全 文 ：研究报告
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2010年第 5期
三株甜瓜拮抗细菌的筛选与鉴定
路晓萌 姚良同 赵丽明 杜秉海 丁延芹
(山东农业大学生命科学学院 农业微生物学重点实验室,泰安 271018)
摘 要: 以甜瓜根腐病病原菌 (Fusar ium solani)为指示菌, 从甜瓜根际筛选到两株具有明显拮抗效果的细菌, 编号为
F22, T5b。以甜瓜霜霉病病原菌 (P seudop eronosp ora cubensis )为指示菌,从甜瓜健康叶际中筛选出一株具有拮抗效果的细菌,记
为 B11b。经过形态学观察、生理生化测定, 16S rDNA序列及系统发育分析, 初步鉴定 T5b为芽孢杆菌属 (Bacillus sp. ), F22,
B11b为斯式假单胞菌 (P seudomonas stutzeri)。T5b, F22, B11b的 16S rDNA序列的 GenBank登录号分别为 EU771077, EU771075,
EU771074。
关键词: 根腐病 霜霉病 拮抗菌 根际 叶际
Screening and Identification of three Antagonistic Bacteria fromM elon
Lu X iaom eng Yao L iangtong Zhao L im ing Du B inghai D ing Yanq in
(College of L ife Sciences, K ey Laboratory of AgriculturalM icrob iology, Shandong Agricultural University, T ai an 271018)
Abstrac:t W ith Fusar ium so lani as indicator, tw o antagonistic bacteria w ere screened from the rh izosphere o f m e lon and w ere
nam ed as F22, T5b, respectively. W hen P seudop eronosp ora cubensis as indicator, one antagonistic bacte rium was screened from the phy l
losphere of m elon and w as nam ed as B11b. Based on the results ofm orpho log ic cha racte ristics, phys io log ical and b iochem ical prope rties
and phy logene tic ana lysis of 16S rDNA, T5b was identified asB acillus sp. , F22 and B11b we re iden tified as P seudomonas s tutzeri. The
sequences of 16S rDNA obta ined in th is study have been subm itted to GenBank w ith access ion numbers as fo llow, T5b as EU771077,
F22 as EU771075, and B11b as EU771074, respec tive ly.
Key words: Fusarium solani P seudop eronosp ora cubensis Antagonistic bacteria Rhizosphere Phy llosphere
收稿日期: 20091207
基金项目:山东省优秀中青年科研奖励基金 ( 2006BS06012)
作者简介:路晓萌,在读硕士,研究方向为分子微生物学; Em ai:l luxiaom engsdau@ 126. com
通讯作者:丁延芹,副教授,主要从事环境微生物学的研究; Em ai:l d ingyq6885@ 163. com
甜瓜 ( Cucum ism elo L. var. sacchanus N aud. )属
葫芦科黄瓜属, 具有很高的经济价值。随着甜瓜大
面积集中种植,病害的发生和危害逐日严重,影响了
甜瓜的产量和品质。根腐病和霜霉病是两种主要的
甜瓜侵染性病害。根腐病是甜瓜的常见病, 多发生
在土壤较黏重的地区, 以分苗或定植后缓苗前危害
严重, 其病原菌为瓜类腐皮镰孢菌 [Fusarium solani
(M art. ) App. etW ollenw. f. cucurbitae Snyder etH an
sen ] ,属真菌半知菌亚门 [ 1 ]。甜瓜霜霉病主要在发
育中后期侵害叶片, 特别是成熟期的甜瓜最易感
染 [ 2]。其病原菌为古巴假霜霉菌 [P seudoperonosp ora
cubensis)B erk. et Curt. )Rostov ],属真菌鞭毛菌亚门。
当前从抗病育种,化学防治和农业措施等方面
做了大量工作,初见防病效果,但筛选抗病品种周期
长, 使用化学农药会带来环境污染和诱导植株产生
抗药性。开发利用新的生防菌被认为是最具发展潜
力的防治方法之一。
本研究从甜瓜根际筛选到两株根腐病拮抗菌,
从叶际筛选到一株霜霉病拮抗菌, 其中关于斯式假
单胞菌 (P seudom onas stutzeri)作为根腐病和霜霉病
拮抗菌的报道尚属首次。
生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2010年第 5期
1 材料与方法
11 材料
根腐病植株,霜霉病植株, 健康植株,及相应的
根际土壤和叶片于 2007年 3月取自济宁。
12 培养基及主要试剂
细菌分离用牛肉膏蛋白胨固体培养基 ( NA ) ,
病原菌培养和拮抗菌筛选用 PDA固体培养基, 细菌
培养用 LB培养基。分子生物学试剂购于 TaKaR a
公司, 试剂配制方法参考文献 [ 3]。
13 病原菌分离及纯化
取根腐病植株, 将发病根部剪碎 ( 1 cm左右 ) ,
先用无菌水漂洗, 以去除表面灰尘浮土; 然后浸入
75%的乙醇溶液消毒 30- 60 s;再用无菌水漂洗数
次,洗去表面残留乙醇。待水分晾干后,用消毒的解
剖刀切取黄豆大小病变组织,置于 PDA平板培养基
上, 28! 培养, 待真菌菌落长出, 观察菌落特征及显
微观察真菌孢子形态,参考文献 [ 4- 7], 不断纯化,
得到根腐病病原菌。
取霜霉病植株直接用无菌镊子夹取发病叶片上
的孢子,置于 PDA平板培养基上, 28! 培养,待真菌
菌落长出,观察菌落特征及显微观察真菌孢子形态,
不断纯化,得到霜霉病病原菌。
14 拮抗细菌的筛选
通过梯度稀释法,从甜瓜根际土样,以及健康叶
子中分别分离细菌, 并采用传统的平板对峙方法与
相应的病原真菌进行拮抗试验;分别筛选出对甜瓜
根腐病及霜霉病具拮抗能力的细菌, 记录其编号,并
分别转接到 LB斜面上保存备用。
15 形态特征及生理生化特征测定
依照文献 [ 8- 10]方法, 对其菌落形态, 菌体细
胞形态及部分生理生化性状进行测定。
16 DNA提取和 PCR反应
基因组 DNA的提取方法参阅文献 [ 11]。 PCR
反应体系 ( 25 L)为 Taq酶 ( 5 U /L) 05 L, 10 ∀
Buffer(M g
2+
) 25 L, dNTPs( 10 mmo l/L each) 05
L, 引物各 1 L, 模板 1 L, Depc H 2O 185 L。
采用通用引物 P1 /P6 (正向引物: 5#AGAGTTT
GATCCTGGTCAGAACGAACGCT3#; 反向引物: 5#
TACGGGTACCTTGTTACGACTTCACCCC3 ) 进 行
16S rDNA 的 PCR 扩增 [ 12, 13]。 PCR 反应条件为
95! 5m in, 94! 变性 1m in, 56! 退火 1m in, 72! 延
伸 15 m in, 共 30个循环, 72 ! 延伸 10 m in。 PCR
产物用 1%的琼脂糖凝胶电泳检测, 溴化乙锭染色
后, 在 UVP紫外凝胶成像系统上观察照相。
目的片段用申能博彩 DNA小量快速纯化试剂
盒 ( 3S Sp in Agarose Ge l DNA purifica tion kit)回收
纯化, 经 pMD18T V ecto r(购自宝生物大连有限公
司 )连接,转化大肠杆菌 ( E scherichia coli) DH5感
受态细胞,挑取阳性克隆 PCR验证后, 送样测序。
17 16S rDNA序列测定及分析
测序工作由上海英骏生物技术有限公司完成。
测序结果用 NCBI数据库中的 BLAST进行相似性
分析, 采用 DNAMAN60程序进行多序列同源性
分析。使用 MEGA40 ( mo lecular evo lu tionary ge
netics ana lysis so ftw are version 40)程序包, 构建 In
terior branch test o f phy logeny中的 N eighborJo in ing
T ree,进化距离采用 JukesCantor算法, 系统树各分
枝的置信度经重抽样法 ( Bootstrap) 1 000次重复
检测。
2 结果与分析
21 甜瓜根际根腐病拮抗细菌的筛选
梯度稀释法从甜瓜健康根际土样中分离出
137株细菌。通过对峙试验, 共筛选出两株具有良
好拮抗效果的细菌, 记为 F22, T5b(图 1)。从甜瓜
健康叶片中分离出 37株细菌。通过对峙试验, 筛
选到一株具有良好拮抗效果的细菌, 记为 B11b
(图 2)。
图 1 拮抗菌对甜瓜根腐病病原菌的拮抗作用
22 拮抗菌的菌落特征及菌体形态
F22在 LB平板上培养 24 h后呈圆形半透明,表
面光滑。菌体细胞大小为 ( 05- 10) m ∀ ( 15 -
50)m。不产芽孢, G- ,细胞短杆状。T5b在 LB平
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2010年第 5期 路晓萌等:三株甜瓜拮抗细菌的筛选与鉴定
板上培养 24 h后呈乳白色,边缘环状突起, 中心褶
皱,不透明,有粘性。菌体细胞大小为 ( 05- 25) m
∀ ( 12- 10) m。产芽孢, G + , 细胞直杆状。B11b
在 LB平板上培养 24 h后呈乳白色, 半透明,表面光
滑。菌体细胞大小为 ( 05- 10) m ∀ ( 15- 50)
m。不产芽孢, G- , 细胞短杆状。三株菌菌体形态
如图 3所示。
图 2 拮抗菌对甜瓜霜霉病病原菌的拮抗作用
图 3 三株拮抗细菌的菌体形态 ( 400 ∀ )
23 拮抗菌的生理生化特征
B11b, F22, T5b的主要生理生化特征见表 1。
B11b, F22与 P seudomonas stutzeri的模式种生理生化
指标上具有相同的特征, 但 B11b, F22这两株菌在
葡萄糖产气,乳糖, 麦芽糖, 柠檬酸盐利用指标上存
在差异; T5b与 Bacillus subtilis的模式种在大多数生
理生化指标上具有相同的特征, 但在木糖, 阿拉伯
糖,硝酸盐还原指标上存在差异。原因可能是不同
菌株间确实存在差异, 也可能是生长环境影响了菌
的生理特征。
表 1 三株菌与模式菌生理生化特征比较
特征 P seudom ona s
stu tzeri
B11b F22
Ba cillu s
subtilis
T5b
葡萄糖产酸 + + + + +
葡萄糖产气 - + - -
蔗糖 - - +
乳糖 + - +
麦芽糖 + - -
木糖 ND ND + -
阿拉伯糖 - - + -
果糖 d + + ND
3酮基乳糖 - - -
甘露醇 ND ND + +
柠檬酸盐利用 - + + +
硝酸盐还原 + + + -
反硝化 + + + ND
硫酸盐还原 ND ND -
M. R (甲基红 ) - - -
V. P测定 - - + +
H 2 S - - -
运动性 + + +
生长需 2% NaC l ND ND + +
10% NaC l + + +
淀粉水解 + + + + +
牛奶分解 还原胨化
还原
胨化
产酸
胨化
明胶液化 - - - + +
吲哚 - - - -
接触酶 + + + + +
脂酶 ( Tw een80) + + + +
卵磷脂酶 + + - -
脲酶 + + +
苯丙氨酸脱氨酶 - - - -
氧化酶 + + + -
+ .阳性; - .阴性; d. 11% - 89%菌株为阳性; ND.未测定; V.菌株间
不稳定的反应
24 16S rDNA序列分析
16S rDNA纯化产物的 1%琼脂糖凝胶电泳见
图 4。将 T5b, F22, B11b的 16S rDNA 序列提交
GenBank,所得收录号分别为 EU 771077, EU771075,
EU771074。系统进化树构建结果见图 5。
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生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2010年第 5期
1. B11b; 2. F22; 3. T5b; M . DL2000
图 4 16S rDNA扩增产物电泳图
如图 5所示, B11b, F22与 P seudomonas stutzeri同
处于一个最小的分支,进化距离最接近,其 16S rDNA
序列与 P seudomonas stutzeri ( AY647159)的相似性达
99%。将 B11b, F22鉴定为斯式假单胞菌 (P seudo
monas stutzeri); T5b与 B. amy loliquefaciens( GU125644),
B. subtilis (DQ444283), B. velezensis( AB244441), B. li
cheniform is( FJ713021)都处在一个最小的分支上,其
16S rDNA序列与 Bacillus sp. ( EU359775)的相似性达
99%,综合前面生理生化指标考虑,将 T5b初步鉴定为
芽孢杆菌属 (Bacillus sp. )。
图 5 基于 16S rDNA的系统发育树
3 讨论
本研究从甜瓜根际样品中分离得到 137株分离
物,通过对峙根腐病病原菌 (Fusarium so lani) , 筛选
到两株细菌 F22, T5b具有较好拮抗效果。从甜瓜
健康叶际中分离得到 37株分离物,通过对峙霜霉病
病原菌 (P seudop eronospora cubensis ), 筛选到一株细
菌 B11b具有较好拮抗效果。通过对其进行形态学
观察、生理生化测定, 16S rDNA序列及系统发育分
析,初步鉴定 T5b为芽孢杆菌属 (Bacillus sp. ), F22,
B11b为斯式假单胞菌 (P seudomonas stutzeri) [ 14]。
资料表明,植物根际细菌是筛选 PGPR的重要
资源库。现报道较多的是假单胞菌属和芽孢杆菌属
具有防病促生的能力 [ 15, 16]。本研究基于甜瓜根腐
病和霜霉病筛选到的拮抗菌, 应用于甜瓜的生物防
治, 在生产中应该具有易定殖的优势,同时对于农业
生防用菌贮备了菌种资源。
固氮斯氏假单胞菌 (P. stutzeri ), 原名固氮粪产
碱菌,可作为联合固氮菌,水稻、小麦、玉米等作物以
及各种蔬菜的根际广泛分布着联合固氮菌, 它作为
一种潜在的生物肥源具有固氮和分泌植物激素等诸
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2010年第 5期 路晓萌等:三株甜瓜拮抗细菌的筛选与鉴定
多重要的生物学特性 [ 17, 18]。本研究筛选到斯式假
单胞菌 F22, B11b作为根腐病和霜霉病拮抗菌, 据
作者所查阅文献,国内外未有报道,其抑菌机理和抗
菌物质的确定还有待于深入研究。
参 考 文 献
[ 1] 李金玉,李冠.甜瓜抗病基因同源序列的克隆与序列分析 [ D ] .
乌鲁木齐:新疆大学, 2006, 2223.
[ 2] M cDow ell JM, Cuz ick A. Dow ny m ildew (P eron ospora parasitica ) re
s is tan ce gen es in A rabid op sis vary in fun ct ional requ irem ents for
NDR1, EDS1, NPR1, and salicyl ic acid accum ulation. P lant Journa,l
2000, 523529.
[ 3] 萨姆布鲁克 J,拉塞尔 DW.分子克隆实验指南 (第 3版 ) [M ] .北
京:科学出版社, 2002, 15641594.
[ 4] 魏景超,真菌鉴定手册 [M ] .上海:上海科学技术出版社, 1979.
[ 5] 许志刚,普通植物病理学 [M ] .北京:中国农业出版社, 2006.
[ 6] 方中达, 植病研究方法 [ M ] . 北京: 中国农业出版社, 2004,
249253.
[ 7] 谢大森,何晓明,彭庆务.瓜类疫病病原物研究进展.农业科技通
讯, 2009, 3: 7375.
[ 8] Garrity GM, B ell JA, L ilbu rn TG. Taxonom ic ou tl ine of the pro
karyotes bergey s manu al of system atic bacteriology( 2nd ed ) . Ber
lin: Sp ringerverlag, 2004.
[ 9] 东秀珠,蔡妙英,等.常见细菌系统鉴定手册 [M ] .北京:科学出
版社, 1996.
[ 10] 郭俊涛. 微生物的鉴别与图谱 [ M ] . 北京: 人民卫生出版
社, 2007.
[ 11] 奥斯伯 F,布伦特 R,金思特 RE,等.精编分子生物学实验指南
[M ].北京:科学出版社, 1998.
[ 12] Gurtler V, Stan isich VA. New app roaches to typing and ident ifica
tion of bacteria us ing the 16S23S rDNA sp acer region. M icrob iolo
gy, 1996, 142: 316.
[ 13 ] W eissburg WG, Barns SM16S ribosom al DNA am p lification for
phylogenetic study. Jou rnal of Bacteria,l 1991, 173: 697703.
[ 14] Chun J, Lee JH, Jung Y, et a.l E zTaxon: a w ebbased tool for the i
d ent if icat ion of prokaryotes based on 16S ribosom al RNA gene se
quen ces. In tern at ion al Journal of System atic and E volut ionary M i
crob iology, 2007, 57: 22592261.
[ 15] H aas D, Defago G. B io log ical con trol of soilborne pathogens by
P seudom onas f luorescent. N ature R eview s M icrob iology, 2005, 3:
307319.
[ 16] 何延静,刘海明,张雪洪,等.一株拮抗辣椒疫霉的假单胞菌的
分离与鉴定.微生物学报, 2006, 8: 516521.
[ 17] 李红权,杨静,林敏,等.固氮斯氏假单胞菌四碳二羧酸转运调
控基因 d ctB的功能研究.高技术通讯, 2005, 15( 8 ) : 6771.
[ 18] 闫春玲,张保明,林敏.斯式假单胞菌高效固氮工程菌株的构建及
其与高光合水稻互作的研究 [ D].北京:中国农业科学院, 2003.
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