全 文 ：收稿日期:2007-05-08
基金项目:广西教育厅科研项目(编号200509216)资助
作者简介:周盛(1972-),男,壮族,硕士,讲师;从事环境生物技术及微生物分子学研究;zhousheng1234@.tom.com
甲烷利用细菌是一类以甲烷或甲醇为惟一碳源的微生物。甲烷利用细菌以甲烷为惟一碳源时能产生
一类甲烷单加氧酶(MMO)[1]。该酶分为可溶性甲烷单加氧酶(sMMO)和颗粒性甲烷单加氧酶(pMMO)[2]。甲
烷单加氧酶在环保上能降解三氯乙烯、苯胺、苯酚等有毒物质[3]。三氯乙烯(trichloroethylene,简称 TCE)在工
业上应用很广,是一种优良的溶剂,但是,TCE对人体、环境有较大的危害,是控制排放的有机有毒污染物[4]。
苯胺具致癌作用、致敏作用;苯胺可被皮肤吸收,具有刺激作用;苯胺还具有致突变性,一次给实验动物 1/
3≤D50剂量时,可出现较明显的致突变作用 [5]。苯酚是造纸、炼焦、炼油、塑料、农药和医药合成等行业生产
的原料或中间体,随着经济的发展,未经处理的含酚废水对人类的生存环境已经造成了严重的威胁[6]。
1 材料
1.1 土壤样品来源
用于分离菌株的土壤样品来源于广西玉林市广西玉林师范学院西校区池塘里的土壤。采样具体于广
西玉林市广西玉林师范学院西校区池塘里池塘四个角落水下 20cm,每个采样点各采取六份土壤,然后充
甲烷利用细菌HG06的筛选鉴定及其对三种有毒物质
降解的研究
周盛
(广西玉林师范学院,玉林 537000)
摘 要: 通过传统微生物学方法,从广西玉林市广西玉林师范学院西校区池塘里土壤中筛选到一株甲烷利用细
菌HG06,能以甲烷为惟一碳源和能源的无机培养基上生长。通过形态观察及16SrRNA编码序列同源性比较分析,该菌
株初步鉴定为甲基孢囊菌。同时对HG06菌株在不同温度、pH值的生长条件进行研究,初步确定了HG06的最适生长的
温度为32℃,最适pH值为7.0。TCE最高的耐受浓度为30mg/L;苯胺最高的耐受浓度为1500mg/L;苯酚最高的耐受浓
度为800mg/L。该菌在环保上有一定的应用价值。
关键词: 三氯乙烯 苯胺 苯酚 生物降解 甲烷利用细菌
SelectionandIdentificationofMethylobacterium HG06andthe
StudyingofItsThreePoisonThingDegradation
ZhouSheng
(GuangxiYulinNormalColege,Yulin537000)
Abstract: AstrainofMethylobacterium wasisolatedfrom thesoilofthesouthChinauniversityoftechnology
pondsoilatGuangzhoucitybytraditionalmicrobiologyway,whichcangrow withmethaneasthesolesourceof
carbonandenergy。Onthebasisofobservingofmodalityandtheanalysisofthe16SrDNA sequence,HG06was
identifiedasMythylosistisprimarily.TheoptimizegrowthtemperatureofHG06is32℃,pH at7.ThehighestofTCE
standingconcentrationis30mg/L,ThehighestofPhenolstandingconcentrationis800mg/L,ThehighestofAniline
standingconcentrationis1500mg/L.TheHG06shouldbeappliedintheenvironmentalprotecting.
Keywords: TCE PhenolAniline Biodegradation Methylobacterium
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN·研究报告· 2008年第1期
2008年第1期
图 1 HG06DNA扩增电泳图
分混匀,随后带回实验备用。
1.2培养基
1.2.1 LB培养基 胰蛋白胨(Oxoid)10g,酵母浸出粉(Difco)5g,NaCl5g,水 1L,pH7.0;LA(E.coli固体培养
基)LB+1.5%琼脂粉(国产)。
1.2.2 甲烷选择培养基 培养基组成(g/1000ml蒸馏水):NaNO32.0g、KH2PO41.0g、Na2HPO4·12H2O2.9g、
MgSO4·7H2O0.32g、FeSO4·7H2O0.014g、Ca(NO3)20.025g、CuSO4·5H2O0.004g、MnSO4·H2O3.0×10-4g、ZnSO4·
7H2O3.4×10-4g、Na2MoO4·2H2O2.4×10-4g、EDTA0.020gpH7.0,甲烷质量分数在 99%,培养体系内,甲烷:
氧气 =2∶1。
2 方法
2.1 培养条件
甲烷利用菌:液体培养,32℃摇床振荡培养(200r/min);平板培养,32℃恒温箱平板倒置培养。
2.2甲烷利用菌的筛选
取土壤样品 5g[溶于 H2O]后过滤,按 1%的接种量接种于甲烷富集培养基(CH4:O2=1:1)32℃,200r/min
摇床培养 5~7d。取 2ml混浊的培养液继代于同样的富集培养基中,再培养 5~7d。然后取 1ml培养液倍比稀
释,涂布于含甲醇培养基的梯度平板上,待菌液在超净工作台中放置风干后,32℃倒置培养 5~7d,选取培
养基上高浓度区域分散的单菌落,根据菌落大小、形状、表面光泽、隆起程度、透明程度、边缘形状和菌落颜
色的差别,最终挑选出 200个菌落,分别初步名命为 HG(01)至 HG(200),将其接种在甲醇培养基上,32℃
培养 2~3d,置于 4℃冰箱备用。主要筛选出一些能降解三氯乙烯、苯酚、苯胺类等一些污染物的甲烷利用细
菌(按已报道理论)。将初筛的 200株菌株分别接种于 10ml甲烷培养基中,32℃,200r/min摇床培养 5d,待
其生长至对数生长期(即菌液在波长 600nm处其 OD值为 0.8时),然后分别测其对三氯乙烯、苯酚、苯胺
降解程度。经对 200株初筛菌株进行复筛鉴定。筛选到一株对 TCE[三氯乙烯]、苯胺、苯酚均具较好降解能
力的甲烷利用细菌,该菌定名为 HG06,该菌的 16SrDNA鉴定,生长条件及其对三种有毒物质的降解祥细
如下。
2.3 甲烷利用菌的鉴定
2.3.1 甲烷利用菌 DNA的提取 取 1.5ml培养好的菌液,13000r/min离心 5min收集菌体,加入 400μl裂
解液(40mMTris-醋酸,20mM醋酸钠,1mMEDTA,1%SDS,pH7.8)混匀,置于 37℃水浴 2h;然后加入 200μl
(5M)的氯化钠溶液,混匀后于 13000r/min离心 15min,取上清液,用苯酚抽提 2次,氯仿抽提 1次;加两倍
体积无水乙醇,1/10体积醋酸钾(3M,pH8.0),-20℃保存 1h后,13000r/min离心 15min,弃上清液,沉淀物
用 70%乙醇洗 2次;置于室温干燥后,提取 HG06的总 DNA后,溶解在适当体积的 TE缓冲液中,置于冰箱
中备用。并通过 0.85%琼脂糖凝胶电泳检测提取的总 DNA的质量(图 1)。
2.3.2 甲烷利用菌 16SrDNA的扩增 16SrDNA引
物按文献[7]报道设计,该引物可以扩增供试菌株几
乎全部 16SrDNA序列,引物序列如下。
Primer1(F27):5′-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3′
Primer2(R1492):5′-TAGGGTTACCTTGTTACGACTT-3′
PCR扩增产物用1.0%的琼脂糖凝胶电脉、EB染
色后,紫外灯下切下 1.5kb的 PCR扩增产物(图 2),
用透析袋电洗脱法回收 1.5kb片段。
2.3.3 质粒 DNA的转化 依试剂盒说明书将回收
产物(1.5Kb16SrDNA片段)与载体 pGEM-T载体
图 2 HG0616SrDNA
PCR扩增电泳图
周盛:甲烷利用细菌HG06的筛选鉴定及其对三种有毒物质降解的研究
1.HindⅢ marker
2.HG06总 DNA 1.1kbmarker
2.16SrDNAPCR扩增产物
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生物技术通报Biotechnology Buletin 2008年第1期
连接,用电脉冲法转化大肠杆菌 DH5α,在加有 Amp(50μg/ml)、IPTG和 X-gal的 LB平板上选择白色转化
子,提取带有外源片段的转化子的质粒 DNA进行测序。
2.3.4 测序结果 HG06菌株的 16SrDNA序列。
2.4 HG06的生长条件
2.4.1 生长温度 将 HG06菌株先接种于
10ml甲烷培养基中,32℃,200r/min摇床培
养 5d,取 1ml菌液测其 OD600值,待其
OD600=0.8左右,再以 2%的接种量接入
100ml甲烷富集培养基中(甲烷:氧气=1:1),
在几个不同温度 (28℃、30℃、32℃、34℃)
下 200r/min摇床培养,每天测一次菌液的
OD600(图 3)。
2.4.2 生长 pH 将 HG06菌株先接种于 10ml甲烷培养基中,32℃,200r/min摇床培养 5～7d每天取 1ml菌
液测其 OD600值,待其 OD600=0.8时。再以 2%的接种量接入 5个不同 pH值(pH5、pH6、pH7、pH8、pH9),
100ml液体培养基的三角瓶中、200r/min摇床培养,每 2d测一次菌
液的 OD600浓度(图 4)。
2.5 甲烷利用细菌 HG06对 3种有毒物质降解的研究
2.5.1 TCE含量的测定 用气相色谱法检测该菌对三氯乙烯的降
解能力。色谱条件:进样器和 ECD温度为 200℃,柱温为 80℃,毛细
管色谱柱(25m×0.25mm,长×内径):固定液 SE-54。采用外标法测定
TCE浓度。将 10ml发酵液置于 20ml,universe瓶内置于-80℃冰箱
40min后迅速将其置 37℃水浴中解冻,如此 5～6次后离心(10000×g)
8min收集上清液置 4℃冰箱待用。TCE降解反应:取 1ml细胞裂解液置 10ml反应瓶中,按计算量加入 TCE
饱和的磷酸盐缓冲液(含 TCE950mg/L,GC定量)。用聚四氟乙烯衬硅橡胶瓶塞封口,在 32℃恒温水浴中
旋转反应,反应一定时间后加 2ml正已烷终止反应,轻微震摇,将反应液中剩余的 TCE全部萃取至正已烷
层中,取有机相分析 TCE浓度(图 5)。
2.5.2 苯胺的测定 用萘乙二胺偶氮光度法[8]定时测定细菌生长过程中苯胺的残存量,测定时先在 8000r/
min下离心 5min,以消除菌体对测定的干扰,测定上清液中苯胺含量。每一处理设 3个重复(图 6)。
图 3 HG06在不同温度下生长
图 4 不同 pH值下 HG06生长情况
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2008年第1期
2.5.3 HG06不同苯酚浓度的测定 根据4-氨基安替比啉法[9]。用改进的方法测定苯酚的含量:将培养液进行
10000r/min离心 10min后,取上清 100μl加入到 10ml的试管中,加蒸馏水到 5ml,加入 100μl0.5mol/L的
NHOH溶液,用pH6.8的磷酸缓冲液调pH到7.9左右,加50μl2%的4-
氨基安替比啉,混匀,再加入 50μl8%的铁氰化钾溶液,混匀,15min后,
在510nm处测吸光度(图7)。
3 结果与讨论
3.1 甲烷利用细菌的生长温度、pH
由图 3可以看出,HG06的生长速率随着温度的上升而上升,但
到 34℃时,生长速率开始下降。由此可以确定 HG06的最佳生长是
32℃。在菌体生长的第 3d到第 5d,菌体生长到达对数生长期。由图 4
可以看出,HG06能在 pH6~9之间生长。但培养基中 pH=10以后,其生长活性均受到抑止。HG06接种培养
2d的结果表明,HG06在 pH值 6～9范围内生长,可见该菌株具有较广的适应范围。在 pH值为 7的时候,
HG06的能更快的进入对数生长期,其最适 pH值为 7左右。
3.2 甲烷利用细菌的 16SrDNA
将测定的 HG06菌株的 16SrDNA序列用 blast软件与 Genebank中已报道的 16SrDNA序列进行同源
性比较发现,HG06的 16SrDNA序列与在 Genebank登记的甲基孢囊菌的 16SrDNA序列的同源性达到
98%以上,故 HG06被初步鉴定为甲基孢囊菌。
3.3 甲烷利用细菌对三氯乙烯、苯胺、苯酚的降解能力
由图 5可知 HG06菌体裂解液能在 5h(即 300min)内几乎完全把浓度为 30mg/L的三氯乙烯降解掉;由
图 6可知 HG06能在 32h内把浓度为 1000mg/L的苯酚完全降解掉;由图 7可知 HG06能在 20h内把浓度
为 1500mg/L的苯胺完全降解掉;能同时降解 3种有毒物质的微生物所见报道不多,特别是具较强的降解
能力的菌株。如通过生物强化技术,在经过特殊设计的生物反应器如流化床、暴气池等通入适当比例的甲
烷和氧气,提高该菌繁殖速度,在受三氯乙烯、苯胺和苯酚污染的环境里加入强化后的甲烷利用细菌,这无
疑对提高降解这些有毒污染物的速度起至关重要的作用。
参考 文献
1 沈润南,马清泉,等.生物化学杂志,1997,13(4):45~49.
2 陈勇生,常晓青,等.环境化学,1999,18(1):82~86.
3 陈劲春,李珊,等.北京化工大学学报.1999,(1):56~59.
4 隋红.农业环境科学学报,2004,23(1):170~173.
5 朱利中.环境科学,2000,21(2):28～31.
6 陈勇生,常晓青,等.环境化学,1999,18(1):82~86.
7 邢德峰.环境科学,2006,27(7):1424~1428.
8 杨晓梅.中国环境监测,2004,8(4):20~23.
9 韩伟.环境研究与监测,2006,9:32~34.
图 5 HG06不同 TCE浓度的降解曲线 图 6 HG06不同苯胺浓度的降解曲线
图 7 HG06不同苯酚浓度的降解曲线
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