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研究报告

生物技术通报
BIOTECHNOLOGY
BULLETIN 2010年第 12期
四株抗荔枝病原菌的芽孢杆菌的分离鉴定
黄庶识 1, 3
黄曦1, 2
许兰兰 1, 3
张荣灿 4
许铭本 4
黄荣韶2
( 1广西科学院生物物理实验室,南宁 530007; 2广西大学农学院,南宁 530007; 3昆明理工大学
生物工程技术研究中心,昆明 650224; 4广西科学院海洋环境监测中心,南宁 530007)


摘
要:
荔枝果树根际土壤中筛选出 4株芽孢杆菌 OR
1、OR
2、OR
3、ON
6,都显示出抗荔枝病原菌的活性。采取对该
菌株形态特征、培养特征、生理生化特征和遗传特性进行研究的方法,结果表明菌株与枯草芽孢杆菌 (Bacillus subtilis)的特征
一致; 将 4菌株的 16S rDNA序列在 GenBank中进行序列比对,结果亦显示其与 Bacillus sub tilis的 16S rDNA的序列片段的相
似性均达 99%以上;以相似性为基础构建系统进化树,分析表明菌株与 Bacillus sub tilis同源关系最近。最终得出结论为菌株
OR
1、OR
2、OR
3、ON
6为枯草芽孢杆菌。
关键词:
枯草芽孢杆菌
荔枝病原菌
分离鉴定
16S rDNA测序
Isolation and Identification of FourBacillus Strainsw ith Antagonistic
Ability Against Litchi Pathogenic Fungi
Huang Shushi
1, 3
Huang X i1, 2
Xu Lanlan1, 3
Zhang Rongcan4
XuM ingben
4
Huang Rongshao2
(
1
B iophy sics Laboratory, Guangx iA cademy of Sciences, N anning 530007;
2
AgricultureA cademy of Guangxi University, N anning 530007;
3
B iotechnology R esearch C enter, Kunming University of Science and Technology, Kunm ing 650224;
4
Marine
EnviromentM onitoring Center, Guangx iA cademy of Sciences, N anning 530007)


Abstrac:t
Four stra ins ofB acillus OR
1, OR
2, OR
3, ON
6, we re iso lated from rhizosphere so il of litch,i a ll o f wh ich show ed
the inh ibitory activ ity o f aga inst litch i pathogens fung.i The investiga tion o f the ir form a,l cu ltura l and phys io log ical character istics ind i

ca ted that they had the same characteristic w ith Bacillus sub tilis. Com par is on o f the ir 16S rDNA sequence w ith the data in GenBank,
show ed the sim ilarity of 99% ormo re be tw een the four strains and Bacillus subtilis. Phy log enetic tree based on the sim ila rityw as estab

lished and confirm ed that the fou r stra in had the c losest re la tionsh ip w ith Bacillus subtilis. F ina lly, the strain OR
1, OR
2, OR
3, ON
6
w ere identified to beBacillus sub tilis.
Key words:
Bacillus subtilis
L itch i pathogens fung i
Iso lation and identifica tion
Analyzing 16S rDNA sequence
收稿日期: 2010
05
24
基金项目:国家自然科学基金项目 ( 30860010) ,广西科学基金项目 (桂科回 0832006 ),广西科研院所基本科研业务费资助项目 ( 08YJ16WL01)
作者简介:黄庶识,男,硕士,副研究员,主要从事应用微生物研究; E
m ai:l hshu sh@i yahoo. com. cn
通讯作者:黄荣韶,教授, E
m ai:l h rshao802@ 163. com
荔枝 ( Litchi chinensis Sonn. ) 是著名的亚热带
水果和重要的亚热带经济作物,但由于其成熟季节
在盛夏,不耐贮藏。据在广西进行从采后到零售环
节的调查显示, 鲜果腐烂损耗高达 20% - 40% ,造
成了采后鲜果大量腐烂损耗。我国荔枝采后主要贮
运病害是由荔枝霜疫霉菌 ( P enorophy thora litchi
Chen ex ko et al)引起的霜疫霉病、由白地霉 ( G eot

riehum cadidum Link)引起的酸腐病、由炭疽菌 ( Col

letrichum gloeosporiodes Penz)引起的炭疽病 [ 1]。现阶
段对各种荔枝病害的防治很大程度上依赖于化学农
药的使用, 由此带来的环境污染、农药残留等诸多
问题已引起人们广泛关注。较之对病虫害的化学防
治, 更可行的防治途径是选择抗病品种或进行生物
防治。筛选有拮抗作用的有益微生物,从中提取相
关抗菌化学物质 (抑制剂 ), 抑制或灭杀水果致病的
病原微生物,延缓果实有机物的水解,达到延长果实
生物技术通报 B iotechnology
Bulletin 2010年第 12期
贮藏期和保鲜的目的, 是解决荔枝采后烂果问题的
一种有效和安全的方法。
本研究从荔枝枝叶、根际土壤及北部湾海域海
泥中筛选、分离芽孢杆菌菌株 67株, 通过平皿体外
试验筛选得到了 4株对荔枝霜疫霉和炭疽菌具有较
强抑制作用的拮抗菌。本试验对这 4株芽孢杆菌进
行形态及生理生化特征分析,并进行了分子生物学
的研究和鉴定,同时对荔枝霜疫霉和炭疽菌进行了
拮抗试验,初步确定了 4株芽孢杆菌的抗病能力,以
期为进一步研究和应用提供理论依据。
1
材料与方法
1
1
材料
1
1
1
荔枝果树枝叶及根际土壤
荔枝果树枝叶
样品: 选取正常生长的多年荔枝果树随机剪取新鲜
枝条, 用湿纱布包好, 记录, 放入通风的箱子。当天
采当天分离。荔枝果树根际土壤样品: 用取土铲挖
取表土以下 10 cm的干土壤 30 g,装进用已消毒的
牛皮信封, 封口,编号。采样地点: 广西大学农学院
实验果园。
1
1
2
海泥样品
分别采集位于钦州沙井港、防城
港附近海域近海 30 km以及红树林下的海泥样品。
样品放于无菌塑料袋中, 当天将样品带回实验室即
进行菌种分离。
1
1
3
病原真菌
荔枝霜疫霉菌株 ( P eronophy tho

ra litchii) ,荔枝炭疽病菌株 (Colletotrichum g loeospo

rioides Penz. )由华南农业大学环资学院提供。
1
1
4
培养基
NB培养基 (每升含量 ) : 牛肉膏
3
0 g,蛋白胨 10
0 g, NaC l 5
0 g、葡萄糖 1
0 g,水
1 000 mL, pH7
4。
NA培养基 (每升含量 ) :牛肉膏 3 g,蛋白胨 10
g, N aC l 5 g,葡萄糖 1
0g,琼脂粉 15 g,水 1 000mL,
pH7
4。
PDA培养基 (每升含量 ) :马铃薯 200 g,葡萄糖
20 g,琼脂 15 g,水 1 000mL, pH 7
0- 7
2。
1
2
细菌的分离和拮抗菌株的筛选
1
2
1
枝叶内生菌的分离和纯化
每个样品取 5
g, 用 50mL的 10mmol /L PBS冲洗 5次, 每次冲洗 5
m in,剪碎, 放入灭过菌的研钵中, 加少量 PBS液研
磨至糊状,加 PBS至 10mL,成微生物悬液。将微生
物悬液用 PBS稀释 1 000倍,取 0
2 mL涂于 NA培
养基平板上, 在 30
下培养 24- 48 h, 挑取菌落形
态差异明显的单菌落进入初筛。
1
2
2
果树根际土壤细菌的分离和纯化
在无菌
条件下,每个样品取 5 g加入到盛有 45mL无菌 PBS
缓冲液的三角瓶中, 振荡混匀,悬浮液于 80
下保
持 10m in。取 5mL悬浮液接入到装有 45mL NB培
养基的三角瓶内,于 30
富集培养 20 h。取富集培
养后的菌液,用 PBS稀释 1 000倍取 0
2mL涂布于
NA平板。 30
培养 24 h左右, 挑取菌落形态差异
明显的单菌落进入初筛。
1
2
3
海泥细菌的分离和纯化
方法参考 1
2
2。
1
2
4
拮抗菌的初筛和复筛
以荔枝炭疽病菌为
指示菌,采用 PDA平板对峙法 [ 2]。将菌株点接在距
平板中央 3 cm处的 4个角点上,平板中央同时移入
一直径 6 mm的荔枝炭疽病菌的琼脂块,置于 28

培养箱培养 3- 5 d,每个菌株 3次重复,选出对病原
菌生长有抑制作用的菌株进入复筛。复筛采用同样
的方法培养, 并测量抑菌圈半径


细菌菌落中心
至病原菌菌丝边缘,筛选出抑菌圈半径较大,被抑制
病原菌丝边缘平齐且拮抗作用持久的菌株。
1
3
拮抗菌株无菌发酵液对荔枝病原真菌的拮抗
性能测定
无菌发酵液的抑菌测试, 将筛选的拮抗细菌活
化后接种于 NB液体, 180 r /m in、30
振荡培养 7 d,
4
、9 000 r/m离心 15 m in,去除菌体, 0
22
m滤
膜抽滤,滤液即为拮抗菌无菌发酵液。
将 1mL无菌发酵液加入 9mL培养基中混匀后
制成平板, 取直径 6 mm 的荔枝病原菌菌块 ( 28

PDA平板培养 4 d)菌面朝下置于平板上, 28
恒温
培养 48 h,用十字交叉法测定抑菌圈直径。同时以
NB作对照。每处理设 3次重复计算抑菌率。抑制
率 (% ) = (对照真菌生长面积 -拮抗作用后真菌生
长面积 ) /对照真菌生长面积
100%。
1
4
拮抗芽孢杆菌的鉴定
1
4
1
菌体形态、培养特征观察及生理生化指标测
定
芽孢杆菌菌株的初步鉴定参照文献 [ 3, 4]的方
法进行。

1
4
2
16S rDNA基因序列测定及进化树构建
采
用细菌基因组 DNA提取试剂盒 ( T IANGEN) 提取细
菌基因组 DNA, 以基因组 DNA为模板, 采用细菌
218
2010年第 12期 黄庶识等: 四株抗荔枝病原菌的芽孢杆菌的分离鉴定
通用引物进行 PCR扩增。引物序列为 16SP: 5


AGAGTTTGATCCTGGCTCAG
3
; 16SF: 5

AAGGA

GGTGATCCAGCCGCA
3
。PCR反应程序: 94
预变
性 4 m in, 94
变性 1m in, 53
退火 1m in, 68
延伸
1
5m in, 40个循环后, 68
延伸 10m in。扩增产物
用 1
0%琼脂糖凝胶电泳分离。PCR产物纯化与序
列测定在北京三博志远生物技术有限责任公司进
行。将所得序列与 GenBank数据库中已有的细菌
16S rDNA序列进行相似性比较分析。以相似性为
基础利用 C luta lX V2
0、MEGA 4
1软件进行序列
比较、系统发育分析及进化树构建。
2
结果与分析
从 NA平板上选择性地挑出外观有明显差别且
长时间培养后都可以观察到芽孢形成的菌株 67个,
初筛出具有一定拮抗作用的菌株 26个。通过复筛,
得到 4株抑菌圈半径较大且抗性持久的菌株, 均来
自荔枝果树根际土壤, 其平均抑菌圈半径均达到
11
5 mm以上,命名为 OR
1、OR
2、OR
3和 ON
6。
2
1
拮抗菌株无菌发酵液对荔枝病原真菌的抑制
作用
结果 (表 1)表明, 不同细菌对病原菌抑制作用
表 1
细菌发酵液对荔枝霜疫霉和炭疽菌菌丝生长的影响
菌株编号
荔枝霜疫霉病菌
对照组菌饼
直径 ( cm )
发酵液组菌
饼直径 ( cm )
菌丝相对生长
抑制率 (% )
荔枝炭疽病菌
对照组菌饼
直径 ( cm )
发酵液组菌
饼直径 ( cm )
菌丝相对生长
抑制率 (% )
OR
1 4
9 2
1 82
9b 5
6 3
8 54
6b
OR
2 4
3 2
6 64
7 c 6
1 4
3 53
9b
OR
3 4
3 3
2 45
5d 5
8 4
6 37
5 c
ON
6 4
6 1
4 92
3a 5
8 3
2 70
3 a


相同字母表示差异不显著 (P > 0
05)
不同, 其中 ON
6菌株对荔枝霜疫霉的抑制效果最
好,抑制率分别达到 92%以上, 其次是 OR
1, 菌丝
生长抑制率为 82
9%。对荔枝炭疽菌抑制效果最
好的同样是 ON
6菌株, 抑制率为 70
3%。但总体
上这 4株细菌对荔枝炭疽菌的抑制效果低于荔枝霜
疫霉病原菌的抑制效果。
2
2
菌株的鉴定
2
2
1
形态特征和培养性状
各菌株细胞个体形
态观察和 NA平板培养 24 h后的菌落形态观察果见
表 2。
表 2
四菌株的形态特征和培养特征
特征 菌


株
OR
1 OR
2 OR
3 ON
6
菌落形态 黄褐色,圆形,粗糙,
边缘不整齐
灰黄色,近圆形,粗糙,
边缘不整齐
灰黄色,近圆形,粗糙,
边缘整齐
乳白色,近圆形,粗糙,
边缘不整齐
革兰氏染色 + + + +
菌体形态 链状杆菌 链状杆菌 链状杆菌 链状杆菌
运动性 + + + +
芽孢形状 卵形 椭圆形 椭圆形 椭圆形
可溶性色素 无 无 无 无
2
2
2
生理生化特性
4株芽孢杆菌的生理生化
特征见表 3。将表列出的试验结果, 对照
伯杰氏细
菌鉴定手册
, 得出其特性与枯草芽饱杆菌最为
接近。
219
生物技术通报 B iotechnology
Bulletin 2010年第 12期
表 3
菌株的的生理生化特征
特征 OR
1 OR
2 OR
3 ON
6
明胶液化 + + + +
淀粉水解 + + + +
接触酶 + + + +
氧化酶 + + + +
葡萄糖发酵 + + + +
最高耐盐性 (% ) 5 7 7 7
V
P测定 + + + +
甲基红试验 - - - -
50
生长 + + + +
硝酸盐还原 + + + +
葡萄糖 + + + +
果糖 + + + +
蔗糖 + + + +
2
2
3
16S rDNA序列分析
以 4个菌株的基因组
DNA为模板,用设计引物进行 PCR扩增,得到 4菌
株的 DNA片段,大小约 1 500 bp(图 1)。回收片段
进行测序,序列长度分别为 1 425 bp、1 423 bp、1 427
bp、1 422 bp。通过将测得的 16S rDNA序列与 Gen

Bank中的序列比较, 确定 ON
6、OR
3号菌株与枯
图 1
四菌株的 16S rDNA基因 PCR扩增结果
图 2
依据 16S rDNA基因序列构建的
四菌株的系统发育树
草芽孢杆菌的同源性为 100% , OR
1、OR
2号菌株与
枯草芽孢杆菌的同源性为 99%。以相似性为基础
选取 14株细菌构建系统发育进化树,结果如图 2所
示 , 海洋细菌 OR
1、OR
2、OR
3、ON
6与枯草芽孢
杆菌 EU 883786、GQ861458位于进化树的同一分支
上, 说明菌株与枯草芽孢杆菌 EU 883786、GQ 861458
的同源关系最近。依据
伯杰氏细菌鉴定手册
, 菌
株 OR
1、OR
2、OR
3、ON
6在形态特征和生理特征
上与枯草芽孢杆菌相似, 再根据 16S rDNA基因序
列比对结果和系统进化树的构建与分析, 将菌株
220
2010年第 12期 黄庶识等: 四株抗荔枝病原菌的芽孢杆菌的分离鉴定
OR
1、OR
2、OR
3、ON
6鉴定为枯草芽孢杆菌 (Ba

cillus subtilis )。
3
讨论
本研究中菌株 OR
1、OR
2、OR
3、ON
6是从荔
枝果树根际土壤中筛选得到的 4株生防细菌, 平板
对峙试验表明,这 4株生防菌对荔枝霜疫霉、炭疽菌
具有较强的拮抗作用。4株细菌的无菌发酵液的抗
菌试验也表明对荔枝病原菌有较强的拮抗作用,说
明菌株的代谢产物具有明显的抑制荔枝病原菌菌丝
生长的作用,其生防机制主要是分泌拮抗物质。根
据对 4菌株的形态学、生理生化试验结果,初步可以
断定为枯草芽孢杆菌。通过将测得的 16S rDNA序
列与 G enB ank中的序列比较,确定 ON
6、OR
3号菌
株与枯草芽孢杆菌的同源性为 100% , OR
1、OR
2
号菌株与枯草芽孢杆菌的同源性为 99%以上。基
于 16S rDNA序列分析进行细菌鉴定是国际上通用
的鉴定技术, 一般认为 16S rDNA序列同源性小于
98%,可以认为种不同,同源性小于 93% - 95% ,可
以认为属不同 [ 5]。根据这一结论, 4菌株与枯草芽
孢杆菌同源性高达 99%以上,故将 4菌株鉴定为枯
草芽孢杆菌。
尽管枯草芽孢杆菌防治果蔬病害的研究和应用
非常广泛,但在抗荔枝原菌的研究方面的文献报道
很少。蒋跃明等 [ 6]采用枯草芽孢杆菌培养液和多
抗霉素处理荔枝果实, 可以有效地防止由于荔枝霜
疫霉侵染引起的贮藏病害。南非 K orsten等 [ 7 ]从荔
枝树上分离得到了 3个很有前景的枯草芽孢杆菌
株,有效地抑制荔枝采后的致病菌。本研究中筛选
出的 4株枯草芽孢杆菌对荔枝病原菌有较强的拮抗
作用,具有良好的理论研究价值和应用前景。本研
究虽然对各菌株作了一些初步试验和鉴定, 并发现
它们具有作为生物农药的潜力, 但是对它们的抑菌
有效组分的分离、结构鉴定、发酵条件优化和安全性
试验等方面的研究工作还有待进一步深入研究。
参 考 文 献
[ 1] 王继栋,朱西儒,孙谷畴.荔枝采后病害与颉颃菌的应用.中国果
树, 2001( 6 ): 42
44.
[ 2] 纪明山,王英姿,程根武,等.西瓜枯萎病拮抗菌株筛选及田间防
效试验.中国生物防治, 2002, 18( 2) : 71
74.
[ 3] 戈登 RE,海恩斯 WC,帕格 CHN 著, 蔡妙英等译.芽孢杆菌属
[M ] .北京:农业出版社, 1983: 106
108.
[ 4] 东秀珠,蔡妙英. 常见细菌系统鉴定手册 [M ] .北京:科学出版
社, 2001: 59
63.
[ 5] Fry NK, W arw ick S, SaundersNA, et a.l The use of16S ribosom al
RNA an alyses to investigate th e phylogeny of the fam ily Leg ion ellace

ae. Journ al ofGen eralM icrob iology, 1991, 137: 1215
1222.
[ 6] 蒋跃明,陈芳,李月标,等.生物菌剂防治荔枝采后病害的初步研
究.果树科学, 1997, 14( 3) : 185
186.
[ 7 ] Korsten L, De V illiersEE, De Jager ES, et a.l B io log ical controlof
litch i fru it d iseases. Yearbook Sou thA frican Litch iGrow ers
A ssoci

at ion, 1993, 5: 36
40.
221