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综述与专论

生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2010年第 2期
内皮祖细胞的分离培养与鉴定
白春雨 1, 2  侯玲玲 3 庞全海2  关伟军1  马月辉 1
( 1中国农业科学院北京畜牧兽医研究所,北京 100194; 2山西农业大学动物科技学院,太古 030801;
3北京交通大学生命科学与生物工程研究院,北京 100044)
  摘  要:  内皮祖细胞的分离方法有免疫磁珠分离法、淋巴细胞分离液分离法 ( 1. 077)和差速贴壁法, 这 3种方法已被人
们广泛使用, 均可分离到一定的目的细胞。分离到的目的细胞在培养过程中逐渐分化、成熟、发育为内皮细胞。在内皮细胞
和内皮祖细胞的鉴别区分,使用 CD34+ /CD133+ /KDR +鉴定为内皮祖细胞,同时使用内皮祖细胞吞噬 Dil
ac
LDLFITC
UEA双
阳性的方法也可鉴定为内皮祖细胞。
关键词:  内皮祖细胞 分离 鉴定
Isolation, Culture and Identification of Endothelial Progenitor Cells
Bai Chunyu
1, 2  Hou L ingling3  Pang Quanhai2  GuanW eijun1  M aYuehui1
(
1
Institute of Animal Science, ChineseA cademy of Agricultural Science, B eijing 100193;
2
College of A nimal Science and Veter inaryM edicine, Shanx i Agr iculture University, Taigu 030801;
3
Institute of Life Science and B ioengineering, B eijing J iaotong University, B eijing 100044)
  Abstrac:t  There a re three iso lation m ethods o f endo the lial progenito r ce lls, includ ing immunom agnetic beads, lym phocy te separa

ting m edium( 1. 077) and d ifferen tia l adhesion, wh ich has been w ide ly used and could iso late a certa in number o f the des ired cells.
These ce lls gradually d ifferen tiate, m ature, and deve lope into endothe lia l ce lls in culture process. In identification, cells w ith CD34+ /
CD133+ /KDR+ are identified as endothe lia l progenito r ce lls, and at the sam e tim e, the doub le positive phagocytos is assay o f D il
ac
LD

LF ITC
UEA also help to iden tify endothe lial progenitor ce lls.
Key words:  Endo the lia l progen ito r ce lls Iso la tion Iden tification
收稿日期: 2009
10
19
基金项目:国家自然科学基金资助项目 ( 30671539) , 863!课题基金资助项目 ( 2006AA10Z198 ), 863!课题基金资助项目 ( 2007AA10Z170 )
作者简介:白春雨,男,在读硕士,从事细胞与分子生物学研究
通讯作者:关伟军,男,教授,博士生导师,研究方向:细胞与分子生物学; E
m ai:l w jguan86@ iascaas. net. cn
马月辉,男,研究员,博士生导师,研究方向:遗传资源学; E
m ai:l yuehu .i m a@ 263. net
血管内皮祖细胞 ( endo thelia l progenitor cells,
EPCs)是血管内皮细胞的前体细胞, 即能分化为成
熟血管内皮细胞的祖细胞, 又称血管母细胞 ( ang io

b last)或血管内皮干细胞 ( endo the lia l stem ce lls)来
源于骨髓的原始细胞, 与人类胚胎时期的成血管细
胞 ( ang ioblast)和人脐带静脉内皮细胞 ( human um

b ilica l vein endo thelia l cells, HUVEC)相似,在一定条
件下可诱导分化成为成熟的内皮细胞 ( endothelial
cells, EC s)。 1997年, Asahara等 [ 1 ]首次分离并证实
成年人外周血中存在着能分化为血管内皮细胞的内
皮祖细胞,并在体内证实了其生成血管的能力,人们
开始了对内皮祖细胞各方面的研究。目前, 内皮祖
细胞先后从脐血、脂肪、骨髓和胎肝中 [ 2
7]被分离出
来, 并且内皮祖细胞的功能应用研究也取得一定成
果, 为临床应用奠定了基础。但是,内皮祖细胞的数
量极其稀少是科研人员对内皮细胞研究的难点, 加
之内皮细胞的细胞表面标志与其它干细胞和成熟内
皮细胞标志极其相似, 使深入研究难上加难。将针
对内皮祖细胞的分离与鉴定方法进行综合论述。
1 内皮祖细胞的分离培养
1. 1 分离方法
1. 1. 1 免疫磁珠分离 免疫磁珠技术具有操作简
便、分选纯度高、回收率高、分选后细胞活性好的特
2010年第 2期 白春雨等:内皮祖细胞的分离培养与鉴定
点,已成为细胞分选的标准方法。其基本原理是将
磁性微珠直接或间接耦联在抗体上, 通过抗原抗体
反应使磁珠耦联的抗体与表达相应抗原的细胞特异
性结合,磁性标记的细胞在经过一个带有梯度的高
强磁场时会滞留在磁场中, 而不表达相应抗原的细
胞因为没有磁性标记,首先流出来,从而达到磁性分
离的目的。离开磁场后, 磁性标记细胞不再受磁场
作用, 就可以被洗脱下来。使用 CD34磁性分离
K i,t按照说明书, 经过 MACS抗体标记和 MACS分
离即可获得 CD34阳性细胞, 即为内皮祖细胞。郑
奇军等 [ 8]用该方法从骨髓中分离得到内皮祖细胞
分离率达到 76%,可以获得较高的纯度。
1. 1. 2 密度梯度离心法 此种方法根据细胞密度
大小不同, 采用不同密度的分离液将目的细胞从血
液 /骨髓中分离出来。常用的分离液有 Fico ll和 Per

co ll。Fico ll渗透压低,但它的粘度却特别高, 为此常
与泛影葡胺混合使用以降低粘度。目前市场已有各
种浓度 F icoll的成品销售。 Percoll是一种包有乙烯
吡咯烷酮的硅胶颗粒。渗透压很低 ( < 20 mosm /kg
H2O ),粘度也很小, 可形成高达 1. 3 g /mL密度,采
用预先形成的密度梯度时可在低离心力 ( 200 -
1 000 ∀ g)于数分钟内达到满意的细胞分离结果。
由于 Percoll扩散常数低, 所形成的梯度稳定。此
外, Percoll不穿透生物膜, 对细胞无毒害,因此广泛
用于分离细胞、亚细胞成分、细菌及病毒, 还可将受
损细胞及其碎片与完好的活细胞分离。根据所选细
胞的密度大小将分离液配制好,先将配好的分离液
加入透明带盖的玻璃离心管中, 按 1#1的比例将样
品加入离心管,加样品时注意要将样品缓慢加入使
样品叠加在分离液上,不要与分离液混匀。加好后,
2 500 r /m in 30m in,轻轻取出离心管,可见管内分为
3层,下层为红细胞和血小板, 中层为分离液, 上层
为血浆,再上层和中层之间有一层薄薄的白色云雾
状的细胞层,为单核细胞。用细的玻璃吸管轻轻将
该层吸出, 放入另一个离心管中, 加入 PBS重悬细
胞, 800 r /m in 10m in离心 3次清洗分离液, 最后将
所得细胞用培养液重悬,培养。
1. 1. 3 差速贴壁分离法 此种方法主要是用于在
骨髓中分离出内皮祖细胞, 骨髓中细胞多, 且种类
杂,很难分离出单纯的目的细胞。根据各种细胞贴
壁能力的不同而达到分离内皮祖细胞,骨髓中贴壁
能力最强的是成纤维细胞和成熟的内皮细胞, 贾国
梁 [ 9]采用将细胞 4 h贴壁后移至另一孔中, 24 h后
再取出上清收集未贴壁的细胞进行继续培养, 最初
4 h的培养主要消除成纤维细胞和成熟内皮细胞,
以及巨噬细胞, 24 h之内贴壁的细胞主要是骨髓间
充质干细胞和其它干细胞。魏来 [ 10]从收集细胞后
采用 48 h培养, 取培养的上清液, 收集细胞继续培
养, 也可得到内皮祖细胞。郑奇军等 [ 8]将收集到的
细胞培养 24 h后移至另一培养瓶中培养,待 24 h后
收集上清液中的细胞继续培养仍可以得到内皮祖细
胞。程铖 [ 11]从兔的骨髓中分离内皮祖细胞时使用
分离液分离后,直接培养, 不再使用差速贴壁, 贴壁
细胞 D IL
ac
LDL及 FITC
UEA
1双荧光阳性, 阳性
率为 65%。
目前, 使用差速贴壁分离法从骨髓中分离内皮
祖细胞所使用差速贴壁的时间各不相同,但终可以
获得到目的细胞,在使用差速贴壁法分离时,差速所
需要的时间主要根据所选动物的品种而定, 品种不
同细胞活力和贴壁能力都不相同, 往往哺乳类动物
细胞比禽类的活力强,差速贴壁 48 h后仍可得到内
皮祖细胞, 而禽类在 24 h后可以得到细胞, 48 h后
几乎得不到细胞。
1. 2 培养
内皮祖细胞的培养有别于其它成体干细胞, 其
培养基要求 EGM
2MV专用培养基, 但是专用培养
基价格昂贵。很多学者根据 EGM
2MV的主要成分
使用 M199培养基添加 VEGF, BFGF和 IGF等细胞因
子同时配合血清,来代替专用培养基, 用于内皮祖细
胞的培养。例如李红霞等 [ 12] , 孙龙等 [ 13] 报道用
DMEM, IMEM培养基亦可培养内皮祖细胞。而在
培养基中添加 VEGF等细胞因子的使用上报道也各
不相同, 陈图刚 [ 14] , 姜萌等 [ 15] 培养内皮祖细胞
VEGF的终浓度为 10 ng /mL, 陈文娜等 [ 16]用 5 ng /
mL VEGF, 为了快速诱导为成熟的内皮细胞, Bom

pais
[ 17]
, L i
[ 18 ]提高到 VEGF25, 50 ng /mL。在培养内
皮祖细胞之前,培养板往往要包被纤维连接蛋白,以
便细胞较容易的贴壁。用明胶包被培养板时有报
道, 其浓度所用各不相同,刘宗春 [ 19 ]和 Sm adja等 [ 20]
用 0. 2% 的明胶包被培养板, L i[ 18 ]用 1% 的明胶包
25
生物技术通报 B iotechnology  Bulletin 2010年第 2期
被培养板。Kobayashi等 [ 21]则用玻璃粘连蛋白包被
培养内皮祖细胞。无论是用纤维粘连蛋白还是明胶
包被培养板,起主要作用的都是帮助细胞贴壁,有利
于细胞快速贴壁生长。内皮细胞在体内是附着在平
滑肌上生长,将血液与平滑肌分开。纤维粘连蛋白
包被的培养板与机体内内皮细胞的生长环境相似,
更有利于其生长;明胶是一种无脂肪的高蛋白,溶水
后膨胀成球形, 也与内皮细胞体内生长环境相近。
所以两者均可用于内皮祖细胞的培养, 但据文献所
报道明胶的浓度各不相同, 1%以下的明胶均可以用
于细胞培养,高于 1%的明胶溶液成为胶冻状无法
用于包被培养板。
2 内皮祖细胞的表面标志及鉴定方法
内皮祖细胞的鉴定主要根据其细胞表面表达的
特异大分子蛋白和一些它所特有的功能来鉴定,现
将内皮祖细胞的细胞表面标志和其所特有的功能分
述如下。
2. 1 内皮组细胞表面鉴定的主要标志
2. 1. 1 CD133 CD133是一种 5次跨膜的细胞表
面分子, 分子质量为 120 kD, 它选择性地表达于骨
髓和外周血造血干细胞及内皮祖细胞表面, 由 Y in
等 1997年首次报道 [ 22]。曾命名为 AC133, 2000年,
在英国 Harrogate举行的第七界人类白细胞分化抗
原国际工作会议上, 正式命名为 CD133。 CD133抗
原可被 3种 CD133抗体识别,即克隆 AC133、293C3
和 AC141。 CD133能够识别人类造血干细胞的
CD34
+亚类,其可作为 CD34筛选人类造血干细胞
的的补充。在外周血中分离到的 CD133+细胞可在
体外诱导分化为内皮细胞, 同时 CD133表达阴性,
所以 CD133的表达是内皮祖细胞的一个标志, 也是
区分内皮祖细胞和成熟的内皮细胞的主要指标。
2. 1. 2 CD34 CD34(即细胞表面的唾液粘蛋白 )
是 ∃型跨膜糖蛋白, 其选择性的表达于早期造血干
细胞、造血祖细胞、胚胎纤维母细胞和血管内皮细胞
表面。 CD34被认为是造血干 /祖细胞的标志物,
L ink等 [ 23]报道骨髓和外周血来源的 CD34阳性细
胞群体中大部分显示出造血活性, N ieda等 [ 24]从脐
带血中分离出 CD34+细胞,用 rR I
2和肿瘤细胞条
件培养基在体外培养获得了内皮细胞, 表明 CD34
在内皮祖细胞中同样表达。虽然, 大多数研究者认
为内皮祖细胞为 CD34阳性,但已经有研究指出可
能存在 CD34阴性的内皮祖细胞亚群。Harraz[ 25 ]发
现 CD34阴性的内皮祖细胞在内皮条件体外培养中
能转化为内皮细胞,这个试验证实了上述观点。
2. 1. 3 KDR KDR又称 VEGFR
2, 是一种络氨酸
激酶受体,在体内分布于成熟内皮细胞和内皮祖细
胞膜上。H irash ima等 [ 26]观察到, 来源于胚胎干细
胞的 KDR +细胞最初不具有内皮细胞的其余标志,
它们在体外不需要外源细胞因子即可经 VE
钙黏蛋
白 + /PECAM
1+ /CD34-阶段到 VE
钙黏蛋白 + /PE

CAM
1+ /CD34+阶段分化为内皮细胞, 认为该细胞
为内皮前体细胞, 即内皮祖细胞。另外, 文献报
道 [ 27, 28] , VEGF通过刺激 KDR介导了内皮细胞增
值, 管腔形成, 内皮细胞存活, 内皮细胞移行和血管
通透性增加等重要活动。
2. 2 内皮祖细胞的鉴定
各时期的内皮祖细胞在外形上各不同,内皮祖
细胞刚刚贴壁时成卵圆形,逐渐生长变为纺锤形、梭
形, 即 early EPCs; 随着内皮祖细胞的分化, 长成铺
路石样,即 late EPCs。内皮祖细胞在生长时具有特
征性生长结构:血岛样细胞团和线性生长。血岛样细
胞团指细胞团中央是圆形的细胞生长,而四周的是纺
锤形和梭形的细胞围绕生长。原始的血岛出现在胚
胎时期的卵黄囊,主要是内皮细胞团和红细胞团。线
性生长指内皮祖细胞在体外培养时仍具有成血管性,
细胞在培养板上可出现首尾相接的条线状结构。
根据细胞形态无法准确的确定内皮祖细胞,细胞
表面标志鉴定成为鉴定的重要手段之一。CD34+ /
CD133
+
/KDR
+ 是目前鉴定内皮祖细胞的主要标
志, 可以从骨髓中众多干细胞和成熟的内皮细胞区
分出来, 不表达 vWF和 VE
cadherin[ 29]。随着内皮
祖细胞的培养,逐渐分化成熟,内皮细胞的标志表现
出来, vWF和 VE
cadherin表达率升高, CD133表达
下降,当细胞完全分化为成熟的内皮细胞, CD133表
达阴性。由于内皮祖细胞和内皮细胞的表面标志十
分相似,很难区分处以上两种细胞, CD133在区分两
种细胞时突出了重要作用。
内皮祖细胞的鉴定除表面标志鉴定外,可根据
内皮细胞所特有的功能和结构来鉴定内皮祖细胞。
内皮祖细胞具有吞噬 D il标记乙酰化低密度脂蛋白
26
2010年第 2期 白春雨等:内皮祖细胞的分离培养与鉴定
( D il
ac
LDL)和 FITC 标记棘豆凝集素 1 ( FITC

UEA
1)的功能, 当内皮祖细胞吞噬了 D il
ac
LDL
后,在激光共聚焦显微镜下可见红色荧光;当内皮祖
细胞吞噬了 FITC
UEA
1后, 可见绿色荧光。正在
分化的内皮祖细胞即可吞噬 D il
ac
LDL又可吞噬
FITC
UEA
1,在激光共聚焦显微镜下表现为黄色的
荧光 [ 30, 31] ,成为鉴定内皮祖细胞的又一种方法。在
区别内皮祖细胞和成熟的内皮细胞时, 通过特定的
结构和功能也可反映出细胞所处的时期, 成熟的内
皮细胞胞浆内有少量核蛋白体、粗面内质网,胞浆中
可见一种短棒状小体, 含平行管状的内部结构, 即
W eibel
Pa lade小体,是内皮细胞特征性的单层质膜
包裹的结构; 成熟的内皮细胞在功能上可以释放
NO,所以通过 RT
PCR扩增并电泳后, 鉴定细胞内
eNOS基因的表达,也是区别成熟的内皮细胞和其前
体细胞的一种方法。
3 小结与展望
内皮祖细胞是血管组织工程的种子细胞, 它的
出现大大克服了成熟内皮细胞扩增能力和细胞活力
不足的限制。但内皮祖细胞的数量有限, 纯化困难,
体外培养周期短,鉴定困难,易分化为成熟的内皮细
胞等缺点限制了内皮祖细胞在临床上的应用。寻找
一种新的体外培养方法, 使内皮祖细胞培养周期延
长,不易分化,解决这个问题成为当前的首要任务,
当这个问题被解决,其将迅速发展应用于临床,参与
治疗心血管系统疾病、各种组织损伤等疾病为人类
医疗做出贡献。
参 考 文 献
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