prediction Server database
(http:/ /www. cbs. dtu. dk /services /Promoter /)中 获
得 Nup98 启动子的 DNA 序列，用常规 PCR 方法提
取 NIH3T3 细胞基因组 DNA 作为模板，PCR 扩增
Nup98 启动子片段。引物为 5-AGTGAGCTCCCAA-
GAATCTCCTCATTGGG-3 和 5-TATAAGCTTCTC-
CCGAGCCAGGCCGCAGG-3(划线部分分别表示
Hind Ⅲ和 Sal I酶切位点)。PCR反应程序:94℃预
变性 5 min;94℃变性 1 min，58℃退火 1 min，72℃延
伸 1 min，30 个循环;72℃后延伸 8 min。PCR扩增的
Nup98 启动子 DNA 和 pGL3-Basic 质粒，各经 Hind
Ⅲ和 Sal I 双酶切后，胶回收，T4连接酶 16℃过夜连
接，连接产物转化 DH5α感受态菌。挑选阳性克隆，
扩增后小量提取质粒进行酶切鉴定及测序。
1. 2. 4 细胞转染及双荧光素酶报告系统检测
所有转染都是在 24 孔板中进行，每组同时转染 3
孔，进行 3 次独立试验。NIH3T3 细胞按每孔 2 × 105
个细胞培养，Lipofectamine 2000TM作为转染试剂，具
体操作按试剂盒说明书进行。转染后 4 h 后换液，
同时加入精胺至 1 μg /mL，48 h后收获细胞，提取蛋
白，进行双荧光素酶报告系统检测。按照 Promega
试剂盒 Dual-Luciferase Reporter Assay System说明书
操作。所用仪器为 Turner TD20 /20 luminometer，
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pRL-TK质粒作为内参用来标化转染效率，每组的相
对荧光素酶活性以虫荧光素酶活性与海肾荧光素酶
活性的比值(相对荧光素酶活性)来表示。
1. 2. 5 统计学分析 所有试验都是同时做 3 份，进
行 3 次独立试验。采用 t 检验(Microsoft office Ex-
cel)进行显著性分析。P ＜ 0. 05 则认为差异有统计
学意义。数据以均数 ±标准差(x— ± s)的形式表示。
2 结果
2. 1 精胺在 AZI基因敲除的小鼠和野生小鼠中的
表达
利用高效液相色谱法测定 AZI基因敲除小鼠和
正常小鼠肝组织中的精胺含量。结果如图 1 所示，
精胺在 AZI基因敲除小鼠中的肝脏、脑、肾脏中的表
达较野生小鼠是增加的。
+ / + 为正常小鼠;+ / －为杂合子 AZI 基因敲除小鼠;
－ / －为纯合子 AZI基因敲除小鼠
图 1 高效液相色谱法测定 AZI基因敲除小鼠和
野生小鼠组织中的精胺含量
2. 2 Nup98 基因在 AZI 基因敲除的小鼠和野生小
鼠中的表达
用基因芯片技术分析了 AZI基因敲除小鼠与正
常小鼠肝脏的表达差异，发现 Nup98 基因在 AZI 基
因敲除的小鼠中的表达是在野生小鼠中表达的 10
倍以上。采用 Real-time PCR 验证了 Nup98 在 AZI
基因敲除的小鼠和野生小鼠的表达差异。Real-time
PCR结果(图 2)显示，在 AZI 基因敲除的小鼠肝脏
中，Nup98 基因的表达是在野生小鼠肝脏的 2 倍。
2. 3 Nup98启动子的虫荧光素酶表达质粒的构建及
鉴定
为了进一步探究 Nup98 转录调节的分子机制，
构建了 Nup98 启动子的萤火虫荧光素酶表达质粒。
将 Nup98 启动子克隆入无启动子的 pGL3-Basic 质
粒中，构建的重组质粒 pGL3-Nup98-P，经 Hind Ⅲ和
Sal I双酶切，可获得大小为 1. 2 kb和 4 791 bp的两
个片段(图 3)。测序结果证实重组质粒 pGL3-
Nup98-P序列正确，表明 Nup98 启动子已成功克隆
入 pGL3-Basic质粒。
图 2 Real-time PCR检测 Nup98 在野生型小鼠与
AZI基因敲除型小鼠的表达差异
M1． λ-EcoT14Ⅰdigest DNA Marker;1． pGL3-Basic经 Hind
Ⅲ和 Sal I双酶切;2． pGL3-Nup98-p经 HindⅢ和 Sal I双
酶切;3． Nup98 promoter PCR 产物;M2． DL2000 DNA
Marker
图 3 pGL3-Nup98-P双酶切鉴定
2. 4 精胺上调 Nup98 启动子活性
首先确定了 Nup98 启动子的活性，将 Nup98 启
动子的萤火虫荧光素酶表达质粒 pGL3-Nup98-P 与
pRL-TK共转染 NIH3T3 细胞，同时以 pGL3-DNAJB4-
P为阳性对照［5］，pGL3-Basic 为阴性对照。pRL-TK
质粒作为内参用来标化转染效率，48 h后检测双荧光
素酶的活性。如图 4-A 显示，构建的 pGL3-Nup98-P
有较强的活性，大约 pGL3-DNAJB4-P的 20倍。
为了进一步确定 Nup98 表达增加是否由于精
胺增强其启动子活性而引起的，将 Nup98 启动子的
萤火虫荧光素酶表达质粒 pGL3-Nup98-P与 pRL-TK
共转染 NIH3T3 细胞，转染 4 h 后换液，同时加入
100 mg /mL的精胺溶液，使其在培养液中的终浓度
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为 1 μg /mL，48 h 后检测双荧光素酶的活性。结果
如图 4-B 所示，NIH3T3 细胞共转染 pGL3-Nup98 和
pRL-TK后，加入精胺的细胞组与正常培养的细胞组
相比较，Nup98 的相对荧光素酶活性增加了 2 倍。
这个结果说明精胺能增强 Nup98 启动子活性并促
进其表达。
图 4 pGL3-Nup98-P活性的鉴定结果(A)及精胺对 Nup98 启动子的活性影响(B)
3 讨论
核孔蛋白是近年来研究发现的贯穿细胞核膜的
一个重要双向通道，在调控核内外蛋白的转运过程
中起重要作用，位于核内的蛋白质在胞浆合成后经
核孔蛋白输入胞核。Nup98 是核孔蛋白的一种，它
是核孔复合物(nuclear pore complex)的组成部分，
位于人类染色体 11P15，编码分子量 98 kD 的核孔
蛋白。Nup98 位于核孔复合物的胞核面，它在核浆
运输中起到停靠蛋白的作用。这一功能主要依赖于
其 N-末端的多个丙氨酸 －甘氨酸(FG)重复序列［6］。
Nup98 对 mRNA 细胞核经核孔蛋白输出至胞浆中
起很重要的功能［7］。Wu等［8］发现敲除 Nup98 基因
的小鼠胚胎发育阻滞在原肠胚期，表明 Nup98 基因
还参与个体发育过程。
精胺是多胺的一种，多胺可以促进 DNA 合成，
可能与其稳定 DNA的二级结构有关，尤其是与稳定
酶 －模板复合物的作用有关。此外，参与复制过程
的一些蛋白质、旋转酶、引发酶及拓扑异构酶都能与
多胺起交互作用，影响 DNA复制。多胺可以发挥信
使作用激活环腺苷酸酶，从而使 cAMP含量升高，激
活蛋白激酶，使磷酸化酶激酶活化，最终使非组蛋白
磷酸化，而磷酸化后的核蛋白靠磷酸基因的负电荷
和组蛋白静电吸附，从而使组蛋白从 DNA上游离下
来，打开基因，进行转录。多胺也可以激活核激酶而
使核蛋白磷酸化，而且精胺的这种效应远远大于其
他多胺，当然也不能排除精胺直接作用于 DNA从而
影响其转录活性。精胺的分子结构表明，由于精胺
是多聚阳离子分子，裸露的 4 个氮原子空轨道具有
强烈的亲电子能力，易与阴离子分子(如 DNA)结
合［9］。外源精胺进入细胞内，以次丙基把 DNA双螺
旋链上相邻的磷酸基团(多价阴离子)连接起来，形
成圆柱形超螺旋结构，精胺越多，结构越稳定，这称
之为精胺对 DNA 的凝集(condensation)效应［9，10］。
精胺使 DNA正常结构更稳定，有效增加 DNA 合成
的起始效率和合成过程的忠实性。
我们利用基因芯片的方法比较鸟氨酸脱羧酶抑
制子基因敲除小鼠和正常小鼠肝组织表达差异，发现
Nup98基因在鸟氨酸脱羧酶抗酶抑制子基因敲除的
小鼠中的表达是在野生小鼠中表达的 10 倍以上。同
时在小鼠的脑、肝脏、肾脏中精胺的水平是上调的，在
NIH3T3中转入 Nup98 启动子报告基因后，加入精胺
后其活性上调了 2倍，说明精胺可以通过促进 Nup98
启动子的活性进而促进 Nup98 的表达。但具体机制
还不明确，还需进一步的研究。总之，我们发现了精
胺的又一新的调控现象，为以后的研究提供了线索。
参 考 文 献
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(责任编辑 马鑫
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