全 文 ：生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2009年第 3期·研究报告·
收稿日期：2008-09-16
基金项目：国家自然科学基金（30370647）
作者简介：冯志国（1979-），男，博士研究生，研究方向：分子生物学；Tel：027-87792025，E-mail：ffzzgg@yahoo.com.cn
昆虫等无脊椎动物不具备特异性免疫系统，但
昆虫的脂肪体会产生各种抗菌肽来应对损伤和感
染 [1]。迄今为止，昆虫中发现超过 200 多种昆虫抗菌
肽类物质。 根据分子结构的特点，昆虫抗菌肽可分
为 4 类：包括形成两性分子 α-螺旋的抗菌肽，即天
蚕素 （cecropins）类 ；分子内有二硫键的抗菌肽 ，即
昆虫防御素 （insect defensins）类 ；富脯氨酸抗菌肽
（proline-rich peptides）；以及富甘氨酸抗菌肽 （glysi-
ne-rich peptides）[2]。
细菌耐药对现在临床用药是一个棘手问题。生
物机体内天然合成的富甘氨酸抗菌肽其穿膜作用
机制不易使细菌产生耐药，可以很好地解决因细菌
耐药造成的临床用药困难。 抗菌肽的天然产量低，
合成或从机体中提取步骤复杂、产率低 、价格相当
昂贵， 利用基因工程技术生产抗菌肽具有重要意
义 。 以往的研究主要集中在融合表达上 ：RepA[3]、
PurF 的 F4 片段 [4]、PaP3.30 蛋白 [5]、绿色荧光蛋白
（GFP）[6]、硫氧还蛋白 [7，8]。但是表达的融合蛋白最后
还要切除融合伴侣，复杂麻烦需要蛋白酶切且影响
其得率。利用乳糖操纵子的葡萄糖效应在大肠杆菌
中的直接表达了一个有抗菌活性的富甘氨酸果蝇
抗菌肽，并利用其 C-末端的 6×His 标签把其大量纯
化。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌株与质粒 大肠杆菌 DH5α、BL21（DE3）
富甘氨酸果蝇抗菌肽在大肠杆菌中的直接表达和纯化
冯志国 1，2 陆婕 1 郎君 1 李燕娇 1 陈正望 1
（1华中科技大学分子生物物理教育部重点实验室，武汉 430074；2信阳师范学院生命科学学院，信阳 464000）
摘 要： 利用 RT-PCR 技术从果蝇总 RNA中克隆出富甘氨酸果蝇抗菌肽基因，将该基因插入原核表达载体 pET-
32a（+）的 Nde I和 Xho I酶切位点之间，然后用重组质粒转化大肠杆菌 BL21（DE3）利用乳糖操纵子的葡萄糖效应 IPTG
诱导表达，经 15%SDS-PAGE、Western blot分析，在大约 8 kD处出现了含 6×His标签的抗菌肽蛋白。再以 Ni-N TA纯
化树脂进行亲和层析、脱盐、冻干，成功制备了富甘氨酸果蝇抗菌肽蛋白。
关键词： 果蝇 富甘氨酸抗菌肽 直接表达 纯化 葡萄糖效应
Direct Expression and Purification of Glycine-rich Antibacterial
Peptide of Drosophila in Escherichia coli
Feng Zhiguo1，2 Lu Jie1 Lang Jun1 Li Yanjiao1 Chen Zhengwang1
（1Key Laboratory of Molecular Biophysics Ministry of Education，Huazhong University of Science and Technology（HUST），
Wuhan 430074；2College of Life Sciences，Xinyang Normal University，Xinyang 464000）
Abstract： The gene of antibacterial peptide was amplified from Drosophila total RNA using RT-PCR，and then
inserted into Nde I and Xho I enzyme-cutting sites of pET-32a plasmid. The recombinant vectors were transformed into
the competent cell E. coli BL 21. By using the glucose effect or catabolite，the antibacterial peptide was expressed in E.
coli BL21（DE3） by the induction of IPTG. By the analysis of 15% SDS-PAGE and Western blot，the antibacterial
peptide was found at 8 kD. After the expressed product was purified by affinity binding chromatography with Ni-NTA，
salt-out and freeze-dried procedure，the product was obtained.
Key words： Drosophila Glysine-rich peptides Direct expression Purification Glucose effect
2009年第 3期
和表达载体 pET32a（+）为本室保存菌株和质粒，p-
MD18-T simple 克隆载体购自 TaKaRa 公司。
1.1.2 工具酶及主要试剂 限制性内切酶购自
TaKaRa 公司 ；DNA Marker、 质粒小提试剂盒、DNA
凝胶回收试剂盒、硝酸纤维素膜、His 单克隆抗体购
自天根生化；低分子量蛋白 Marker、T4 DNA 连接酶
购自 NEB （Fermentas）；IPTG 购自 Promega 公司；其
它常规化学试剂为分析纯以上产品。 培养基为 LB
培养基。 引物合成和测序由北京奥科完成。
1.1.3 蛋白纯化系统 Ni-NTA 纯化树脂为 GE H-
ealthcare 公司产品。层析系统（魧KTA prime，Amersh-
am，瑞典 ），脱盐用 G25Coarse 柱 ，微量蛋白质垂直
电泳仪 （Mini-PROTEAN 3Cell，Bio-rad，美国 ），冻干
机 （SNL 315SV Speed Vac，Savant，美国 ），高速冷冻
离心机（GL21M，英泰，长沙）。
1.2 实验方法
1.2.1 引物设计 根据 NCBI 上的 nm_166597 序
列和 PCR 引物的设计原则， 并借助软件 DNA Star
进行辅助分析，设计 1 对 PCR 引物。 上游引物（Pri-
mer1）：5-ATACATATGAGCCAGGTGGGCGACCTAG-
G-3；下游引物 （Primer2）：5-ATACTCGAGCTTGAT-
CTGCTGGTGGTGGAAC-3。 Primer1的 5′端含有 Nde I
酶切位点；Primer2 的 5′端含有 Xho I 酶切位点 （下
划线部分）。
1.2.2 总 RNA 的提取与 RT-PCR 用 Trizol 一步
法从果蝇中提取总 RNA，以 oligo（dT）为引物进行
反转录； 以上述引物进行 PCR 扩增。 反应条件为
94℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s；30 个循环；72℃延伸
10 min；PCR 产物经 2.0%琼脂糖凝胶电泳鉴定 ，
PCR 产物用 QIAGEN PCR 产物纯化试剂盒纯化洗
脱液。
1.2.3 原核表达载体 pET32a（+）的构建与鉴定 将
纯化的 PCR 产物连接 pMD18-T simple vector（Taka-
ra）载体 ，转化 E. coli DH5α；PCR 鉴定的阳性重组
质粒用 Nde I 和 Xho I 双酶切，回收基因片段，与经
同样双酶切处理的 pET32a（+）载体用 T4 DNA 连接
酶连接，构建原核表达载体，转化 E. coli DH5α；挑
选阳性菌落提取质粒送北京奥科公司测序鉴定。
1.2.4 重组蛋白的诱导表达 将鉴定正确的重组
质粒转化表达菌株 BL21（DE3），挑选阳性菌落接种
于含 Ampr（100 mg/L）LB 培养基，加入 0.3%的葡萄
糖，37℃过夜培养；1∶100 接种于 LB 培养基中，37℃
振荡培养至 A600nm 为 0.9 左右 ， 加入 IPTG 至 0.3
mmol /L，继续培养 7 h；4℃ 6 000 r/min 离心 10 min
收集菌体。 15%SDS-PAGE 和分析目的蛋白。
1.2.5 Western Blot 参照《分子克隆》中的 Western
Blot 操作方法进行。
1.2.6 蛋白的纯化 菌体沉淀重悬于 Resin 树脂
（GE Healthcare）亲和层析柱的上样缓冲液 （20 mM
磷酸盐 ，0.5 M NaCl，pH7.4）， 采用 200 W 超声破
菌，其中超声 5 s，间歇 5 s，共进行 90 次。裂解物经
14 000 r/min，4℃，离心 20 min，取上清；分别用洗脱
缓冲液 （20 mM 磷酸盐 ，0.5 M NaCl，20 mM 咪唑 ，
pH7.4）和洗脱缓冲液 （20 mM 磷酸盐 ，0.5 M NaCl，
100 mM 咪唑，pH7.4）洗脱掉杂蛋白，以及洗脱缓冲
液 （20 mM 磷酸盐 ，0.5 M NaCl，500 mM 咪唑 ，pH
7.4）洗脱 。 收集各洗脱峰 ，脱盐 ，冷冻干燥 。 15%
SDS-PAGE 分析。
2 结果与分析
2.1 果蝇抗菌肽基因的 cDNA 克隆
PCR 扩增产物经 2.0%琼脂糖凝胶电泳， 在约
200 bp 处可见特异性扩增条带 ， 与理论值 200 bp
相符（图 1）。 测序结果与 GenBank 公布的基因序列
一致。
2.2 表达载体的构建与鉴定
PCR 产物在 T4 DNA 连接酶作用下克隆到 pM-
D18-T simple 载体中， 转化 E. coli DH5α 后挑选阳
性菌落，测序正确的 DNA 片段经 Nde I 和 Xho I 双
酶切后插入 pET -32a（+）原核表达载体（图 2）。
2.3 大肠杆菌中的诱导表达与 Western Blot 鉴定
鉴定正确的质粒转化表达菌株 E. coli BL21
（DE3）在 IPTG 的诱导下表达。 pET232a（+）质粒按
同样方法进行转化 、诱导表达 ，取 3 h 诱导表达产
bp
600
500
400
300
200
100
M 1
M.DNA 分子量标准；1.PCR 扩增结果
图 1 果蝇抗菌肽基因的 cDNA 克隆
冯志国等：富甘氨酸果蝇抗菌肽在大肠杆菌中的直接表达和纯化 89
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2009年第 3期
物作为对照。 经过 15%SDS-PAGE 分析 ，表达产物
相对分子质量约为 8 kD（图 3）。将表达产物经 15%
SDS-PAGE 分离，转移至硝酸纤维素膜上，用 His 单
克隆抗体作为特异性抗体，可见 1 条特异条带 （图
略），确定为富甘氨酸果蝇抗菌肽蛋白，说明表达蛋
白具有良好的特异性。
2.4 表达产物的纯化
将表达的产物离心获得菌体，加入上样缓冲液
重悬，冰浴超声 ；14 000 r/min，4℃，离心 20 min，取
上清；用 Ni-NTA 纯化树脂进行层析纯化（图 4）。
3 讨论
由于抗菌肽天然含量低，直接提取远不能满足
需要，且成本高、得率低、工序繁；化学合成可行，但
成本太高，应用受到局限。 随着基因工程技术的发
展，通过基因重组技术生产抗菌肽，以满足研究和
生产的需要成为可能，因此，构建一个表达高效、易
于纯化的表达体系以制备大量的防御素多肽是必
需的。大肠杆菌是目前应用最为广泛的外源基因表
达宿主菌，很多抗菌多肽通过融合形式在大肠杆菌
表达体系中得到表达，本试验利用乳糖操纵子的葡
萄糖效应在大肠杆菌中直接表达了富甘氨酸抗菌
肽。 原因是抗菌肽是对细菌细胞有潜在毒性的蛋
白，在细菌生长阶段，首先利用乳糖操纵子的葡萄
糖效应或产物抑制将 pET 系统中 T7 基因的基础表
达减弱 [9]，细菌进入对数生长期后 ，当葡萄糖消耗
完时再用 IPTG 诱导。
组氨酸是具有杂环的氨基酸，含有一个咪唑基
团，这个化学结构带有很多额外电子，对于带正电
的化学物质有静电引力。亲和层析是利用这个原理
使亲和配体（即填料）上带正电的阳离子（一般是镍
离子）对组氨酸有亲和作用。 组氨酸标签是原核表
达载体上 6 个组氨酸的区段，这个标签在 pH8.0 时
不带电，无免疫原性，对蛋白质的分泌，折叠，功能
基本无影响，且能高度亲和镍离子，用于蛋白质的
亲和纯化。本研究建立了表达和纯化的富甘氨酸抗
菌肽的原核表达系统 ，并且有抗菌活性，为该抗菌
肽的功能研究和商业生产奠定了基础。
参考文献
1 Kamysz W，Turecka K.Acta Pol Pharm，2005，62（5）：341~344.
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图 2 抗菌肽的推导序列和重组表达载体的结构
kD
116
66.2
45.0
35.0
25.0
18.4
14.4
M 1 2 3 4
M.蛋白质分子量标准 ；1.pET32a+诱导前；2.pET32a+诱导
3 h 后；3.融合质粒诱导前 ；4.融合质粒诱导 7 h 后
图 3 15%SDS-PAGE 的表达分析
kD
116
66.2
45.0
35.0
25.0
18.4
14.4
M 1 2 3
M.蛋白分子量标准 ；1.超声破碎后的上清液 ；2.用含有 20
mmol/L 咪唑的结合缓冲液洗涤后所得样品 ；3. 用含有 100
mmol/L 咪唑的结合缓冲液洗涤后所得样品
图 4 15%SDS-PAGE 的纯化分析
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